CAR-T新型联用策略治疗实体瘤研究进展
Research progress of CAR-T immunotherapy in solid tumors combined with new strategies
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摘要: 近年来，嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）疗法在血液肿瘤的治疗中取得了突破性进展，但是在实体瘤的治疗中仍然存在着诸多问题，例如CAR-T细胞渗透性差，易发生T细胞耗竭现象、脱靶效应等，故实体瘤的CAR-T疗法需要提出新的治疗策略来提升治疗效果。与单一CAR-T治疗方式相比，CAR-T联合其他肿瘤治疗手段已经在临床前及临床研究中展现出优异疗效。本篇综述总结了CAR-T联用不同肿瘤治疗方法：抗体药物、溶瘤病毒、肿瘤疫苗、纳米药物应对实体瘤治疗的研究进展，以期为开发新的CAR-T联用策略治疗实体瘤提供理论依据和新思路。Abstract: In recent years, the chimeric antigen receptor T-cell (CAR-T) therapy has achieved breakthrough progress in the treatment of hematologic malignancies. However, when it comes to solid tumors, numerous challenges persist.These include limited CAR-T cell infiltration, susceptibility to T cell exhaustion, off-target effects, and more.Thus, novel therapeutic strategies are imperative to enhance the efficacy of CAR-T therapy for solid tumors. In comparison to standalone CAR-T approaches, the combination of CAR-T with other tumor treatment modalities has demonstrated remarkable effectiveness in both preclinical and clinical research.This review article summarizes the advancements in combining CAR-T with various solid tumor treatments: antibody drugs, oncolytic viruses, tumor vaccines, and nanomedicines.The objective is to furnish a theoretical foundation and novel perspectives for the development of innovative CAR-T combination strategies tailored for solid tumor therapy.
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溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种反复发作和缓解的炎症，属于自身免疫性疾病[1]。结肠炎的并发症可能是局部的，比如痔疮、肛周脓肿或肛裂；但由于肝肠循环的存在，也可能出现肠外表现，如肝病（脂肪肝、慢性肝炎、肝硬化和硬化性胆管炎等）[2]。对于患有肝脏疾病的结肠炎患者，其预后复发及其发展为结肠炎相关性结肠癌的风险会提高，且UC所致的肝损伤的发病机制尚不完全清楚[3]。
胆碱作为一类必需营养成分，可从饮食中获取，如肉、蛋类，也可由宿主自身合成。胆碱参与到脂质代谢、胆汁与胆固醇的肝肠循环与表观遗传学的调控等重要生物化学过程[4−6]。胆碱相关代谢通路如图1所示，主要分为4条，包括合成乙酰胆碱、甜菜碱、磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）和三甲胺（trimethylamine，TMA）。胆碱代谢在结肠炎发生到恶化过程中起到非常关键的作用。异常的胆碱代谢可作为肿瘤形成与癌症进程的代谢特征[7]。肠道菌群代谢胆碱产生TMA[8]，TMA转运至肝脏中，在肝脏内被代谢生成氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO）。肠道炎症状态下，过多的胆碱代谢成有毒的TMA，这类转化会导致宿主对胆碱的使用率减少，降低宿主胆碱的生物利用度。当宿主缺乏胆碱时，可导致磷酸化系统效率降低，肝脏脂肪变性[9]；在此过程中，还伴随有线粒体功能异常，复合物Ⅰ受到限制，肝细胞产生过量的活性氧，从而导致细胞凋亡信号的传导[10]。因此，胆碱的生物利用度降低或者摄入过低会导致非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）的发生。
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Figure 1. Pathways for the choline metabolism; 3,3-dimethyl-1-butanol(DMB) suppress trimethylamine(TMA) levels from choline conversionChAT:Choline acetyltransferase;CHDH:Choline dehydrogenase;CK:Choline kinase;CPT:Choline phosphotransferase;CT:Phosphocholine cytidylytransferase; FMO3:Flavin monooxygenase; PLD:Phospholipase D临床研究中发现UC患者的肠道黏膜会损失掉近70%的PC，肠道微生物可以使用磷脂酶D水解PC，而后形成大量的游离胆碱。结合本课题组前期研究发现，肠道炎症会促进PC水解，生成大量游离胆碱，继而菌群紊乱会导致过多的胆碱转化为TMA，宿主的胆碱生物利用度下降，容易造成肝脏损伤，发展为NAFLD[11]。而3, 3-二甲基-1-丁醇（3,3-dimethyl-1-butanol，DMB）作为胆碱结构类似物，可诱导肠道中TMA裂解酶的非致死抑制来降低胆碱转化为TMA的水平，最终降低血浆中的TMAO，提高宿主的胆碱生物利用度。这一发现为治疗TMA相关病症，如非酒精性脂肪肝炎及心血管疾病提供了新的治疗方向[12]。
鉴于DMB的结构特征，它可能是相对无毒的，并且作为一种天然产品存在于现有的食品或酒水饮料中。参考“Drugging the gut microbiota”的概念，借助DMB，抑制肠道内胆碱转化为TMA，提高胆碱生物利用度，考察DMB能否改善结肠炎及继发性肝损伤。本研究建立了胆碱代谢的定量方法，用于检测葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）诱导的UC小鼠体内的胆碱代谢变化，进一步明确服用DMB后对肠道菌群与宿主的胆碱代谢所产生的影响。
1. 材 料
1.1 试 剂
通用型组织固定液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；葡聚糖硫酸钠（美国MP Biomedicals公司）；丙氨酸氨基转移酶（ALT/GPT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST/GOT）与碱性磷酸酶（AKP）测试盒（南京建成生物工程研究所）；乙腈（质谱级）、甲醇（质谱级）、甲酸（色谱级）、甲酸铵（色谱级）、胆碱（99%）、乙酰胆碱（99%）、三甲胺盐酸盐（98%）、甜菜碱（98%）、卵磷脂（98%）、三甲胺N-氧化物二水合物（98%）、DMB与二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）（纯度99%）（上海阿拉丁生化科技公司）；氯化胆碱-（三甲基-d9）（纯度98%，美国Sigma-Aldrich公司）。
1.2 仪 器
UHPLC systemQsight LX50液相色谱仪、Qsight 220质谱仪（美国PerkinElmer公司）；组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；5415D离心机、移液器（1000/200/50/10 μL）（美国Eppendorf仪器有限公司）；NanoZoomer 2.0 RS数字病理切片扫描仪（日本Hamamatsu公司）；BP 211D精密天平（德国Satorius有限公司）；酶标仪（美国Bio-Tek公司）。
1.3 动 物
雄性C57BL/6J小鼠，6~8周龄，体重16~20 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于中国药科大学动物实验中心。所有动物研究均遵循国际医学伦理规范，并经中国药科大学动物伦理委员会批准。
2. 方 法
2.1 急性结肠炎造模与样本收集
将小鼠适应性饲养1周，根据体重随机分为4组，依次为空白对照组（Control）、模型组（Model）、DMB低剂量组（DMBL）及高剂量组（DMBH），每组10只。（1）空白对照组：常规饲料喂养，正常饮水；（2）模型组：本实验所用模型是为期10 d的急性小鼠UC模型。第1天开始自由饮用2.5% DSS水溶液，持续7 d，每天更换新的DSS溶液，第8天撤掉DSS溶液，换为正常饮用水，持续3 d；（3）DMB高低剂量组：结合文献和DMB的毒性调研，其对啮齿类动物的半数致死量为350~500 mg/kg，称取相应质量的DMB溶液，溶于DSS溶液中，配制成0.1%和0.3%的浓度（即100 mL 0.1 g和0.3 g），低剂量为100 mg/kg，高剂量为300 mg/kg。
在动物实验的整个过程中，每天观察小鼠的精神状态、饮食、粪便性状及体重并进行记录。三者综合进行疾病活动指数评分（DAI）[13]。每个参数的评分0~4：体重减轻（0，<5%；2，6%~10%；4，>10%）；粪便黏附度（0，正常粪便；2，粪便松散；4，腹泻）；直肠出血情况（0，正常粪便；2，粪便中带血丝或黑褐色粪便；4，红棕色或暗红色血便）。DAI=（粪便黏附度评分+直肠出血情况评分+体重减轻评分）/3。
第9天对所有组小鼠做禁食处理，第10天采用摘眼球取血法，血样在室温下静置，4 ℃下3000r/min离心15 min，轻轻吸取上层淡黄色血清，将血清置于−80 ℃冰箱中保存。收集完血清样本之后，将小鼠脱颈椎处死，打开腹腔，分别收集结直肠、结肠内容物、肝脏样本放入干净EP管中。结肠与肝脏组织固定部位剪下，分别放入通用型组织固定液中用于苏木精-伊红（HE）染色。其余结肠与肝脏分别放入对应的EP管中，置−80 ℃保存，用于后续的实验。HE染色送样至中国药科大学病理与PDX药效评价平台。参照Morris标准评分[14]，求和并取均值：0，结肠组织正常；1，轻度炎症，固有层炎症浸润，基底1/3受损；2，中度炎症，黏膜及黏膜下层炎症浸润，基底2/3受损，表面上皮完整；3，重度炎症，透壁，整个隐窝和上皮丢失。
2.2 酶标仪法检测小鼠血清中ALT、AST及碱性磷酸酶
参考南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒说明书，检测各组小鼠血清中ALT、AST的活力。按照说明书添加试剂，测定各孔在510 nm波长处的吸收度。利用绘制的标准曲线计算出各血清样本中的酶活力。参考试剂盒说明书，检测各组小鼠血清中AKP的水平。按照说明书添加试剂，然后立即测定各孔在520 nm波长处的吸收度。
2.3 UPLC-QQQ-MS/MS测定小鼠肝脏、血清与肠道内容物中的胆碱代谢
2.3.1 样品前处理
血清样品：取血清样品5 μL置于1.5 mL离心管，加入80%乙腈（含0.1%甲酸）100 μL提取，涡旋10 min，超声10 min，高速离心（13000 r/min，10 min），取上清溶液50 μL。氮气吹干之后，用复溶液（含有内标的提取溶液）100 μL溶解，高速离心，取上清液10 μL置于内衬管，加复溶液90 μL，待测。
肝脏样品：取肝脏组织样品10 mg置于2.0 mL离心管，加入80%乙腈（含0.1%甲酸）400 μL提取，涡旋10 min，超声10 min，高速离心，取上清溶液20 μL。氮气吹干之后，用复溶液200 μL溶解，高速离心，取上清液50 μL置于内衬管，加复溶液50 μL，待测。
肠道内容物样品：取内容物样品2 mg置于2.0 mL离心管，加入80%乙腈（含0.1%甲酸）400 μL提取，涡旋10 min，超声10 min，高速离心，取上清溶液20 μL。氮气吹干之后，用复溶液100 μL溶解，高速离心，取上清液50 μL置于内衬管，加复溶液50 μL，待测。
2.3.2 方法学考察
线性考察：溶剂标曲和基质标曲的梯度浓度样品，按照从低浓度到高浓度分别测定之后，以待测物和内标峰面积的比值为纵坐标，以待测物浓度作为横坐标求得线性回归方程（溶剂标准曲线和基质标准曲线）。
定量限与检测限：取信噪比大于10的浓度点，平行测量6次，RSD小于20%的样品浓度作为定量限。继续稀释，平行测量6次，直到信噪比大于3，RSD小于20%的样品浓度作为检测限。
基质效应：通过修正性t检验来进行验证，比较溶剂标曲与基质标曲的斜率是否存在显著性差异，来进行评估。算出t-value后，根据自由度，核对（t-test）临界值表，判断是否存在显著性差异[15]。
精密度和准确度：取基质标曲中，低、中、高浓度质控样品，1 d内重复测定6次，带入基质标准曲线计算浓度c，计算c和空白样品的相对误差（relative error，RE），求6次测量的平均值作为日内准确度，RSD作为日内精密度；在3 d内对选定的3个浓度进行重复测定9次，以9次测量的平均值作为日间准确度，RSD作为日间精密度。
回收率：按照此公式进行计算recovery= (cs — cn)/ct × 100%，将低中高浓度质控样品，分别带入空白溶剂标准曲线计算浓度cs，cs为加标的QC样品，cn为不加标的空白样品，ct为标准品加入的理论浓度[16]。
2.3.3 UHPLC-QQQ-MS/MS分析
色谱条件：UHPLC采用液相色谱仪Qsight LX50，色谱柱为Acquity BEH HILIC（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相（A）：0.1%甲酸和10 mmol/L甲酸铵的水溶液；流动相（B）：乙腈。梯度洗脱程序：1~2 min，80%~75%B；2~3 min, 75%~65%B；3~5 min, 65%~50%B；5~5.5 min, 50%~40%B；5.5~6.0 min，80%B。柱温：35 °C；流速0.2 mL/min。进样量：2 μL。
质谱条件：采用质谱仪Triple QuadQsight 220，ESI离子源，利用正离子MRM多重反应监测模式对待测物进行定量。离子对及电压参数见表1。
Table 1. MRM transition parameters, LLOD, LLOQ, and RSD for the targeted analytes in choline metabolismAnalyte MRM DPa CEb Sensitivity LLOD/
(ng/mL)RSD LLOQ/
(ng/mL)RSD TMA 60.1>45.1 25 20 2 16.95 5 10.34 TMAO 75.9>59.1 40 30 0.5 16.39 2 7.74 CHO 104.0>45.0 100 35 0.005 19.05 0.05 14.24 CHO-D9 (IS) 113.1>69.0 100 35 ACH 147.2>88.0 70 20 0.05 14.69 0.1 14.91 Bet 118.1>59.1 120 30 0.1 8.46 0.5 7.97 PC 758.2>86.0 130 40 5 14.56 10 12.66 DMPC (IS) 678.4>86.0 130 40 a:Declustering potential;b:Collision energy
TMA: Trimethylamine; TMAO: Trimethylamine N-oxide; CHO: Choline; Bet: Betaine; PC: Phosphatidylcholine; ACH: Acetylcholine; CHO-D9: Chloride-(trimethy-d9) choline; DMPC: 1 2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine2.4 统计分析
数据使用SPSS 19.0软件和GraphPad Prism 8软件进行统计学分析，采用$ \bar{x}\pm s $表示。两组独立样本的均值比较使用Mann-Whitney U检验进行显著性差异检验，P < 0.05表示具有显著性差异，P < 0.01和P < 0.001表示差异极显著。
3. 结 果
3.1 饮用DMB溶液能够缓解小鼠结肠炎
整个实验过程中，正常对照组小鼠体重稳定增长，饮食饮水量均正常，粪便正常，为棕黄色成型软便。UC模型组自由饮用2.5%的DSS溶液3 d后，体重下降缓慢，第4天呈现显著下降，且开始出现便血，粪便呈稀状。第5天开始，体重下降与便血情况更加严重，小鼠后期的肛周可见血痂，表明UC小鼠模型造模成功。DMB高低剂量组能够有效缓解由结肠炎导致的体重下降（图2-A）。在造模过程中，DMB组的小鼠的生存情况要明显好于模型组。不同组别的小鼠结肠长度如图2-B所示。造模结束后，正常组小鼠肠壁光滑透亮，无增厚或增生的情况，未见明显充血，各个肠段形态正常，结肠内容物成型。模型组小鼠结直肠长度明显缩短，结肠内容物不成型，出现血便，腥臭（图2-C）。DMB低剂量组小鼠结肠长度要明显长于模型组，结肠萎缩及充血现象得到明显改善。DMB高剂量组的小鼠结肠长度有一定恢复，但没有显著性差异。
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Figure 2. Influence of oral DMB on colitis miceA: Percentage change chart of body weight; B: Mean colon length of each group; C: Representative images in each group; D: DAI score of each group (*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs model group; n ≥ 6 )3.2 DMB改善结肠炎小鼠的结肠病理
正常对照组小鼠结肠黏膜上皮细胞完整，隐窝正常并且可见许多杯状细胞，固有层腺体形态正常且排列整齐，未见炎性细胞浸润，无变形坏死。UC模型组小鼠结肠组织表现为严重的病变，黏膜下层炎症，表现为隐窝畸形，结肠黏膜明显变薄，黏膜上皮缺损且杯状细胞严重破坏，并且肌层出现大量炎性细胞的浸润。与模型组相比，DMB高低剂量干预组小鼠结肠状况恢复良好，结肠黏膜下层水肿减轻，黏膜上皮细胞恢复完整并且可见部分杯状细胞，DMB干预能明显减轻结肠炎状况（图3）。
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Figure 3. Hematoxylin and eosin staining of colon tissues and histological score in each group*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs model group; n ≥ 6 per group3.3 DMB溶液改善结肠炎小鼠的肝脏病理与肝脏生化指标
通过肝脏病理表明，正常组肝细胞分布均匀，排列正常，细胞核位于细胞中央，包浆内颗粒感不明显。模型组肝细胞水肿，肝小叶结构紊乱，肝索拥挤；肝细胞肿大，肝囊扭曲、狭窄、闭塞，肝细胞包浆疏松变孔，呈网状或透明，胞核悬浮于中央，染色变浅，双核细胞发生率增加，提示肝脏疾病严重。DMB组的肝脏病理切片结果趋近于正常对照组，表明DMB能缓解由结肠炎导致的肝损伤（图4-A）。
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Figure 4. DMB intervention ameliorated secondary liver injuryA: Hematoxylin and eosin staining of liver tissues of each group; B: Alanine transaminase(ALT), aspartate aminotransferase(AST) and alkaline phosphatase(AKP) activity in plasma*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001, vs model group; n ≥ 6 per group进一步表征结肠炎对肝功能的影响，测定了DSS诱导的模型组小鼠的血清中ALT、AST和AKP水平，如图4-B所示，结果显示与空白对照组相比，UC小鼠的血清中ALT和AST水平显著升高，提示肝功能异常，DMB组回调了这两项指标。UC导致血清中AKP的水平出现明显下降，但DMB对其改变不明显。
3.4 胆碱代谢通路测定的方法学考察
线性考察结果见表2，两条标准曲线拟合指数R2均大于0.99，说明具有良好的线性关系。在定量范围内，待测物的响应和浓度线性关系良好，能够保证该方法计算内容物中各个代谢物浓度的准确性。定量范围适中，能够满足不同浓度样品的测定。
Table 2. Solvent-only and matrix-matched calibration curves and R2 of samplesCompd. Solvent-only Matrix-matched Dynamic range/
(ng/mL)Calibration curves R2 Calibration curves R2 Intestinal contents TMA y = 0.0017x + 0.0057 0.995 3 y = 0.0015x + 0.0349 0.998 0 3.75−375 TMAO y = 0.0143x + 0.037 0.998 9 y = 0.0130x + 0.0393 0.998 0 1.25−125 CHO y = 0.0115x – 0.0073 0.999 7 y = 0.0112x + 1.9279 0.9978 5−500 ACH y = 0.0028x – 0.001 0.998 0 y = 0.0027x + 0.0025 0.9931 0.5−50 Bet y = 0.0383x + 0.0576 0.9993 y = 0.0343x + 0.9758 0.999 0 1−100 PC y = 0.7703x + 0.0217 0.9975 y = 0.5176x + 1.1683 0.9939 12.5−12500 Liver TMA y = 0.0095x + 0.0038 0.9997 y = 0.0089x + 0.1968 0.9972 1.25−125 TMAO y = 0.0162x + 0.0402 0.9988 y = 0.0150x + 0.0329 0.9988 1.25−125 CHO y = 0.0116x + 0.0227 0.9999 y = 0.0118x + 1.8986 0.9976 10−1000 ACH y = 0.0013x – 0.0007 0.9992 y = 0.0013x + 0.0021 0.9937 1.25−125 Bet y = 0.0181x + 0.0481 0.9993 y = 0.0176x + 5.1867 0.9955 4−400 PC y = 0.4209x + 0.1404 0.9943 y = 0.3533x + 11.624 0.9918 300−30000 Serum TMA y = 0.0057x + 0.0197 0.9955 y = 0.0053x + 0.0192 0.998 0 1.8−180 TMAO y = 0.0159x + 0.0761 0.9982 y = 0.0150x + 0.0502 0.9998 2.25−225 CHO y = 0.0129x + 0.0068 0.9999 y = 0.0134x + 0.9229 0.9995 6.75−675 ACH y = 0.0028x – 0.0006 0.9981 y = 0.0028x + 0.0005 0.998 0 0.9−90 Bet y = 0.0395x + 0.1593 0.9986 y = 0.0371x + 0.8011 0.9997 4.5−450 PC y = 0.0006x + 0.0775 0.995 0 y = 0.0004x + 3.3674 0.9967 90−9000 该方法的灵敏度用定量限和检测限表示，如表1所示，LLOD在0.005~5 ng/mL范围内，相对标准偏差在8.46%~19.05%之间，LLOQ水平在0.05~10 ng/mL之间，相对标准偏差在7.74 %~14.91%之间。
如表3所示，日内精密度RSD在1.44%~13.33%之间，日间精密度RSD在1.21%~14.45%之间，说明仪器在检测时间内稳定。日内、日间准确度分别在−18.76%~18.63%和−17.42%~18.58%之间，说明应用该方法定量表征血清、肠道内容物及肝脏中胆碱类生物标志物的准确度良好。
Table 3. Methodological observations including precision and accuracy, recovery and matrix effects resultsAnalyte Added/
(ng/mL)Matrix effect Recovery Intraday Interday t-value Mean/% RSD/% Accuracy/% Precision/% Accuracy/% Precision/% Intestinal contents 15 101.01 8.87 −6.23 6.60 −3.61 14.45 TMA 112.5 0.270 3 100.50 4.12 9.05 5.27 8.29 5.21 187.5 105.43 6.29 9.60 7.95 10.40 9.62 5 90.90 10.79 4.12 6.33 2.30 6.03 TMAO 37.5 0.1574 102.91 4.94 7.61 7.39 6.44 6.95 62.5 105.53 7.33 3.58 2.92 4.43 4.52 20 103.49 6.02 −9.57 3.31 −6.62 2.92 CHO 150 0.0221 97.78 9.96 −8.75 4.37 −9.17 3.24 250 90.76 6.10 −2.45 4.87 −5.47 5.08 2 105.14 6.73 −1.71 13.33 5.14 4.67 ACH 15 0.0493 101.74 5.70 1.74 5.33 1.74 5.37 25 116.08 4.01 18.63 3.69 17.33 4.45 4 89.97 9.39 −17.39 2.62 −14.80 2.64 BET 30 0.2426 97.01 4.44 −1.92 1.76 1.97 3.97 50 101.98 6.18 3.11 4.42 −2.73 2.17 50 95.34 9.21 14.74 7.99 −9.03 8.34 PC 375 0.3543 86.83 6.45 −0.83 8.41 4.89 8.25 625 108.79 9.52 −5.41 3.40 −12.20 2.45 Liver 5 102.47 10.80 −18.76 8.67 −9.70 5.82 TMA 37.5 0.1256 89.42 7.39 −1.78 5.43 −0.49 4.72 62.5 100.64 5.70 −13.82 12.16 −16.83 11.10 5 97.05 7.78 7.09 5.16 8.26 4.79 TMAO 37.5 0.1275 96.94 4.75 −3.98 5.12 −2.98 4.21 62.5 93.64 3.49 −3.90 3.65 −4.63 3.05 40 112.08 5.20 17.38 6.02 11.81 2.68 CHO 300 0.0248 101.53 2.61 −5.49 1.76 −5.32 1.80 500 101.44 2.09 −9.76 1.80 −9.39 1.71 5 114.08 6.74 17.77 7.92 14.91 5.56 ACH 37.5 0.0160 98.90 9.06 −2.11 8.36 −1.26 8.33 2 96.19 5.70 −7.23 12.01 −6.09 12.78 16 87.37 8.87 4.21 3.15 13.73 3.27 BET 120 0.0392 102.23 5.56 −4.06 3.93 −5.54 3.65 200 94.45 9.36 −2.06 3.01 2.23 1.63 1200 104.40 11.21 −8.68 11.10 −14.11 11.17 PC 9000 0.1895 89.23 6.76 0.25 9.22 −8.62 8.02 15000 100.80 13.85 7.64 6.81 0.97 6.05 Serum 7.2 80.61 9.82 −8.49 7.33 −11.82 4.36 TMA 54 0.1574 89.53 1.90 −8.46 1.73 −8.36 1.91 90 96.75 4.49 −2.05 4.26 −0.62 2.45 9 94.67 6.13 −4.87 4.39 −3.41 3.55 TMAO 67.5 0.2001 97.22 2.93 −2.71 2.79 −3.37 2.42 112.5 99.08 1.48 −0.87 1.44 −0.75 1.53 27 90.24 12.61 −9.60 5.87 7.13 10.52 CHO 202.5 0.0580 97.89 2.75 −0.67 2.02 0.17 1.21 337.5 99.75 2.07 0.60 1.70 0.85 1.76 3.6 82.76 10.97 −17.24 10.35 −17.42 7.98 ACH 27 0.0000 97.06 3.61 −2.93 3.59 −4.00 2.26 45 97.24 5.02 −2.75 5.00 −2.86 5.16 18 95.90 5.94 −4.09 2.63 −3.40 2.73 BET 135 0.1404 99.76 2.40 −0.23 2.07 −0.49 2.17 225 101.85 2.44 1.85 2.23 1.77 2.44 360 86.66 4.24 −10.91 3.58 4.86 3.27 PC 2700 0.5438 95.69 9.71 0.03 2.25 2.25 1.90 4500 111.36 11.95 14.75 5.98 18.58 5.36 在基质效应的评估中，t-value所对应的P都小于0.05所对应的临界值，说明基质标曲与溶剂标曲的K不存在显著性差异，说明基质效应对该方法干扰较小。在回收率评估中，均值在80.61%~114.08%之间，满足80%~120%的要求。
3.5 DMB对结肠炎小鼠体内胆碱代谢的影响
胆碱是宿主必需的膳食营养物质，是合成神经递质乙酰胆碱、细胞膜脂质卵磷脂和鞘磷脂，以及甲基供体——甜菜碱所必需的[17]。DSS诱导的UC小鼠肠道内容物中的胆碱与PC水平显著性升高，其来源可能是因为由于结肠黏膜损伤，黏膜屏障的PC严重流失，肠道菌群过度水解PC，产生游离胆碱[18]。该发现与临床研究相一致，黏膜损伤导致大量的PC水解为胆碱，过多的胆碱转变为TMA。在模型组的肠道内容物中，TMA、胆碱与卵磷脂含量均发生显著性增加（图5-A）。
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Figure 5. Bar graph of choline metabolism-associated metabolites quantificationA: Intestinal contents; B: Liver; C: Serum *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001 vs model group; n ≥ 6 per groupDMB组小鼠同时服用DSS与DMB混合的溶液后，其肠道内容物中的胆碱代谢通路变化明显，DMBL组回调了TMA、胆碱与卵磷脂的水平，如图5-A所示。有研究表明，含有胆碱的前体物质（如胆碱、甜菜碱、PC等）也能够产生TMA，DMB能够抑制这些TMA的前体物质的产量。但在结果中仅观察到模型组的甜菜碱含量显著性增加，DMB组对其存在一定的下调趋势，但不具有显著性差别。在DMB减少TMA生成的同时，肠道内的生成TMA的前体物质的含量也发生减少，由此可以推断服用适当剂量的DMB能够减少肠道胆碱的不良转化，提高宿主的生物利用度。
肠道菌群代谢胆碱形成TMA，TMA在肝脏中被氧化形成TMAO，这一代谢过程在非酒精性脂肪肝炎的发展中起到重要作用。如图5-B所示，TMA在DSS诱导的结肠炎模型组的肝脏中出现了显著增加，其主要来源于肠道胆碱类物质的转化。DMB高低剂量组均显著抑制了肝脏中的TMA含量。DMB口服后，TMAO的含量也在低剂量组显著下降，但高剂量组下降没有形成显著性差异。模型组肝脏中胆碱水平呈现下降趋势，但不具有显著性差异。
血清中的胆碱代谢变化是肝脏与肠道内容物的集中反映。在结肠炎的发生过程中，血清中也出现了TMAO的含量增加，补充DMB可显著降低血浆TMAO水平。除此以外，模型组血清中的胆碱与甜菜碱含量明显升高，DMB高低剂量组均有一定的回调作用，如图5-C所示。从组织整体性来看，DMB对肠道内胆碱代谢通路的改变最为明显，可以推测其作用靶点在肠道菌群代谢。
4. 讨 论
胆碱代谢在UC发生到严重化过程中起到非常重要作用。UC发生后，肠道内的胆碱类代谢物的变化比较复杂。除TMA外，胆碱的其他代谢物，如甜菜碱和卵磷脂的含量也在模型组中升高了。在人类饮食和人体中最丰富的胆碱形式是PC。除了10~20 g PC作为胆汁成分引入胃肠道腔外，PC还占食物中总胆碱含量的50%以上[17]。PC也被确定为结肠上皮黏膜层的主要脂质成分。在临床研究中，UC患者的黏膜屏障的磷脂酰胆碱部分可减少70%，过量的肠道微生物磷脂酶活性可能加速黏膜降解，继而释放更多的游离胆碱来影响TMA的产生[19]。本次研究为阐明肠道菌群的胆碱代谢对UC病情进展的影响提供了一个起点，并且补充说明了炎症导致的肠道菌群失调，对胆碱代谢的影响是多位点的。同时也说明了DMB遏制胆碱转为TMA，有助于改善UC的症状。
DMB作为一种非致命的微生物酶靶向抑制剂的治疗剂，其在理论上的优势是比抗生素产生耐药性的选择性压力更小。然而，肠道微生物群被认为是非常动态和适应性的，包括对不同的饮食输入的反应以及特定疾病的变化。从研究结果来看，在DMB减少TMA生成的同时，肠道内的包含胆碱的前体物质的含量也发生减少，由此可以推断服用适当剂量的DMB能够减少胆碱的肠道消耗，提高宿主的生物利用度。这样的研究发现不仅局限于心脑血管疾病中，也存在DMB抑制结肠炎及其所致肝损伤中。另外也有研究表明，高果糖诱导的高血压与血清中上升的TMAO相关，而补充DMB能够减少血清中TMA、TMAO、乙酸及丙酸水平[20]。靶向肠道微生物源代谢物TMAO和短链脂肪酸，早期干预高血压进程，对降低高血压有显著影响[21]。近期还有研究报道，在系统性红斑狼疮小鼠模型中，检测到激活后血浆TMAO水平升高，服用DMB后，肠道细菌TMA降低，血浆TMAO水平也得到抑制。DMB能够降低系统性红斑狼疮的疾病活动性，提示它是一种潜在的治疗药物[22]。除此之外，微生物的胆碱利用会影响成年小鼠多个组织的DNA甲基化模式，同时增加肥胖的风险；且TMAO水平也与内脏脂肪量呈正相关[23]。综合近期研究与本次研究结果发现，肠道细菌能够将胆碱转化为TMA，不仅会增加血浆中TMAO的水平，还会降低胆碱及其下游单碳代谢产物的生物利用度[24]。DMB在一定程度上提高胆碱的生物利用度，其作用的靶点很大可能在于抑制肠道胆碱的不良转化。
5. 结 论
本研究靶向胆碱的肠道菌群代谢，使用DMB作为药物，发现了DMB对于UC有较为明显的缓解作用。研究中建立了体内胆碱代谢通路的检测方法，考察了3类生物样品中胆碱相关代谢物的变化：DMB对肠道内容物中胆碱代谢通路的改变最明显，其次是血清，最后是肝脏。在本研究设计初期，是根据DMB能够抑制胆碱转化为TMA的特性，减少肠道菌群与宿主竞争胆碱，提高其生物利用度，缓解结肠炎所导致的肝脏损伤。但研究结果表明，抑制胆碱转为TMA，提高胆碱的生物利用度，对肠道及宿主代谢的影响更为重要。控制肠道菌群对TMA前体物质的利用率，能够有效缓解结肠炎的恶化，从而降低由于严重的肠道病变导致肝脏受损。胆碱的摄入以及体内的生物利用度对维持人体健康，控制疾病发展起到非常关键的作用。胆碱代谢属于肠道菌群与宿主的相互作用，对其建立有效的评估方式能够对疾病进行更准确的评估。
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