缺血性脑卒中后小胶质细胞吞噬作用的研究进展
Reaserch progress of microglial phagocytosis in ischemic stroke
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摘要: 缺血性脑卒中是影响人类健康的重大疾病，目前有关它的病理机制并未完全阐明。小胶质细胞是中枢神经系统中重要的免疫细胞。缺血性脑卒中后，大量小胶质细胞激活，并向损伤区域迁移聚集，吞噬坏死的细胞或碎片，释放炎症因子或营养因子，参与了缺血性脑卒中的病理过程。其中小胶质细胞的吞噬作用在脑缺血损伤以及康复中发挥重要的作用。本文总结小胶质细胞吞噬作用的分子机制，并综述小胶质细胞吞噬作用在缺血性脑卒中的研究进展，探讨小胶质细胞吞噬作用在脑缺血损伤和康复中的多样性和复杂性，旨在为缺血性脑卒中的治疗和药物研发提供新的思路。Abstract: Ischemic stroke is a major disease affecting human health, and its pathological mechanism has not been fully elucidated. Microglia are important immune cells in the central nervous system, and participate in the pathological process of ischemic stroke.Following an ischemic stroke, a surge in activated microglia occurs, migrating and congregating within the afflicted regions.These microglia engulf deceased cells or fragments, releasing inflammatory or nutritive factors, thereby participating in the pathogenesis of ischemic stroke.The phagocytosis of microglia plays an important role in cerebral ischemic injury and rehabilitation. This article summarizes the molecular mechanism of microglial phagocytosis and reviews the research progress of microglial phagocytosis in ischemic stroke, and discusses the diversity and complexity of microglial phagocytosis in cerebral ischemic injury and rehabilitation, so as to provide new ideas for the treatment and drug development of ischemic stroke.
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Keywords:
- ischemic stroke /
- microglia /
- phagocytosis
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天然产物斑蝥素（cantharidin,CTD）及其衍生物具有显著的抗癌活性，然而由于递送系统缺陷导致的治疗效果不理想或由此引发的不良反应一直束缚着CTD的临床应用[1−3]。目前已有文献报道CTD的纳米给药系统主要有脂质体、胶束和脂质纳米粒等，然而这些递送系统普遍存在载药量低、靶向性差、释药性能不理想等问题。例如常见的PEG-PLGA胶束载药量仅在4%左右，且耐稀性差、递送过程中会出现明显的泄漏；固体脂质纳米粒的稳定性较差、容易被肝脏截留导致递送效率低肝脏毒性增加；而CTD脂质体载药量一般也仅仅在5%左右，且贮存稳定性较差[4−6]。因此，急需开发药剂学性能良好的CTD纳米给药系统。
本研究选用相对分子质量为90000~140000 且具有分支结构的两亲性聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus，Sol）为载体材料，对CTD进行负载，得到负载效率为90%，负载比例高达45%的CTD@Sol。由于Sol疏水片段上具有可质子化的叔胺结构，因此该系统具有生理性pH响应的特点[7−9]，即在生理环境（pH 7.4）中不利于药物的释放，而在酸性环境（pH 5.5）即模拟细胞内溶酶体环境下药物呈加速释放状态，提示CTD@Sol可有效减少药物在递送过程中的泄漏，增加药物的肿瘤蓄积量，提高CTD的治疗指数。
1. 材 料
1.1 试 剂
斑蝥素对照品（成都曼思特生物科技有限公司）；斑蝥素原料药（美国Sigma-Aldrich公司）；聚乙烯己内酰胺-聚乙酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（德国BASF公司）；香豆素6（上海懋康生物科技有限公司）；RPMI 1640培养基、磷酸盐缓冲液（1×）、0.25%胰蛋白酶（1×）、青霉素链霉素溶液（美国Gibco公司）；透析袋MD3416（北京博奥拓达科技有限公司）；MTT（北京酷来搏科技有限公司）；近红外荧光染料DiR（美国Aladdin公司）；AnnexinV - FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（安徽白鲨生物科技有限公司）；甲醇（色谱纯，美国Fischer公司）；其他试剂均为市售分析纯。
1.2 仪 器
扫描电子显微镜（美国FEI公司）；赛默飞高效液相色谱仪（美国Thermo公司）；双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；高速冷冻离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；荧光倒置显微镜（德国Leica公司）；ELx800TM吸收光酶标仪（美国BioTek公司）；流式细胞仪（美国BD公司）；小动物活体成像（美国Carestream公司）；荧光分光光度计（日本岛津公司）。
1.3 动物和细胞株
昆明小鼠，雌性，6~8周龄，体重（18 ± 2）g，购自内蒙古医科大学实验动物中心，合格证号：SYXK（蒙）2023-0003；BALB/c，雌性，6~8周龄，体重（18 ± 2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2021-0006。小鼠乳腺癌细胞株4T1（中国医学科学院基础医学研究所）。所有动物均符合动物伦理委员会标准。
2. 方 法
2.1 斑蝥素聚合物胶束的制备及表征
采用溶剂注入法制备CTD@Sol[10]。首先精密称定药物CTD与Sol（质量比1∶1）并将其分别溶解在甲醇中随后将两种溶液混匀，在冰水浴探头超声条件下将其注入到水溶液中，使甲醇与水的体积比为1∶2。待有机溶液滴加完全后，将其转移至茄形瓶中，使用旋转蒸发仪蒸发至有机溶剂挥发完全即可得到CTD@Sol；空白制剂按相同方法进行制备，不加入CTD即可。将制备好的CTD@Sol以10倍量的蒸馏水稀释后使用粒度仪测定其粒径、Zeta电位及多分散系数（PDI）；并将其滴加到硅片上，采用扫描电镜（SEM）观察粒子形态；高效液相进行包封率和载药量测定。
2.2 含量测定方法建立及考察
2.2.1 色谱条件建立
流动相：甲醇-水（23∶77）；色谱柱：Symmetry C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）；流速：1 mL/min；检测波长：230 nm；温度：30 ℃。
2.2.2 方法学考察
线性关系：制备CTD对照品储备液，将其稀释至0.005~1.00 mg/mL，以色谱峰面积（Y）与CTD对照品质量浓度（X）进行线性回归。
专属性：将空白制剂、斑蝥素游离药物、CTD@Sol进样并记录色谱图。
精密度：将高、中、低3个浓度分别为1、0.25、0.025 mg/mL的CTD对照品溶液，连续进样5次，记录色谱图中色谱峰的峰面积，计算其相对标准偏差（RSD）。
稳定性：将CTD@Sol制成供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h进样，记录色谱图中色谱峰的峰面积与保留时间，计算RSD。
加样回收率：将制剂制成供试品溶液3份，分别加入高、中、低3个浓度的CTD对照品溶液，各进样5次，记录色谱图中色谱峰的峰面积，并计算相对应的RSD与加样回收率。
以上测定均按“2.2.1”项下色谱条件进样[11]。
2.3 X射线衍射（XRD）
将CTD、Sol、CTD与Sol的物理混合物及CTD@Sol的冻干粉末分别置于样品槽内，在以Cu-Kα为发射源、扫描范围为5°~80°、扫描速度为3°/min、电压40 kV、电流100 mA的测试条件进行实验[12]。
2.4 体外累积释放度实验
以斑蝥素游离药物组作为对照组，采用透析袋法研究CTD@Sol的体外释放行为。以磷酸盐缓冲液（PBS）作为释放介质以用来模拟机体正常生理环境（pH 7.4）和细胞溶酶体环境（pH 5.5）。首先分别取CTD@Sol与斑蝥素游离药物溶液2 mL置于截留分子量为3000的透析袋中，随后将透析袋分别置于pH分别为7.4、5.5体积为20 mL的释放介质中，在37 ℃、100 r/min的摇床中进行振荡，并分别于1、2、4、12、24、36、48 h取释放介质0.5 mL，并补充相同体积的新鲜释放介质，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定并记录峰面积，按公式（1）计算药物释放率[13−14]：
$$ Q_i\text{(\%)}=\text{[}V_1(c_1+c_2+\cdots\cdots+c_{i-1})+V_2c_i/V_0c_0\text{]}\times100 $$ (1) 式中：Qi为释放率；V1为取样量；V2为介质体积；c1，······，ci为每个时间点CTD的浓度；V0和c0为透析袋中所投药物的体积与浓度。
2.5 生物安全性考察
取10 mL EP管9个，编号1~9。其中1号管为阴性对照组（生理盐水）、9号管为阳性对照组（超纯水）、2~8为不同浓度的供试品组。取新鲜昆明小鼠血液用生理盐水配成2%红细胞悬液，取CTD@Sol储备液用生理盐水稀释成10、20、30、40、50、100、150 μg/mL的供试品溶液，并将不同浓度的供试品溶液与2%的红细胞悬液混匀后放入带有编号的试管中在（37 ± 0.5）℃的培养箱中孵育3 h，孵育结束后离心。首先观察离心后各组上清液外观情况，随后取上清液使用紫外分光光度计于545 nm处检测上清液吸收度。按公式（2）计算溶血率，以对CTD@Sol进行生物安全性考察[15]：
$$ \mathrm{Hemolysis}(\text{%})=(A_{{\mathrm{t}}}-A_{{\mathrm{nc}}})/(A_{{\mathrm{pc}}}-A_{{\mathrm{nc}}})\times100 $$ (2) 其中：At为样品吸收度；Anc为阴性对照管吸收度；Apc为阳性对照管吸收度。
2.6 体外抗肿瘤活性研究
2.6.1 形态学检查
通过倒置显微镜观察不同药物组别对4T1细胞在10 μg/mL的终浓度下干预24、48 h后，细胞形态、细胞密度的变化情况。
2.6.2 细胞毒实验
将处于对数生长期的4T1细胞，调整到适当细胞密度接种于96孔板中，以MTT法进行细胞毒性实验研究。首先设置对照组与空白制剂组、斑蝥素游离药物组、CTD@Sol组并按照梯度给药方式进行给药（空白制剂组给药浓度梯度为1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL；斑蝥素游离药物组与CTD@Sol组给药浓度梯度0.5、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10 μg/mL），随后将各给药组于37 ℃、5% CO2培养箱中继续孵育24、48 h，孵育结束后将孔板取出，弃培养液，加入MTT溶液并在培养箱中继续孵育，4 h后弃孔内MTT溶液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振摇10 min。使用酶标仪检测490 nm的波长下各组吸收度值，并计算相应的IC50[16]。
2.6.3 细胞凋亡实验
将处于对数生长期的4T1细胞，调整到适当细胞密度接种于6孔板中。首先设置不含药的空白组与含药的斑蝥素游离药物组、CTD@Sol组（含药组CTD均为1.26 μg/mL），随后在继续培养24 h后收集细胞，PBS清洗细胞3次，离心、去除上清液，并根据Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书指示进行操作，进行流式细胞仪检测[17−18]。
2.6.4 细胞摄取实验
将处于对数生长期的4T1细胞，调整到适当细胞密度接种于6孔板中。设置不含药的空白组与含药的斑蝥素游离药物组、CTD@Sol组。因CTD本身不具有荧光强度，实验中使用荧光探针香豆素6（C6）代替CTD。游离香豆素6组与制剂组（C6@Sol）通过荧光分光光度计定量使两组给药荧光浓度保持一致（C6质量浓度均为150 μg/mL），并在给药时间为0.5、1、2 h时收集细胞，进流式细胞仪检测[19−20]。
2.7 斑蝥素聚合物胶束靶向性评价
本实验通过小动物成像活体技术选取具有低荧光干扰性、非猝灭性的DiR为荧光染料标记载体，并设立游离组（只含有DiR，不标记载体）作为对照，以此来考察CTD@Sol对肿瘤组织的靶向性与体内组织器官分布情况[21−22]。首先将建立乳腺癌（4T1）荷瘤BALB/c小鼠模型，随后待肿瘤模型建立成功（接种部位可触摸到豆粒大小的肿块）后将小鼠随机分为2组并以尾静脉给药的方式进行给药2组DiR质量浓度均为10 μg/mL。在给药后的不同时间点（1、4、12、24 h）通过小动物活体成像仪采集图像信息，以示踪两种药物在活体小鼠体内不同器官的分布情况，并在给药24 h时脱颈处死小鼠并取出心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织进行成像，以示踪小鼠离体器官中2组药物的分布情况。
3. 结 果
3.1 斑蝥素聚合物胶束表征
CTD@Sol溶液澄清透明、呈微弱淡蓝色乳光、SEM下观察该制剂外观为球形颗粒、粒度分布均匀（图略）。CTD@Sol的平均粒径为（159.73 ± 1.96）nm、PDI为0.198 ± 0.006、Zeta电位为（–47.60 ± 1.77） mV。根据色谱结果计算得到CTD@Sol的包封率（90.29 ± 1.69）%，载药量为（45.00 ± 0.84）%，实验结果表明制剂具有较高包封率与载药量。
3.2 斑蝥素的含量测定
以峰面积（Y）对质量浓度（X）绘制标准曲线并进行线性方程拟合，得回归方程为Y = 14.853X – 0.021 3，R2 = 0.999 8（n = 3），结果表明CTD在0.005~1.00 mg/mL范围内线性关系良好；专属性实验结果显示，斑蝥素游离药物组和CTD@Sol组在18 min左右有明显的色谱峰，阴性样品在相应时间内无干扰，专属性良好（图1）；精密度实验结果显示，峰面积、保留时间RSD均小于2.0 %，表明其仪器精密度良好；稳定性实验结果显示，保留时间及峰面积的RSD均小于2.0 %，符合方法学要求，供试品溶液在24 h内稳定；加样回收率为（103.32 ± 0.44）%、（102.45 ± 0.51）%、（95.19 ± 1.42）%，RSD（%）分别为0.42、0.50、1.49，加样回收率在95%~105% 之间，峰面积的RSD小于2 %，符合方法学要求。
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Figure 1. Specificity investigation for determination of cantharidin (CTD)a:Blank（drug-free blank carrier）;b: CTD@Soluplus(Sol); c: CTD3.3 XRD测定
如图2所示，CTD在15.69 °和32.02 °处有明显的衍射峰，CTD与Sol物理混合物中也有类似的衍射峰，而CTD@Sol、Sol的光谱中CTD的衍射峰均未出现。说明将CTD制成CTD@Sol后药物可以很好的包封于载体材料中，被包载的CTD以无定形的结构存在。
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Figure 2. X-ray diffraction patterns of drugs and carrier materials and physical mixtures of drugs and materials and micellar formulationsa:CTD; b:Sol; c: CTD and Sol physical mixture ; d: CTD@Sol3.4 体外释放度考察
药物体外累积释放结果如图3所示，游离药物组中CTD释放具有突释现象并在不同pH的介质中释放速度无明显差异，在24 h时几乎释放完全。而CTD@Sol组中CTD在中性环境（pH 7.4）的释放条件下其释放量始终低于游离组药物，在酸性环境（pH 5.4）条件下CTD@Sol 12 h左右释放量到达80%左右，相比之下酸性环境（药物内吞入胞溶酶体酸化环境）可加速药物释放，表明制剂具有生理性pH敏感的特性。
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Figure 3. In vitro cumulative release curves of CTD and CTD@Sol ($ \bar{x} $ ± s , n = 3)3.5 生物安全性考察
由图4可知，阴性对照组（编号1）与不同浓度给药组（编号2~8）上层溶液澄清透明、管内红细胞全部下沉未见明显溶血现象，阳性对照组（编号9）则产生了全溶血现象。由紫外分光光度计进行进一步测定阴性对照组、阳性对照组以及不同浓度给药组上清液的吸收度值并计算溶血率。由测定结果可知当CTD@Sol在10~150 μg/mL的给药浓度范围内溶血率分别为（1.11 ± 0.72）%、（1.05 ± 0.60）%、（1.77 ± 0.79）%、（1.99 ± 0.60）%、（2.09 ± 0.97）%、（3.21 ± 0.75）%、（4.53 ± 0.46）%，其溶血百分率均小于5%。表明CTD@Sol在此浓度范围内具有良好的生物安全性，不会产生明显的溶血现象。
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Figure 4. CTD@Sol Qualitative judgment results of hemolysis experiments ($ \bar{x} $ ± s , n = 6）1:Normal saline; 2-8:CTD@Sol; 9:Ultrapure water3.6 体外抗肿瘤活性研究
3.6.1 形态学检查结果
由图5可知不同给药组细胞密度由大到小分别为：对照组、空白制剂组、游离药物组、CTD@Sol组，其中CTD@Sol组细胞密度减少最为明显，并随着处理时间的延长，细胞出现了一系列明显的形态学变化，如细胞收缩、细胞膜边缘模糊、细胞脱落以及细胞结构的破坏等现象。
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Figure 5. Morphological changes in the 4T1 cells after treatment with various formulations for 24 h and 48 hControl:Untreated cells; Blank:Drug-free blank carrier3.6.2 细胞毒性实验结果
通过MTT法检测空白制剂组、游离药物组、CTD@Sol组细胞活力。空白制剂质量浓度1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL时细胞存活率分别为（115.60 ± 6.26）%、（121.56 ± 2.73）%、（117.25 ± 2.39）%、（109.13 ± 1.65）%、（99.00 ± 1.48）%、（90.75 ± 4.51）%、（86.18 ± 2.40）%和（77.18 ± 1.43）%，由此可知当空白制剂质量浓度高达128 µg/mL时，4T1细胞的存活率依旧保持在80%左右，表明空白制剂体系生物安全性良好；游离药物组和CTD@Sol组在不同时间点对4T1细胞进行给药结果如图6所示当游离药物组和CTD@Sol组对4T1细胞作用24、48 h后，其细胞存活率均随给药浓度、给药时间的增加逐渐降低，且在相同作用时间点与给药浓度条件下，CTD@Sol组细胞存活率较游离药物组相比呈现出显著的降低。
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Figure 6. Cytotoxicity of CTD and CTD@Sol on 4T1 cells after treatment with the indicated drugs for (A) 24 h and (B) 48 h ($ \bar{x} $ ± s , n = 3)游离药物组与CTD@Sol组对4T1细胞作用不同时间细胞存活曲线如图7所示，细胞活性随2组药物浓度的增加均呈降低趋势。游离药物组与CTD@Sol组处理细胞24 h后，IC50分别为3.59 和2.22 μg/mL（图7-A），48 h时其IC50分别为1.36 和1.26 μg/mL（图7-B），实验结果表明在相同作用时间与浓度下CTD@Sol组对4T1细胞的抑制作用更强。
3.6.3 细胞凋亡实验结果
利用Annexin V-FITC/PI双染色法和流式细胞术评价CTD@Sol诱导4T1细胞的凋亡能力。结果如图8-A所示，不同药物处理组的细胞的凋亡程度不同，CTD@Sol组细胞凋亡平均百分比为（15.80 ± 3.09）%，游离药物组细胞凋亡平均百分比为（5.33 ± 2.88）%。由图8-B所知2组对比下来CTD@Sol组诱导细胞死亡占比最高，与游离药物组相比具有显著性差异，因此可以得出将药物CTD制成CTD@Sol其抗肿瘤活性得到了显著的提升。
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Figure 8. Effects of different dosing groups on apoptosis of 4T1 cellsA: Analysis of apoptotic levels in 4T1 cells by flow cytometry; B: Quantification of apoptotic levels($ \bar{x} $ ± s, n = 3) *P< 0.05,**P < 0.013.6.4 细胞摄取实验
由图9可知，随着孵育时间的增加，游离香豆素组及C6@Sol组荧光强度均有所增加，且在相同孵育时间下，C6@Sol组的荧光摄取量较游离香豆素组比更为显著。C6@Sol组在1 h左右摄取量达到饱和状态，而游离香豆素组在此时间的荧光摄取量是C6@Sol组的1/3左右。由图9-A可知以空白组为对照，3组在同一标尺下计算荧光强度，其结果如下：C6@Sol组的细胞摄取荧光强度与摄取时间呈正相关： 0.5 h（9.67 %），1 h（97.25 %），2 h（99.56 %），游离香豆素组细胞摄取荧光强度与摄取时间呈正相关：0.5 h（8.17 %）,1 h（33.59 %），2 h（46.30 %），结果显示在相同孵育时间下，4T1细胞对于C6@Sol组的摄取率较游离香豆素组比更为显著。图9-B荧光摄取强度柱状图更加直观地展现了这一结果。由此可知C6@Sol组与游离香豆素组相比，具有较为显著的吸收与利用优势。
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Figure 9. Effects of different dosing groups on uptake of 4T1 cellsA: Cellular uptake of varying formulations；B: Quantitative analysis of fluorescence intensity for different time ($ \bar{x} $ ± s, n = 3） *P< 0.053.7 靶向性评价结果
由图10可知，与游离DiR组相比，DiR@Sol组在给药1 h后，荧光信号迅速到达肿瘤部位，并随着给药时间的延长，荧光信号逐渐增强，而游离DiR组在肿瘤组织始终没有荧荧光信号分布。由给药24 h后小鼠离体的器官解剖成像图进一步进行验证了DiR@Sol组在肿瘤部位有着较强的荧光信号分布，而游离组在肿瘤组织中无荧光信号分布，由此可知这一实验结果与小鼠活体拍摄结果保持一致。此外DiR@Sol组除肿瘤组织具有较强的荧光信号外，其肝脏、脾脏中出现了荧光信号的蓄积，但荧光强度远低于无载体修饰的DiR组，其产生原因与巨噬细胞的非特异性清除有关[23]。综上可知DiR@Sol组对肿瘤组织具有良好的靶向性能的同时还能具有较低的药物滞留效应，有助于药物在肿瘤组织中的累积、减少药物在脏器组织中的残留。
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Figure 10. In vivo and in vitro fluorescence imaging and fluorescence intensity in tumor-bearing mice ($ \bar{x} $ ± s, n = 3）*P< 0.054. 总 结
本研究针对CTD递送系统普遍存在的不足制备了CTD@Sol，其包封率为（90.29 ± 1.69）%、载药量为（45.00 ± 0.84）%，并且粒径均匀、稳定性良好，体内、外相关实验研究表明，CTD@Sol具有良好的生物安全性的同时还能很好的改善药物在体内的组织分布、提高药物对肿瘤组织的靶向性。另外，该系统具有显著的酸敏感性和强释药潜力，降低CTD的在递送过程中的泄漏。综上，本研究成功制备了CTD@Sol，为CTD的进一步开发与利用提供了研究基础，也为天然药物抗癌研究提供了新的思路。
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