伊曲康唑4种异构体在大鼠体内的药代动力学比较
Stereoselective pharmacokinetics of itraconazole enantiomers in rats
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摘要: 采用LC-MS/MS法研究伊曲康唑4种异构体在大鼠体内的药代动力学差异。大鼠分别灌胃伊曲康唑4种异构体后,用LC-MS/MS法测定血浆中伊曲康唑4种异构体的代谢及主要代谢产物羟基伊曲康唑的生成情况。采用乙腈直接沉淀蛋白,色谱柱为Durashell HILIC柱(100 mm ×2.1 mm,5.0 m),流动相中有机相为甲醇-乙腈(1∶1),水相为含5 mmol/L 乙酸铵和0.2% 乙酸的超纯水,以0.5 mL/min的流速进行梯度洗脱,总洗脱时间为5.5 min。扫描方式为选择反应监测(MRM),采用正离子方法检测。大鼠单次灌胃给予15 mg/kg伊曲康唑4种不同异构体后,2S,4R,2R型伊曲康唑和2S,4R,2S型伊曲康唑在大鼠体内的羟基代谢物的生成量明显高于(2R,4S,2R)型伊曲康唑和(2R,4S,2S)型伊曲康唑(P<;0.001)。此外,伊曲康唑在大鼠中存在明显的雌雄差异,雌性大鼠体内的峰浓度(cmax)和药时曲线下面积(AUC0-∞)明显高于雄鼠,半衰期(t1/2)明显长于雄鼠,消除较雄鼠慢。通过检测伊曲康唑4种异构体原药及相应的羟基代谢物在大鼠体内的经时过程,表明不同异构体在大鼠体内的药代动力学行为存在明显的代谢差异和性别差异。Abstract: To investigate the stereoselective pharmacokinetics of itraconazole enantiomers in rats, four cis-ITR stereoisomers at the dose of 15 mg/kg were administered orally to rats. Blood was collected and single stereoisomer of ITZ and hydroxy-itraconazole(OH-ITZ)were determinated simultaneously by LC-MS/MS. Samples were extracted by protein precipitation with acetonitrile. Durashell HILIC column(100 mm×2. 1 mm, 5. 0 m)was used as the analytical column, while a mixture of solvent A(0. 02% acetic acid and 5 mmol/L ammonium acetate in water)and B(50% acetonitrile and 50% methyl alcohol)was used as the mobile phase. A 5. 5 min binary gradient elution(delivered at 0. 5 mL/min)was performed for the separation. LC-MS/MS was performed in positive ion mode with multiple reactions monitoring(MRM). The pharmacokinetic parameters of itraconazole enantiomers after the administration were estimated as follows: the plasma levels and AUC0-∞ of OH-(2S, 4R, 2R)-ITZ and OH-(2S, 4R, 2S)-ITZ were higher than those of OH-(2R, 4S, 2R)-ITZ and OH-(2R, 4S, 2S)-ITZ(P< 0. 001). At the same time, female rats exhibited greater cmax, t1/2, AUC0-∞ than male rats, and the absorption of male rats was more rapid than those of females. The findings indicate significant stereoselective differences in the pharmacokinetic parameters of itraconazole enantiomers and gender difference in rats.
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Keywords:
- itraconazole /
- enantiomers /
- stereoselectivity /
- LC-MS/MS /
- pharmacokinetics /
- gender difference
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普瑞巴林[(S)-3-氨甲基-5-甲基己酸]由美国辉瑞公司开发,属于γ-氨基丁酸类似物[1],通过选择性地与电压门控通道上α2δ亚基特定位点结合,调节神经末梢突触前膜钙离子内流,从而减少兴奋性神经递质的释放[2−3],临床主要适应证包括糖尿病周围神经病变相关的神经性疼痛以及带状疱疹后神经痛[4−6]等症状,药动学研究显示其主要在小肠和近端结肠吸收[7−8]。由于普瑞巴林普通制剂需每天多次给药,血药浓度波动较大,不良反应多[9];而且频繁给药,患者依从性差。2017年美国辉瑞公司开发了1天1次给药的普瑞巴林缓释片(Lyrica CR)[10],可长时间在胃中漂浮滞留,实现平稳、缓慢释放药物。
本研究以辉瑞公司的普瑞巴林缓释片为参比制剂和供试品,同时结合自制制剂进行了质量控制分析方法的开发,在含量测定方法学建立时存在以下难题:一是普瑞巴林的回收率远低于理论值,同时高效液相色谱柱压力显著增加;二是供试品溶液制备繁琐、耗时,不适合生产过程监测。为此,本研究结合对导致以上问题的原因进行了研究,发现处方组成中高比例的聚氧乙烯和卡波姆等高分子化合物,遇水后溶胀并形成凝胶是导致上述问题的根本原因[11−12]。然而,现有的有关普瑞巴林制剂含量测定的方法无法有效解决聚氧乙烯和卡波姆等高黏性大分子化合物的干扰[13−14]。
本研究采用盐析效应、辅料分散作用以及高分子溶液的沉降场原理[15]对普瑞巴林胃滞留缓释片(以下简称“普瑞巴林缓释片”)含量测定的样品前处理方法进行了研究,成功解决了这一难题。方法学验证结果显示,所建立的含量测定方法操作简便、灵敏度高、准确性好,可以满足本品的质量控制需求,也可为同类样品的分析检测提供参考。
1. 材 料
1.1 药品与试剂
参比制剂(165 mg,批号DN5398、EY0832、FN4583,美国辉瑞公司);自制制剂(165 mg,批号02204401、02204402、02204403);混合物(由同批次自制制剂压片前的原辅料混合而成);普瑞巴林对照品(含量99.4%,批号101106-202003,中国食品药品检定研究院);普瑞巴林 (批号D5385-21-005M3M,浙江华海药业股份有限公司);甲醇为色谱纯,其余试剂均为市售分析纯。微晶纤维素101[瑞登梅尔天然纤维制造(常州)有限公司];低取代羟丙纤维素(安徽山河药用辅料股份有限公司);交联羧甲纤维素钠(广州市天润药业有限公司);交联聚维酮(重庆斯泰克瑞登梅尔材料技术有限公司)。
1.2 仪 器
LC-20ADxR高效液相色谱仪(日本岛津公司);UltiMate3000型高效液相色谱仪(美国赛默飞公司);XSR205十万分之一天平、PE28pH计[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];台式高速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司);DVS+黏度计(美国Brookfield公司);0.45 µm微孔滤膜(天津市津腾实验设备有限公司);实验室纯化水系统(山东尤根环保科技有限公司)。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Inertsil ODS-3色谱柱(4.6 mm×0.25 m,5 µm),流动相3.4 g/L磷酸二氢钾(氨水调pH至6.3)-甲醇(85∶15),柱温30 ℃,流速1.0 mL/min,进样量50 µL,检测波长210 nm,运行时间15 min。
2.2 对照品溶液的制备
取普瑞巴林对照品适量,精密称定,用pH 1.2盐酸溶液(以下简称“稀释剂”)溶解并定量稀释制成质量浓度为0.66 mg/mL的溶液。
2.3 供试品溶液制备方法考察
2.3.1 溶解条件的选择
取普瑞巴林适量,置100 mL量瓶中,分别加pH为1.0、2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、6.0、6.8、7.4等不同缓冲液或纯化水50 mL,于37 ℃恒温水浴振荡器中振摇24 h,得不同pH的普瑞巴林饱和溶液,用0.45 μm滤膜滤过,取续滤液用流动相稀释至适宜浓度,用HPLC测定。结果显示,普瑞巴林在pH 2附近溶解度最低,这可能与分子结构中同时有氨基和羧基有关,是典型的两性电解质,此处可能是其等电点,呈电中性,所以溶解度最低,但仍不低于30 mg/mL。可见普瑞巴林在各生理条件下溶解度良好。
2.3.2 提取条件的选择
取普瑞巴林缓释片20 片,研磨成细粉,精密称取适量,相当于普瑞巴林约66 mg,置100 mL量瓶中,按下列不同方法制备供试品溶液。同法称取混合物制备其供试品溶液。
(1)以水为溶剂提取
加入纯化水50 mL,磁力搅拌均匀,纯化水稀释至刻度,摇匀,滤过。因溶液黏度太高,滤过困难,无法正常测试。
(2)以pH 1.2盐酸溶液为溶剂提取
加入稀释剂50 mL,磁力搅拌4 h,用稀释剂稀释至刻度,摇匀,静置,取上清液滤过,取续滤液检测。结果:参比制剂(批号DN5398)、自制制剂(批号02204401)及混合物中普瑞巴林回收率分别为91.66%、93.14%及99.65%,显示制剂中的回收率远低于2020年版《中华人民共和国药典:四部》“
9101 分析方法验证指导原则”准确度项下化学药含量和回收率限度(98%~101%)[16],而混合物中普瑞巴林回收率与理论值相当。各样品溶液在测定过程中色谱柱压力均有升高趋势。(3)盐析法
加入KCl 15 g,与药片细粉或混合物磁力搅拌混合,加入纯化水50 mL,继续搅拌4 h,用纯化水稀释至刻度,摇匀,静置,滤过,取续滤液测定。结果显示混合物中普瑞巴林回收率处于限度的下限附近,制剂中的回收率低于规定限度。尽管样品溶液黏度显著下降,但在测定过程中色谱柱压力明显升高。
将Na2SO4、KCl及 NaCl各15 g分别加入各量瓶中,与药片细粉磁力搅拌混合,加稀释剂50 mL,继续搅拌4 h,用稀释剂稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液检测。结果显示3种溶液中普瑞巴林回收率分别为:参比制剂(批号DN5398)99.43%、100.08%、99.30%,自制制剂(批号02204401)99.58%、99.67%、98.86%,均在98%~101%范围内,且在测试过程均未见色谱柱柱压升高。
考虑到KCl的溶解度更高,故考察KCl不同用量、不同搅拌时间对回收率的影响。平行3 组实验,结果见表1。表明:当KCl用量为10~20 g、搅拌时间为1~3 h时,回收率与上述搅拌4 h的结果无显著差异,均在98%~101%范围内,其中参比制剂和自制制剂平均回收率最低值分别达到98.96%和99.23%。但是,当KCl用量为5 g时,溶液黏度较大,较难滤过,平均回收率低至96.99%,且色谱柱柱压有升高现象,说明盐用量不足,盐析不完全。
Table 1. Influence of KCl usage amount and stirring time on the recovery of pregabalinKCl/g Stirring time/h Reference preparation (Batch DN5398) Homemade preparation (Batch 02204401) Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% 20 3 100.11 0.23 99.67 0.55 15 3 99.78 0.48 100.26 0.61 10 3 99.42 0.46 99.32 0.49 5 3 96.99 0.87 97.43 0.89 20 2 99.77 0.28 99.90 0.45 15 2 99.19 0.49 99.23 0.32 10 2 99.60 0.41 99.48 0.68 5 2 97.76 0.85 97.52 0.97 20 1 100.20 0.35 99.97 0.56 15 1 99.85 0.46 100.19 0.56 10 1 98.96 0.77 99.89 0.48 5 1 98.02 0.73 97.15 0.95 (4)辅料分散法
考察用微晶纤维素(MCC)、低取代羟丙纤维素(L-HPC)、交联羧甲基纤维素钠(CCMC-Na)、交联聚维酮(PVPP)作为分散剂对含量测定的影响。分别加入MCC、L-HPC、CCMC-Na及PVPP 0.46 g,与药片细粉磁力搅拌混合,各加稀释剂50 mL,继续搅拌4 h,用稀释剂稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液检测,结果显示4种溶液中普瑞巴林回收率分别为:参比制剂98.02%、98.55%、99.11%、98.63%,自制制剂97.67%、98.27%、98.59%、98.71%。可见,相比于未加任何附加剂情况下的回收率均有明显改善,但使用MCC的样品中回收率仍低于规定限度。另外,各溶液均有大量细小悬浮物,滤过阻力较大。
因参比制剂和自制制剂处方中均有PVPP,故考察PVPP不同用量、不同搅拌时间对回收率的影响。平行3组实验,结果见表2。表明PVPP用量和搅拌时间在试验范围内,普瑞巴林平均回收率均在98%~101%范围内,其中参比制剂和自制制剂中最低平均回收率仅分别达到98.19%和98.27%,处于规定限度的下限,上述搅拌4 h的回收率也未见明显提高。
Table 2. Influence of PVPP usage amount and stirring time on the recovery of pregabalinPVPP/g Stirring time/h Reference preparation (Batch DN5398) Homemade preparation (Batch 02204401) Recovery/% RSD/% Recovery/% RSD/% 0.46 3 99.29 0.81 99.37 0.76 0.46 2 99.21 0.86 98.42 0.71 0.46 1 98.46 0.62 99.65 0.96 0.23 3 98.51 0.81 98.36 0.61 0.23 2 98.62 0.90 99.70 0.49 0.23 1 98.19 0.25 98.27 0.33 (5)用有机溶剂提取
分别以甲醇、无水乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈、二甲基亚砜(DMSO)和N,N二甲基甲酰胺(DMF)作为溶剂处理样品,均因溶液黏度太高或不溶性黏性颗粒的影响,滤过困难,未获得满意结果。其中以甲醇为溶剂时,起初出现大量半透明絮状物,搅拌时间超过16 h,普瑞巴林回收率仅为97.44%,且重复性不佳,同时,随着甲醇含量增加色谱峰形变差。以无水乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃及乙腈为溶剂时,不易形成均匀溶液,回收率不到50%。DMSO和DMF为溶剂时,色谱柱压异常升高。
2.3.3 盐析法及辅料分散法对供试品溶液黏度的影响
供试品溶液黏度直接关系到HPLC测试时柱压。分别取“2.3.2”项下(3)KCl(15 g)样品溶液和(4)PVPP(0.46 g)样品溶液于离心管中,设置离心机转速10 000 r/min,于5、10、30 min分别测定离心管上、中、下不同位置的溶液的黏度,结果显示:辅料分散法制备的供试品溶液黏度较高,上部溶液黏度小于下部,表现出离心沉降现象;盐析法供试品溶液黏度更低,与纯水接近,离心未改变其黏度。
综上,无论是以普瑞巴林回收率为评价指标,还是以溶液黏度、色谱柱压及实验操作的便捷性综合评价,不同方法的优势顺序均为pH 1.2盐酸溶液+盐析> pH 1.2盐酸溶液+不溶性辅料>pH 1.2盐酸溶液>水+盐析>>水、有机溶剂。图1显示部分研究的对比结果示意图。
2.4 方法学验证
2.4.1 溶液配制供试品溶液
取普瑞巴林缓释片20片,精密称定,研细,精密称取适量(相当于普瑞巴林约66 mg),置100 mL量瓶中,加KCl 15 g,磁力搅拌,加稀释剂50 mL,磁力搅拌2 h,用稀释剂稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液。
按处方比例称取相当量的辅料,按供试品溶液制备方法配制空白辅料溶液。
2.4.2 系统适用性
精密量取供试品溶液50 µL,注入HPLC,普瑞巴林峰拖尾因子为1.05(小于1.5),理论板数为
10000 (大于2000 ),显示普瑞巴林色谱峰形良好,出峰时间适宜。2.4.3 专属性
取“2.2”项下对照品溶液及“2.4.1”项下供试品溶液、空白辅料溶液分别进样,记录色谱图,见图2,结果表明空白辅料不干扰普瑞巴林测定。
2.4.4 检测限与定量限
取普瑞巴林对照品溶液适量,用稀释剂逐步稀释,当信噪比S/N大于10时的浓度作为定量限,取定量限溶液进一步稀释至S/N大于3时的浓度作为检测限。实验结果:定量限浓度为1.32 µg/mL(S/N=11.6),检测限浓度为0.40 µg/mL(S/N=4.2)。
2.4.5 线性与范围
精密称取普瑞巴林对照品约50 mg于50 mL量瓶中,用稀释剂溶解并稀释至刻度。分别量取3.0、5.0、6.6、8.0 mL置于10 mL量瓶中,加稀释剂稀释至刻度摇匀。分别吸取以上5种不同浓度的溶液各50 µL注入HPLC,按“2.1”项下色谱条件进行测定,以对照品溶液质量浓度c为横坐标,以峰面积A为纵坐标,得线性方程为A =
1434342.98 c + 8 783.72 r2=0.999 2,表明普瑞巴林质量浓度在0.30~1.00 mg/mL范围内线性关系良好。2.4.6 准确度
由于药片细粉比混合物药物更难溶出,故用药片和混合物进行平行对比试验。保持辅料比例和用量一致,调整普瑞巴林占比,按标示量的80%、100%、120%压制普瑞巴林缓释片,每个水平制备3 份样品,每个样品取20 片,精密称定,研细,精密称取适量(分别取相当于普瑞巴林约53 、66、79 mg),后续参照“2.4.1”项下方法配制供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行测定,并与同批次混合物的测定结果进行比较。结果显示3个水平压片前和压片后普瑞巴林的平均回收率分别为99.96%和99.74%,均在98%~101%范围内,RSD分别为0.33%和0.43%。表明准确性良好。
2.4.7 精密度
按“2.2”和“2.4.1”项下方法配制对照品溶液和供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定普瑞巴林回收率,连续重复进样6次;再由另一人在另一台HPLC同法测定。结果显示:RSD分别为0.42%(n=6)、1.07%(n=6)及0.77%(n=12),表明精密度良好。
2.4.8 溶液稳定性
取“2.4.1”项下供试品溶液于室温条件下放置,分别在0、3、6、9、12 h后进样,考察样品溶液的稳定性。结果显示不同时间主峰面积的RSD为0.30%,保留时间的RSD为0.03% ,表明溶液在12 h内稳定。
2.4.9 耐用性
对色谱条件流速、柱温、流动相比例、流动相pH进行微调,考察单一条件改变对回收率测定结果的影响。精密量取“2.4.1”项下供试品溶液50 µL,注入HPLC,记录色谱图。结果显示不同条件下测定结果的RSD为0.31%,表明耐用性良好。
2.5 样品含量测定
取普瑞巴林缓释片自制和参比制剂各3 批,按“2.4.1”项下的方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件检测普瑞巴林的含量,结果分别为,自制制剂:99.47%、100.21%和99.82%,参比制剂:100.22%、99.87%和99.96%。
3. 讨 论
3.1 制剂中辅料对检测的影响以及需要特别关注的问题
物料受强压后分子间作用力显著增加,即便经研磨,分子间的内聚力仍不能完全消除,加上普瑞巴林缓释片含有大量聚氧乙烯和卡波姆等高分子化合物,遇水后迅速吸水溶胀形成凝胶,在颗粒表面形成一层屏障,阻碍了颗粒的崩解和药物分子的溶出。
按照2020年版《中华人民共和国药典:四部》“9101分析方法验证指导原则”化学药含量测定方法的准确度试验是在处方量空白辅料中加入已知量被测物对照品进行测定[16],但对一些特殊物料压制的片剂,以该指导原则建立的药物含量测定方法很可能不能反映制剂中药物的实际含量,此时需要用模拟药片来验证方法的可靠性,在实际工作中应予以特别关注。
3.2 前处理方法优化
卡波姆分子结构中含有羧基,推测其在酸性介质中溶解度差,故用pH 1.2的盐酸介质为溶剂消除卡波姆对溶液黏度的贡献。理论上讲,相对于中性或碱性环境,聚氧乙烯在酸性溶液中会发生降解使溶液黏度有所降低,但在实验条件下未观察到此现象,用pH 1.2盐酸介质制备的样品溶液,结果虽有改善,但制剂中药物回收率仍低于理论值,色谱柱压力仍有升高趋势。
高分子溶液中加入足量的电解质后,高分子就会聚沉。因此,样品溶液中加入一定量的离子型盐可显著降低高分子物质对溶液黏度的影响。
以pH 1.2的盐酸介质为溶剂,同时叠加盐析效应,可大幅度降低供试品溶液的黏度,促进药粉颗粒的崩解和传质过程,使药物能够比较顺利溶出,因此,制剂中药物回收率与理论值几乎相当。
卡波姆在酸性介质中凝聚形成沉淀,额外的具有膨胀作用的不溶性辅料可使沉淀更疏松,从而有利于药物的溶出。
3.3 总 结
尽管盐析法和辅料分散法制备的供试品溶液均可满足普瑞巴林缓释片的含量测定,相比之下,KCl盐析法制备的供试品溶液药物回收率更接近理论值,溶液性能更优越,黏度更低,溶液无须离心处理,操作更简便,而且灵敏度、准确性良好。
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