基于纳米药物递送载体的肿瘤免疫调控策略研究进展
Research progress of tumor immunomodulation strategies based on nanodrug delivery system
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摘要: 肿瘤免疫疗法是利用免疫学原理和方法，激活和增强机体免疫系统并产生免疫应答，达到清除肿瘤细胞的一种治疗模式。许多新型的免疫治疗药物展现出有效的抗肿瘤能力，但复杂的肿瘤免疫逃逸机制使其临床运用仍面临诸多挑战。同时，免疫治疗药物应用人体后，会分布至全身各组织器官，无法实现精准的病灶靶向性，从而引起了一系列的免疫相关不良反应，这也极大阻碍了其临床应用潜力。纳米药物递送载体能够将免疫治疗药物精准递送到靶组织或特定的免疫细胞，增强免疫抗肿瘤效果，同时降低不良反应。本文将以肿瘤免疫调控策略为角度，对近几年纳米药物递送载体在肿瘤免疫治疗研究领域取得的成果进行总结阐述，并对该领域的挑战和发展方向进行展望。Abstract: Tumor immunotherapy is a therapeutic modality that uses immunological principles and methods to activate and enhance the body''s immune system to generate immune response for the removal of tumour cells. Many new immunotherapeutic agents have demonstrated effective anti-tumour capabilities, yet their clinical use is challenging due to the complex mechanisms of tumour immune escape. Meanwhile, these drugs would accumulate in different tissues and organs in the human body and be unable to achieve precise and specific targeting therapeutic effects, resulting in serious immune-related adverse effects, which greatly hinders the clinical potential of immunotherapy.Nanodrug delivery systems can deliver immunotherapeutic drugs to target tissues or specific immune cells precisely, thereby enhancing immune effects and reducing side effects.This paper reviews the research progress of nanodrug delivery systems in tumour immunotherapy in recent years based on the regulatory mechanism of the anti-tumour immune response, with a prospect of the challenges and development in this field.
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溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种反复发作和缓解的炎症，属于自身免疫性疾病[1]。结肠炎的并发症可能是局部的，比如痔疮、肛周脓肿或肛裂；但由于肝肠循环的存在，也可能出现肠外表现，如肝病（脂肪肝、慢性肝炎、肝硬化和硬化性胆管炎等）[2]。对于患有肝脏疾病的结肠炎患者，其预后复发及其发展为结肠炎相关性结肠癌的风险会提高，且UC所致的肝损伤的发病机制尚不完全清楚[3]。
胆碱作为一类必需营养成分，可从饮食中获取，如肉、蛋类，也可由宿主自身合成。胆碱参与到脂质代谢、胆汁与胆固醇的肝肠循环与表观遗传学的调控等重要生物化学过程[4−6]。胆碱相关代谢通路如图1所示，主要分为4条，包括合成乙酰胆碱、甜菜碱、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）和三甲胺（trimethylamine，TMA）。胆碱代谢在结肠炎发生到恶化过程中起到非常关键的作用。异常的胆碱代谢可作为肿瘤形成与癌症进程的代谢特征[7]。肠道菌群代谢胆碱产生TMA[8]，TMA转运至肝脏中，在肝脏内被代谢生成氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO）。肠道炎症状态下，过多的胆碱代谢成有毒的TMA，这类转化会导致宿主对胆碱的使用率减少，降低宿主胆碱的生物利用度。当宿主缺乏胆碱时，可导致磷酸化系统效率降低，肝脏脂肪变性[9]；在此过程中，还伴随有线粒体功能异常，复合物Ⅰ受到限制，肝细胞产生过量的活性氧，从而导致细胞凋亡信号的传导[10]。因此，胆碱的生物利用度降低或者摄入过低会导致非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发生。
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Figure 1. Pathways for the choline metabolism; 3,3-dimethyl-1-butanol(DMB) suppress trimethylamine(TMA) levels from choline conversionChAT:Choline acetyltransferase;CHDH:Choline dehydrogenase;CK:Choline kinase;CPT:Choline phosphotransferase;CT:Phosphocholine cytidylytransferase; FMO3:Flavin monooxygenase; PLD:Phospholipase D临床研究中发现UC患者的肠道黏膜会损失掉近70%的PC，肠道微生物可以使用磷脂酶D水解PC，而后形成大量的游离胆碱。结合本课题组前期研究发现，肠道炎症会促进PC水解，生成大量游离胆碱，继而菌群紊乱会导致过多的胆碱转化为TMA，宿主的胆碱生物利用度下降，容易造成肝脏损伤，发展为NAFLD[11]。而3, 3-二甲基-1-丁醇（3,3-dimethyl-1-butanol，DMB）作为胆碱结构类似物，可诱导肠道中TMA裂解酶的非致死抑制来降低胆碱转化为TMA的水平，最终降低血浆中的TMAO，提高宿主的胆碱生物利用度。这一发现为治疗TMA相关病症，如非酒精性脂肪肝炎及心血管疾病提供了新的治疗方向[12]。
鉴于DMB的结构特征，它可能是相对无毒的，并且作为一种天然产品存在于现有的食品或酒水饮料中。参考“Drugging the gut microbiota”的概念，借助DMB，抑制肠道内胆碱转化为TMA，提高胆碱生物利用度，考察DMB能否改善结肠炎及继发性肝损伤。本研究建立了胆碱代谢的定量方法，用于检测葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）诱导的UC小鼠体内的胆碱代谢变化，进一步明确服用DMB后对肠道菌群与宿主的胆碱代谢所产生的影响。
1. 材 料
1.1 试 剂
通用型组织固定液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；葡聚糖硫酸钠（美国MP Biomedicals公司）；丙氨酸氨基转移酶（ALT/GPT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST/GOT）与碱性磷酸酶（AKP）测试盒（南京建成生物工程研究所）；乙腈（质谱级）、甲醇（质谱级）、甲酸（色谱级）、甲酸铵（色谱级）、胆碱（99%）、乙酰胆碱（99%）、三甲胺盐酸盐（98%）、甜菜碱（98%）、卵磷脂（98%）、三甲胺N-氧化物二水合物（98%）、DMB与二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）（纯度99%）（上海阿拉丁生化科技公司）；氯化胆碱-（三甲基-d9）（纯度98%，美国Sigma-Aldrich公司）。
1.2 仪 器
UHPLC systemQsight LX50液相色谱仪、Qsight 220质谱仪（美国PerkinElmer公司）；组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；5415D离心机、移液器（1000/200/50/10 μL）（美国Eppendorf仪器有限公司）；NanoZoomer 2.0 RS数字病理切片扫描仪（日本Hamamatsu公司）；BP 211D精密天平（德国Satorius有限公司）；酶标仪（美国Bio-Tek公司）。
1.3 动 物
雄性C57BL/6J小鼠，6~8周龄，体重16~20 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于中国药科大学动物实验中心。所有动物研究均遵循国际医学伦理规范，并经中国药科大学动物伦理委员会批准。
2. 方 法
2.1 急性结肠炎造模与样本收集
将小鼠适应性饲养1周，根据体重随机分为4组，依次为空白对照组（Control）、模型组（Model）、DMB低剂量组（DMBL）及高剂量组（DMBH），每组10只。（1）空白对照组：常规饲料喂养，正常饮水；（2）模型组：本实验所用模型是为期10 d的急性小鼠UC模型。第1天开始自由饮用2.5% DSS水溶液，持续7 d，每天更换新的DSS溶液，第8天撤掉DSS溶液，换为正常饮用水，持续3 d；（3）DMB高低剂量组：结合文献和DMB的毒性调研，其对啮齿类动物的半数致死量为350~500 mg/kg，称取相应质量的DMB溶液，溶于DSS溶液中，配制成0.1%和0.3%的浓度（即100 mL 0.1 g和0.3 g），低剂量为100 mg/kg，高剂量为300 mg/kg。
在动物实验的整个过程中，每天观察小鼠的精神状态、饮食、粪便性状及体重并进行记录。三者综合进行疾病活动指数评分（DAI）[13]。每个参数的评分0~4：体重减轻（0，<5%；2，6%~10%；4，>10%）；粪便黏附度（0，正常粪便；2，粪便松散；4，腹泻）；直肠出血情况（0，正常粪便；2，粪便中带血丝或黑褐色粪便；4，红棕色或暗红色血便）。DAI=（粪便黏附度评分+直肠出血情况评分+体重减轻评分）/3。
第9天对所有组小鼠做禁食处理，第10天采用摘眼球取血法，血样在室温下静置，4 ℃下3000r/min离心15 min，轻轻吸取上层淡黄色血清，将血清置于−80 ℃冰箱中保存。收集完血清样本之后，将小鼠脱颈椎处死，打开腹腔，分别收集结直肠、结肠内容物、肝脏样本放入干净EP管中。结肠与肝脏组织固定部位剪下，分别放入通用型组织固定液中用于苏木精-伊红（HE）染色。其余结肠与肝脏分别放入对应的EP管中，置−80 ℃保存，用于后续的实验。HE染色送样至中国药科大学病理与PDX药效评价平台。参照Morris标准评分[14]，求和并取均值：0，结肠组织正常；1，轻度炎症，固有层炎症浸润，基底1/3受损；2，中度炎症，黏膜及黏膜下层炎症浸润，基底2/3受损，表面上皮完整；3，重度炎症，透壁，整个隐窝和上皮丢失。
2.2 酶标仪法检测小鼠血清中ALT、AST及碱性磷酸酶
参考南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒说明书，检测各组小鼠血清中ALT、AST的活力。按照说明书添加试剂，测定各孔在510 nm波长处的吸收度。利用绘制的标准曲线计算出各血清样本中的酶活力。参考试剂盒说明书，检测各组小鼠血清中AKP的水平。按照说明书添加试剂，然后立即测定各孔在520 nm波长处的吸收度。
2.3 UPLC-QQQ-MS/MS测定小鼠肝脏、血清与肠道内容物中的胆碱代谢
2.3.1 样品前处理
血清样品：取血清样品5 μL置于1.5 mL离心管，加入80%乙腈（含0.1%甲酸）100 μL提取，涡旋10 min，超声10 min，高速离心（13000 r/min，10 min），取上清溶液50 μL。氮气吹干之后，用复溶液（含有内标的提取溶液）100 μL溶解，高速离心，取上清液10 μL置于内衬管，加复溶液90 μL，待测。
肝脏样品：取肝脏组织样品10 mg置于2.0 mL离心管，加入80%乙腈（含0.1%甲酸）400 μL提取，涡旋10 min，超声10 min，高速离心，取上清溶液20 μL。氮气吹干之后，用复溶液200 μL溶解，高速离心，取上清液50 μL置于内衬管，加复溶液50 μL，待测。
肠道内容物样品：取内容物样品2 mg置于2.0 mL离心管，加入80%乙腈（含0.1%甲酸）400 μL提取，涡旋10 min，超声10 min，高速离心，取上清溶液20 μL。氮气吹干之后，用复溶液100 μL溶解，高速离心，取上清液50 μL置于内衬管，加复溶液50 μL，待测。
2.3.2 方法学考察
线性考察：溶剂标曲和基质标曲的梯度浓度样品，按照从低浓度到高浓度分别测定之后，以待测物和内标峰面积的比值为纵坐标，以待测物浓度作为横坐标求得线性回归方程（溶剂标准曲线和基质标准曲线）。
定量限与检测限：取信噪比大于10的浓度点，平行测量6次，RSD小于20%的样品浓度作为定量限。继续稀释，平行测量6次，直到信噪比大于3，RSD小于20%的样品浓度作为检测限。
基质效应：通过修正性t检验来进行验证，比较溶剂标曲与基质标曲的斜率是否存在显著性差异，来进行评估。算出t-value后，根据自由度，核对（t-test）临界值表，判断是否存在显著性差异[15]。
精密度和准确度：取基质标曲中，低、中、高浓度质控样品，1 d内重复测定6次，带入基质标准曲线计算浓度c，计算c和空白样品的相对误差（relative error，RE），求6次测量的平均值作为日内准确度，RSD作为日内精密度；在3 d内对选定的3个浓度进行重复测定9次，以9次测量的平均值作为日间准确度，RSD作为日间精密度。
回收率：按照此公式进行计算recovery= (cs — cn)/ct × 100%，将低中高浓度质控样品，分别带入空白溶剂标准曲线计算浓度cs，cs为加标的QC样品，cn为不加标的空白样品，ct为标准品加入的理论浓度[16]。
2.3.3 UHPLC-QQQ-MS/MS分析
色谱条件：UHPLC采用液相色谱仪Qsight LX50，色谱柱为Acquity BEH HILIC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相（A）：0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵的水溶液；流动相（B）：乙腈。梯度洗脱程序：1~2 min，80%~75%B；2~3 min, 75%~65%B；3~5 min, 65%~50%B；5~5.5 min, 50%~40%B；5.5~6.0 min，80%B。柱温：35 °C；流速0.2 mL/min。进样量：2 μL。
质谱条件：采用质谱仪Triple QuadQsight 220，ESI离子源，利用正离子MRM多重反应监测模式对待测物进行定量。离子对及电压参数见表1。
Table 1. MRM transition parameters, LLOD, LLOQ, and RSD for the targeted analytes in choline metabolismAnalyte MRM DPa CEb Sensitivity LLOD/
(ng/mL)RSD LLOQ/
(ng/mL)RSD TMA 60.1>45.1 25 20 2 16.95 5 10.34 TMAO 75.9>59.1 40 30 0.5 16.39 2 7.74 CHO 104.0>45.0 100 35 0.005 19.05 0.05 14.24 CHO-D9 (IS) 113.1>69.0 100 35 ACH 147.2>88.0 70 20 0.05 14.69 0.1 14.91 Bet 118.1>59.1 120 30 0.1 8.46 0.5 7.97 PC 758.2>86.0 130 40 5 14.56 10 12.66 DMPC (IS) 678.4>86.0 130 40 a:Declustering potential;b:Collision energy
TMA: Trimethylamine; TMAO: Trimethylamine N-oxide; CHO: Choline; Bet: Betaine; PC: Phosphatidylcholine; ACH: Acetylcholine; CHO-D9: Chloride-(trimethy-d9) choline; DMPC: 1 2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine2.4 统计分析
数据使用SPSS 19.0软件和GraphPad Prism 8软件进行统计学分析，采用$ \bar{x}\pm s $表示。两组独立样本的均值比较使用Mann-Whitney U检验进行显著性差异检验，P < 0.05表示具有显著性差异，P < 0.01和P < 0.001表示差异极显著。
3. 结 果
3.1 饮用DMB溶液能够缓解小鼠结肠炎
整个实验过程中，正常对照组小鼠体重稳定增长，饮食饮水量均正常，粪便正常，为棕黄色成型软便。UC模型组自由饮用2.5%的DSS溶液3 d后，体重下降缓慢，第4天呈现显著下降，且开始出现便血，粪便呈稀状。第5天开始，体重下降与便血情况更加严重，小鼠后期的肛周可见血痂，表明UC小鼠模型造模成功。DMB高低剂量组能够有效缓解由结肠炎导致的体重下降（图2-A）。在造模过程中，DMB组的小鼠的生存情况要明显好于模型组。不同组别的小鼠结肠长度如图2-B所示。造模结束后，正常组小鼠肠壁光滑透亮，无增厚或增生的情况，未见明显充血，各个肠段形态正常，结肠内容物成型。模型组小鼠结直肠长度明显缩短，结肠内容物不成型，出现血便，腥臭（图2-C）。DMB低剂量组小鼠结肠长度要明显长于模型组，结肠萎缩及充血现象得到明显改善。DMB高剂量组的小鼠结肠长度有一定恢复，但没有显著性差异。
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Figure 2. Influence of oral DMB on colitis miceA: Percentage change chart of body weight; B: Mean colon length of each group; C: Representative images in each group; D: DAI score of each group (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs model group; n ≥ 6 )3.2 DMB改善结肠炎小鼠的结肠病理
正常对照组小鼠结肠黏膜上皮细胞完整，隐窝正常并且可见许多杯状细胞，固有层腺体形态正常且排列整齐，未见炎性细胞浸润，无变形坏死。UC模型组小鼠结肠组织表现为严重的病变，黏膜下层炎症，表现为隐窝畸形，结肠黏膜明显变薄，黏膜上皮缺损且杯状细胞严重破坏，并且肌层出现大量炎性细胞的浸润。与模型组相比，DMB高低剂量干预组小鼠结肠状况恢复良好，结肠黏膜下层水肿减轻，黏膜上皮细胞恢复完整并且可见部分杯状细胞，DMB干预能明显减轻结肠炎状况（图3）。
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Figure 3. Hematoxylin and eosin staining of colon tissues and histological score in each group*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs model group; n ≥ 6 per group3.3 DMB溶液改善结肠炎小鼠的肝脏病理与肝脏生化指标
通过肝脏病理表明，正常组肝细胞分布均匀，排列正常，细胞核位于细胞中央，包浆内颗粒感不明显。模型组肝细胞水肿，肝小叶结构紊乱，肝索拥挤；肝细胞肿大，肝囊扭曲、狭窄、闭塞，肝细胞包浆疏松变孔，呈网状或透明，胞核悬浮于中央，染色变浅，双核细胞发生率增加，提示肝脏疾病严重。DMB组的肝脏病理切片结果趋近于正常对照组，表明DMB能缓解由结肠炎导致的肝损伤（图4-A）。
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Figure 4. DMB intervention ameliorated secondary liver injuryA: Hematoxylin and eosin staining of liver tissues of each group; B: Alanine transaminase(ALT), aspartate aminotransferase(AST) and alkaline phosphatase(AKP) activity in plasma*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001, vs model group; n ≥ 6 per group进一步表征结肠炎对肝功能的影响，测定了DSS诱导的模型组小鼠的血清中ALT、AST和AKP水平，如图4-B所示，结果显示与空白对照组相比，UC小鼠的血清中ALT和AST水平显著升高，提示肝功能异常，DMB组回调了这两项指标。UC导致血清中AKP的水平出现明显下降，但DMB对其改变不明显。
3.4 胆碱代谢通路测定的方法学考察
线性考察结果见表2，两条标准曲线拟合指数R2均大于0.99，说明具有良好的线性关系。在定量范围内，待测物的响应和浓度线性关系良好，能够保证该方法计算内容物中各个代谢物浓度的准确性。定量范围适中，能够满足不同浓度样品的测定。
Table 2. Solvent-only and matrix-matched calibration curves and R2 of samplesCompd. Solvent-only Matrix-matched Dynamic range/
(ng/mL)Calibration curves R2 Calibration curves R2 Intestinal contents TMA y = 0.0017x + 0.0057 0.995 3 y = 0.0015x + 0.0349 0.998 0 3.75−375 TMAO y = 0.0143x + 0.037 0.998 9 y = 0.0130x + 0.0393 0.998 0 1.25−125 CHO y = 0.0115x – 0.0073 0.999 7 y = 0.0112x + 1.9279 0.9978 5−500 ACH y = 0.0028x – 0.001 0.998 0 y = 0.0027x + 0.0025 0.9931 0.5−50 Bet y = 0.0383x + 0.0576 0.9993 y = 0.0343x + 0.9758 0.999 0 1−100 PC y = 0.7703x + 0.0217 0.9975 y = 0.5176x + 1.1683 0.9939 12.5−12500 Liver TMA y = 0.0095x + 0.0038 0.9997 y = 0.0089x + 0.1968 0.9972 1.25−125 TMAO y = 0.0162x + 0.0402 0.9988 y = 0.0150x + 0.0329 0.9988 1.25−125 CHO y = 0.0116x + 0.0227 0.9999 y = 0.0118x + 1.8986 0.9976 10−1000 ACH y = 0.0013x – 0.0007 0.9992 y = 0.0013x + 0.0021 0.9937 1.25−125 Bet y = 0.0181x + 0.0481 0.9993 y = 0.0176x + 5.1867 0.9955 4−400 PC y = 0.4209x + 0.1404 0.9943 y = 0.3533x + 11.624 0.9918 300−30000 Serum TMA y = 0.0057x + 0.0197 0.9955 y = 0.0053x + 0.0192 0.998 0 1.8−180 TMAO y = 0.0159x + 0.0761 0.9982 y = 0.0150x + 0.0502 0.9998 2.25−225 CHO y = 0.0129x + 0.0068 0.9999 y = 0.0134x + 0.9229 0.9995 6.75−675 ACH y = 0.0028x – 0.0006 0.9981 y = 0.0028x + 0.0005 0.998 0 0.9−90 Bet y = 0.0395x + 0.1593 0.9986 y = 0.0371x + 0.8011 0.9997 4.5−450 PC y = 0.0006x + 0.0775 0.995 0 y = 0.0004x + 3.3674 0.9967 90−9000 该方法的灵敏度用定量限和检测限表示，如表1所示，LLOD在0.005~5 ng/mL范围内，相对标准偏差在8.46%~19.05%之间，LLOQ水平在0.05~10 ng/mL之间，相对标准偏差在7.74 %~14.91%之间。
如表3所示，日内精密度RSD在1.44%~13.33%之间，日间精密度RSD在1.21%~14.45%之间，说明仪器在检测时间内稳定。日内、日间准确度分别在−18.76%~18.63%和−17.42%~18.58%之间，说明应用该方法定量表征血清、肠道内容物及肝脏中胆碱类生物标志物的准确度良好。
Table 3. Methodological observations including precision and accuracy, recovery and matrix effects resultsAnalyte Added/
(ng/mL)Matrix effect Recovery Intraday Interday t-value Mean/% RSD/% Accuracy/% Precision/% Accuracy/% Precision/% Intestinal contents 15 101.01 8.87 −6.23 6.60 −3.61 14.45 TMA 112.5 0.270 3 100.50 4.12 9.05 5.27 8.29 5.21 187.5 105.43 6.29 9.60 7.95 10.40 9.62 5 90.90 10.79 4.12 6.33 2.30 6.03 TMAO 37.5 0.1574 102.91 4.94 7.61 7.39 6.44 6.95 62.5 105.53 7.33 3.58 2.92 4.43 4.52 20 103.49 6.02 −9.57 3.31 −6.62 2.92 CHO 150 0.0221 97.78 9.96 −8.75 4.37 −9.17 3.24 250 90.76 6.10 −2.45 4.87 −5.47 5.08 2 105.14 6.73 −1.71 13.33 5.14 4.67 ACH 15 0.0493 101.74 5.70 1.74 5.33 1.74 5.37 25 116.08 4.01 18.63 3.69 17.33 4.45 4 89.97 9.39 −17.39 2.62 −14.80 2.64 BET 30 0.2426 97.01 4.44 −1.92 1.76 1.97 3.97 50 101.98 6.18 3.11 4.42 −2.73 2.17 50 95.34 9.21 14.74 7.99 −9.03 8.34 PC 375 0.3543 86.83 6.45 −0.83 8.41 4.89 8.25 625 108.79 9.52 −5.41 3.40 −12.20 2.45 Liver 5 102.47 10.80 −18.76 8.67 −9.70 5.82 TMA 37.5 0.1256 89.42 7.39 −1.78 5.43 −0.49 4.72 62.5 100.64 5.70 −13.82 12.16 −16.83 11.10 5 97.05 7.78 7.09 5.16 8.26 4.79 TMAO 37.5 0.1275 96.94 4.75 −3.98 5.12 −2.98 4.21 62.5 93.64 3.49 −3.90 3.65 −4.63 3.05 40 112.08 5.20 17.38 6.02 11.81 2.68 CHO 300 0.0248 101.53 2.61 −5.49 1.76 −5.32 1.80 500 101.44 2.09 −9.76 1.80 −9.39 1.71 5 114.08 6.74 17.77 7.92 14.91 5.56 ACH 37.5 0.0160 98.90 9.06 −2.11 8.36 −1.26 8.33 2 96.19 5.70 −7.23 12.01 −6.09 12.78 16 87.37 8.87 4.21 3.15 13.73 3.27 BET 120 0.0392 102.23 5.56 −4.06 3.93 −5.54 3.65 200 94.45 9.36 −2.06 3.01 2.23 1.63 1200 104.40 11.21 −8.68 11.10 −14.11 11.17 PC 9000 0.1895 89.23 6.76 0.25 9.22 −8.62 8.02 15000 100.80 13.85 7.64 6.81 0.97 6.05 Serum 7.2 80.61 9.82 −8.49 7.33 −11.82 4.36 TMA 54 0.1574 89.53 1.90 −8.46 1.73 −8.36 1.91 90 96.75 4.49 −2.05 4.26 −0.62 2.45 9 94.67 6.13 −4.87 4.39 −3.41 3.55 TMAO 67.5 0.2001 97.22 2.93 −2.71 2.79 −3.37 2.42 112.5 99.08 1.48 −0.87 1.44 −0.75 1.53 27 90.24 12.61 −9.60 5.87 7.13 10.52 CHO 202.5 0.0580 97.89 2.75 −0.67 2.02 0.17 1.21 337.5 99.75 2.07 0.60 1.70 0.85 1.76 3.6 82.76 10.97 −17.24 10.35 −17.42 7.98 ACH 27 0.0000 97.06 3.61 −2.93 3.59 −4.00 2.26 45 97.24 5.02 −2.75 5.00 −2.86 5.16 18 95.90 5.94 −4.09 2.63 −3.40 2.73 BET 135 0.1404 99.76 2.40 −0.23 2.07 −0.49 2.17 225 101.85 2.44 1.85 2.23 1.77 2.44 360 86.66 4.24 −10.91 3.58 4.86 3.27 PC 2700 0.5438 95.69 9.71 0.03 2.25 2.25 1.90 4500 111.36 11.95 14.75 5.98 18.58 5.36 在基质效应的评估中，t-value所对应的P都小于0.05所对应的临界值，说明基质标曲与溶剂标曲的K不存在显著性差异，说明基质效应对该方法干扰较小。在回收率评估中，均值在80.61%~114.08%之间，满足80%~120%的要求。
3.5 DMB对结肠炎小鼠体内胆碱代谢的影响
胆碱是宿主必需的膳食营养物质，是合成神经递质乙酰胆碱、细胞膜脂质卵磷脂和鞘磷脂，以及甲基供体——甜菜碱所必需的[17]。DSS诱导的UC小鼠肠道内容物中的胆碱与PC水平显著性升高，其来源可能是因为由于结肠黏膜损伤，黏膜屏障的PC严重流失，肠道菌群过度水解PC，产生游离胆碱[18]。该发现与临床研究相一致，黏膜损伤导致大量的PC水解为胆碱，过多的胆碱转变为TMA。在模型组的肠道内容物中，TMA、胆碱与卵磷脂含量均发生显著性增加（图5-A）。
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Figure 5. Bar graph of choline metabolism-associated metabolites quantificationA: Intestinal contents; B: Liver; C: Serum *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs model group; n ≥ 6 per groupDMB组小鼠同时服用DSS与DMB混合的溶液后，其肠道内容物中的胆碱代谢通路变化明显，DMBL组回调了TMA、胆碱与卵磷脂的水平，如图5-A所示。有研究表明，含有胆碱的前体物质（如胆碱、甜菜碱、PC等）也能够产生TMA，DMB能够抑制这些TMA的前体物质的产量。但在结果中仅观察到模型组的甜菜碱含量显著性增加，DMB组对其存在一定的下调趋势，但不具有显著性差别。在DMB减少TMA生成的同时，肠道内的生成TMA的前体物质的含量也发生减少，由此可以推断服用适当剂量的DMB能够减少肠道胆碱的不良转化，提高宿主的生物利用度。
肠道菌群代谢胆碱形成TMA，TMA在肝脏中被氧化形成TMAO，这一代谢过程在非酒精性脂肪肝炎的发展中起到重要作用。如图5-B所示，TMA在DSS诱导的结肠炎模型组的肝脏中出现了显著增加，其主要来源于肠道胆碱类物质的转化。DMB高低剂量组均显著抑制了肝脏中的TMA含量。DMB口服后，TMAO的含量也在低剂量组显著下降，但高剂量组下降没有形成显著性差异。模型组肝脏中胆碱水平呈现下降趋势，但不具有显著性差异。
血清中的胆碱代谢变化是肝脏与肠道内容物的集中反映。在结肠炎的发生过程中，血清中也出现了TMAO的含量增加，补充DMB可显著降低血浆TMAO水平。除此以外，模型组血清中的胆碱与甜菜碱含量明显升高，DMB高低剂量组均有一定的回调作用，如图5-C所示。从组织整体性来看，DMB对肠道内胆碱代谢通路的改变最为明显，可以推测其作用靶点在肠道菌群代谢。
4. 讨 论
胆碱代谢在UC发生到严重化过程中起到非常重要作用。UC发生后，肠道内的胆碱类代谢物的变化比较复杂。除TMA外，胆碱的其他代谢物，如甜菜碱和卵磷脂的含量也在模型组中升高了。在人类饮食和人体中最丰富的胆碱形式是PC。除了10~20 g PC作为胆汁成分引入胃肠道腔外，PC还占食物中总胆碱含量的50%以上[17]。PC也被确定为结肠上皮黏膜层的主要脂质成分。在临床研究中，UC患者的黏膜屏障的磷脂酰胆碱部分可减少70%，过量的肠道微生物磷脂酶活性可能加速黏膜降解，继而释放更多的游离胆碱来影响TMA的产生[19]。本次研究为阐明肠道菌群的胆碱代谢对UC病情进展的影响提供了一个起点，并且补充说明了炎症导致的肠道菌群失调，对胆碱代谢的影响是多位点的。同时也说明了DMB遏制胆碱转为TMA，有助于改善UC的症状。
DMB作为一种非致命的微生物酶靶向抑制剂的治疗剂，其在理论上的优势是比抗生素产生耐药性的选择性压力更小。然而，肠道微生物群被认为是非常动态和适应性的，包括对不同的饮食输入的反应以及特定疾病的变化。从研究结果来看，在DMB减少TMA生成的同时，肠道内的包含胆碱的前体物质的含量也发生减少，由此可以推断服用适当剂量的DMB能够减少胆碱的肠道消耗，提高宿主的生物利用度。这样的研究发现不仅局限于心脑血管疾病中，也存在DMB抑制结肠炎及其所致肝损伤中。另外也有研究表明，高果糖诱导的高血压与血清中上升的TMAO相关，而补充DMB能够减少血清中TMA、TMAO、乙酸及丙酸水平[20]。靶向肠道微生物源代谢物TMAO和短链脂肪酸，早期干预高血压进程，对降低高血压有显著影响[21]。近期还有研究报道，在系统性红斑狼疮小鼠模型中，检测到激活后血浆TMAO水平升高，服用DMB后，肠道细菌TMA降低，血浆TMAO水平也得到抑制。DMB能够降低系统性红斑狼疮的疾病活动性，提示它是一种潜在的治疗药物[22]。除此之外，微生物的胆碱利用会影响成年小鼠多个组织的DNA甲基化模式，同时增加肥胖的风险；且TMAO水平也与内脏脂肪量呈正相关[23]。综合近期研究与本次研究结果发现，肠道细菌能够将胆碱转化为TMA，不仅会增加血浆中TMAO的水平，还会降低胆碱及其下游单碳代谢产物的生物利用度[24]。DMB在一定程度上提高胆碱的生物利用度，其作用的靶点很大可能在于抑制肠道胆碱的不良转化。
5. 结 论
本研究靶向胆碱的肠道菌群代谢，使用DMB作为药物，发现了DMB对于UC有较为明显的缓解作用。研究中建立了体内胆碱代谢通路的检测方法，考察了3类生物样品中胆碱相关代谢物的变化：DMB对肠道内容物中胆碱代谢通路的改变最明显，其次是血清，最后是肝脏。在本研究设计初期，是根据DMB能够抑制胆碱转化为TMA的特性，减少肠道菌群与宿主竞争胆碱，提高其生物利用度，缓解结肠炎所导致的肝脏损伤。但研究结果表明，抑制胆碱转为TMA，提高胆碱的生物利用度，对肠道及宿主代谢的影响更为重要。控制肠道菌群对TMA前体物质的利用率，能够有效缓解结肠炎的恶化，从而降低由于严重的肠道病变导致肝脏受损。胆碱的摄入以及体内的生物利用度对维持人体健康，控制疾病发展起到非常关键的作用。胆碱代谢属于肠道菌群与宿主的相互作用，对其建立有效的评估方式能够对疾病进行更准确的评估。
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