疼痛是一个复杂的医学问题，涉及多种途径^[1]。迄今为止，已有许多药物被用于疼痛症状的临床治疗，如非甾体抗炎药、阿片类药物和抗抑郁药物，其中阿片类镇痛药是治疗中、重度疼痛最有效的药物。然而使用该类药物治疗严重或慢性疼痛会产生一系列副作用^[2]，且长期使用可能导致耐受性^[3]、成瘾性^[4]和依赖性^[2]。因此，高效、副作用小的镇痛药物的研发成为了研究的热点。

积雪草[Centella asiatica (L.) Urban]是一种多年生匍匐草本植物，气味微弱，属于伞形科积雪草属，通常生长在潮湿的草地或水沟边，其植株全草在临床上被用作治疗传染性肝炎、流行性脑脊髓炎、跌打损伤等^[5]。积雪草作为一味重要的彝药，还被广泛用于治疗普通感冒和头痛症状。羟基积雪草酸(MA，结构式见图1)作为积雪草的重要活性成分表现出了很好的生物活性，如：抗癌^[6]、抗糖尿病^[7]、抗炎^[8]等生物活性。因此，为了发掘积雪草中的有效镇痛活性成分，本研究通过醋酸诱导的小鼠扭体模型、热板法实验模型和福尔马林诱导的小鼠疼痛模型对从积雪草中分离得到的MA进行镇痛活性研究。同时还采用阿片受体阻断实验，辣椒素和谷氨酸诱导的小鼠舔爪实验，对其镇痛机制进行研究，为镇痛药物的研发和药理学研究提供参考依据。

Figure  1.  Chemical structure of madecassic acid(MA)

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1.   材　料

1.1   药品与试剂

积雪草于2018年9月采自云南省昆明市，经云南民族大学杨青松教授鉴定为积雪草[Centella asiatica (L.) Urban]，该植物标本（No. C.A.20180909）现存于云南民族大学民族医药学院标本室。从积雪草全草的乙醇提取物中分离得到MA。

冰醋酸（天津市致远化学试剂有限公司）；L-谷氨酸（上海韶远试剂有限公司）；盐酸纳洛酮（NAL，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；辣椒平（Capsz，上海麦克林生化科技股份有限公司）；阿司匹林（ASA）、辣椒素、福尔马林购自北京百灵威科技有限公司。

1.2   动　物

SPF级昆明小鼠，雌性，体重（20 ± 2） g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK (京) 2019-0008，饲养环境保持在（23 ± 3） °C，相对湿度40%~70%，每12小时明暗交替，饲养期间自由饮水进食，实验前12 h禁食不禁水。所有动物研究均遵循国际医学伦理规范并经云南民族大学动物伦理委员会批准。

1.3   仪　器

YLS-6B智能热板仪（上海精密仪器仪表有限公司）。

2.   方　法

2.1   醋酸诱导的小鼠疼痛模型

根据文献[9]报道方法，将50只雌性小鼠随机分为5个组，每组10只。各组小鼠分别以生理盐水（对照组），ASA（100 mg/kg，阳性对照组），低（10 mg/kg）、中（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）剂量的MA进行灌胃处理。在给药30 min后，腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2 mL。观察记录注射醋酸后15 min内小鼠出现的扭体反应的次数，扭体反应包括腹部内凹、躯干与后肢伸张和臀部高起。抑制率按以下公式计算：抑制率= （对照组扭体次数 – 给药组扭体次数）/对照组扭体次 × 100%。进行NAL（5 mg/kg）阻断实验时，需在灌胃给药前10 min进行腹腔注射NAL。

2.2   热板法致痛模型

根据文献[9]报道，筛选出基础痛阈值在5~30 s之间的雌性小鼠50只，并随机分为5组，每组10只。各组小鼠分别以生理盐水（对照组），ASA（100 mg/kg，阳性对照组），低（10 mg/kg）、中（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）剂量的MA进行灌胃处理。以小鼠舔后足反应的潜伏期为痛阈指标，在给药后的0、30、60、90和120 min，分别测定各组小鼠的痛阈值。

2.3   福尔马林诱导的小鼠疼痛模型

根据文献[9]报道，将雌性小鼠30只随机分为5组，每组6只。各组在注射福尔马林前1 h分别以生理盐水（对照组），ASA（100 mg/kg，阳性对照组），低（10 mg/kg）、中（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）剂量的MA进行灌胃处理。给药1 h后，右后爪足底表面注射2.5%福尔马林（20 μL）。记录注射福尔马林后0~5 min（Ⅰ阶段）和15~30 min（Ⅱ阶段）的舔爪时间。进行NAL（5 mg/kg）阻断实验时，需在灌胃给药前10 min进行腹腔注射NAL。

2.4   辣椒素诱导的小鼠舔爪实验

根据文献[10]报道，将雌性小鼠30只随机分为5组，每组6只。各组在注射辣椒素前1小时分别以生理盐水（对照组），Capsz （64 mg/kg，阳性对照组），低（10 mg/kg）、中（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）剂量的MA进行灌胃或腹腔注射处理。给药后1 h，在左后爪足底间隙注射辣椒素（20 μL, 每爪1.6 μmol），然后记录注射后0~5 min小鼠舔或咬注射辣椒素的爪子的时间。

2.5   谷氨酸诱导的小鼠舔爪实验

根据文献[10]报道，将雌性小鼠30只随机分为5组，每组6只。各组分别以生理盐水(对照组)，ASA(100 mg/kg，阳性对照组)，低(10 mg/kg)、中(20 mg/kg)、高(40 mg/kg)剂量的MA进行灌胃处理。给药后1 h，每只小鼠足底注射谷氨酸(20 μL, 每爪10 μmol)。在注射谷氨酸后，立即记录15 min内小鼠舔或咬注射谷氨酸的爪子的持续时间。

2.6   统计学分析

实验所有数据均采用均值±标准差（$ \bar{x} $ ± s）表示，利用GraphPad Prism 6.0软件应用单因素方差分析（One-Way ANOVA）或双因素重复方差分析（Two-Way repeated measure ANOVA）进行统计比较，其中NAL阻断实验数据采用非配对t检验进行统计比较，P < 0.05表示具有统计学意义。

3.   结　果

3.1   MA对小鼠扭体次数的影响

结果如图2所示，与对照组比较，ASA和MA均能显著减少醋酸所致的小鼠扭体次数（P < 0.05），且呈剂量依赖性。在40 mg/kg剂量下，MA表现出了很好的抑制活性，抑制率为70.8% （P < 0.001），明显高于ASA的抑制率（64.2%，P < 0.001）。注射NAL后，ASA和MA对小鼠扭体次数的抑制作用没有受到明显的影响，该结果表明阿片系统没有参与MA的镇痛作用。

Figure  2.  Effects of MA on writhing induced by injection of acetic acid in mice ($ \bar{x} $ ± s，n = 10)

ASA: Acetylsalicylic acid; NAL: Naloxone hydrochloride^** P < 0.01，^*** P < 0.001 vs control group, ns:P > 0.05

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3.2   MA对小鼠痛阈值的影响

结果如表1所示，与对照组比较，ASA在给药30、60、90 min时能有效的延长小鼠的痛阈值（P < 0.05）。在所有剂量下，MA均不能有效的延长小鼠的痛阈值（P > 0.05）。

Table  1.  Effects of MA on hot plate-induced nociception in mice ($ \bar{x} $ ± s，n = 10)

Group	Dose/ (mg/kg)	Interval following treatment
		0	30	60	90	120 min
		Latency time/s
Control	-	10.15 ± 2.56	11.01 ± 2.71	10.87 ± 1.64	9.92 ± 1.72	10.81 ± 2.68
Acetylsalicylic acid(ASA)	100	11.68 ± 2.26	16.71 ± 2.65**	17.08 ± 1.94**	15.16 ± 2.20*	12.61 ± 2.85
MA	10	11.31 ± 2.03	12.08 ± 2.91	12.26 ± 3.58	11.16 ± 2.89	12.21 ± 2.36
	20	13.37 ± 3.65	13.97 ± 4.02	12.76 ± 3.72	12.38 ± 2.97	11.84 ± 2.86
	40	10.68 ± 3.53	13.76 ± 2.93	12.83 ± 3.57	14.18 ± 4.02	13.23 ± 3.29
* P < 0.05，** P < 0.01 vs control group. Two-Way repeated measure ANOVA followed by Bonferroni’s multiple comparison test

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3.3   MA对福尔马林诱导小鼠舔爪的影响

如图3所示，与对照组相比，主要作用于外周神经系统发挥镇痛作用的ASA在福尔马林实验的Ⅰ阶段不能明显缩短小鼠的舔舐时间，而在Ⅱ阶段表现出显著的镇痛活性，抑制率为62.0% （P < 0.001）。与对照组相比，MA在福尔马林实验的Ⅰ阶段也不能有效缩短小鼠舔足时间。在Ⅱ阶段，与对照组相比，中、高剂量的MA均能有效的缩短小鼠舔足时间，抑制率分别为40.5% （P < 0.01）和61.9% （P < 0.001）。注射NAL后，ASA和MA在福尔马林实验各阶段对小鼠舔舐时间的抑制作用没有受到明显的影响，该结果进一步表明阿片系统没有参与MA的镇痛作用。

Figure  3.  Effect of MA on formalin-induced nociception in mice ($ \bar{x} $ ± s，n = 6)NAL:Naloxone hydrochloride

^** P < 0.01，^*** P < 0.001 vs control group; ns:P > 0.05

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3.4   MA对辣椒素诱导小鼠舔爪反应的影响

MA对辣椒素致小鼠舔足反应的影响，结果如图4所示。与对照组相比，Capsz（辣椒素拮抗剂）能有效的减轻辣椒素所引起的疼痛，抑制率为66.3% (P < 0.001)。中、高剂量的MA也能明显减轻由辣椒素所引起的疼痛，抑制率分别为29.5% (P < 0.05)和64.4% (P < 0.001)。

Figure  4.  Effect of MA on the capsaicin(Capsz)-induced paw licking response in mice ($ \bar{x} $ ± s，n = 6)

^* P < 0.05，^*** P < 0.001 vs control group

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3.5   MA对谷氨酸诱导小鼠舔爪的影响

如图5所示，与对照组比较，中、高剂量的MA能明显地缩减由谷氨酸所引起的舔爪时间，抑制率分别为30.9% (P < 0.01)和56.1% (P < 0.001)。ASA也能有效的抑制由谷氨酸所引起疼痛，抑制率为57.3% (P < 0.001)。

Figure  5.  Effect of MA on the glutamate-induced paw licking response in mice ($ \bar{x} $ ± s，n = 6)

^** P < 0.01，^*** P < 0.001 vs control group

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4.   讨　论

积雪草具有悠久的药用历史，其药理学活性包括抗抑郁、保护神经细胞、抗神经细胞凋亡、镇痛及改善记忆^[11]。然而关于积雪草提取物中有效镇痛成分及作用机制的研究却少有报道。MA作为积雪草的重要活性成分表现出了很好的生物活性。因此，为了探讨积雪草提取物中的有效镇痛成分及其作用机制，本研究通过醋酸诱导的小鼠扭体实验模型、热板法实验模型和福尔马林实验模型对从积雪草中分离得到的MA进行镇痛活性评价，进而对其镇痛机制进行探讨。

4.1   MA的镇痛活性研究

醋酸扭体实验被广泛地应用于具有外周镇痛活性化合物的镇痛活性评估^[10]。腹腔注射醋酸引起外周组织损伤，从而导致各种炎症介质和前列腺素的释放，使其腹部疼痛，进而产生扭体反应^[12]。本研究中MA能有效抑制醋酸所引起的疼痛，显示该化合物能在外周水平有效的缓解疼痛。其中MA表现出了比阳性药ASA更好的镇痛作用。该实验结果也暗示MA诱导外周镇痛的机制可能与作用于外周神经系统的药物类似，如非甾体抗炎药。

热板法实验模型是一个被广泛应用于具有中枢镇痛活性化合物的镇痛活性评估^[10]。实验结果显示，所有剂量下，MA均不能显著地延长小鼠的痛阈值，表明其不能作用于中枢神经系统发挥镇痛作用。

MA的镇痛活性还被福尔马林实验模型进一步的评估。在福尔马林实验的Ⅰ阶段，MA不能有效缩短小鼠舔足时间。在Ⅱ阶段，中、高剂量的MA均能有效地缩短小鼠舔足时间。福尔马林实验通常被用于验证新药或天然衍生化合物参与外周和中枢镇痛活动。在足底注射福尔马林后，小鼠会立即产生异常的重复舔或咬注射的爪子行为，该行为可在两个阶段中观察到。由于福尔马林直接激活伤害感受器，持续约5 min^[13]，Ⅰ阶段(非炎性/神经元性)在给药后立即发生。由于缓激肽、前列腺素和组胺的释放，Ⅱ阶段(炎症)发生在福尔马林给药后15~30 min。中枢作用的药物，如阿片类药物和麻醉药，可以在测试的Ⅰ阶段发挥镇痛作用，中枢和外周作用的药物都可以在Ⅱ阶段发挥镇痛作用^[14]。因此，MA只在实验的Ⅱ阶段才能有效地缩减小鼠的舔舐时间表明其具有外周作用的镇痛活性。上述3种疼痛模型的实验结果表明，MA可表现外周镇痛活性，并可减轻炎症介导的疼痛。

4.2   MA的镇痛作用机制研究

本研究还采用纳洛酮阻断实验，辣椒素和谷氨酸诱导的小鼠舔爪实验，对其镇痛机制进行探讨。NAL可以消除阿片类药物的镇痛活性。然而，在醋酸扭体实验和福尔马林实验中，给药NAL后，MA的镇痛活性并没有被明显减弱，这表明阿片能系统不参与它的镇痛活性。中、高剂量的MA能有效的抑制辣椒素诱导的小鼠舔爪行为。众所周知，辣椒素能刺激瞬时感受器电位香草酸亚型1 (transient receptor potential vanilloid subfamily 1,TRPV1)，触发Aδ或C类传入纤维，进而能引起Ca²⁺和Na⁺等阳离子内流，从而引发神经元性疼痛^[15−16]。除辣椒素外，TRPV1还可被低pH和高于43 ℃的高温激活^[17]。足底注射辣椒素会引起小鼠快速的舔爪反应，然而小鼠缺乏TRPV1受体时对辣椒素诱导的舔爪行为反应会显著降低^[18]。另外，辣椒素拮抗剂辣椒平也能显著的减轻辣椒素产生的疼痛反应^[16]。因此，本实验中MA对小鼠舔爪行为的抑制活性表明其镇痛作用可能与TRPV1的调节有关。

通过谷氨酸诱导的舔爪反应来评估MA在谷氨酸能通路中的疼痛调节作用。结果表明，中、高剂量的MA能显著减弱谷氨酸诱导的舔爪行为。谷氨酸是一种广泛分布于中枢神经系统的兴奋性氨基酸。Beirith等^[19]对谷氨酸引起的疼痛机制进行研究，发现其可作用于外周、脊髓和脊椎水平上的特定谷氨酸受体引起疼痛反应，该疼痛反应涉及外周和中枢神经系统。这种神经递质的受体由两大类组成，即离子型谷氨酸受体(iGluRs)和代谢型谷氨酸受体(mGluRs)。iGluRs是配体门控离子通道，包括N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)、α-氨基-3-羟基-5-甲基异噁唑-4-丙酸和红藻氨酸受体^[20]。iGluRs被谷氨酸激活后，离子通道受体就会被激活，从而释放出启动膜电位的阳离子^[19]。NMDA受体的激活会触发细胞内酶的活性，产生NO和其他NO衍生物质，从而引发疼痛^[19]。另外，mGluRs可通过次级信使间接激活膜电位，进而产生动作电位^[20]。因此，本研究结果表明MA可能通过调节iGluRs或mGluRs产生镇痛作用。

综上所述，从积雪草中分离得到的MA具有较好的镇痛作用，该化合物产生的镇痛活性可能涉及谷氨酸能系统和TRPV1的调节，但不涉及阿片能系统。本研究结果为探索积雪草中有效镇痛活性成分及作用机制奠定了理论基础，也为镇痛药物的发现提供实验依据。