Screening of adjuvant for PD-L1 vaccine based on nitrated T cell epitope
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摘要:
为了充分发挥本课题组前期设计的基于硝基化T表位的靶向PD-L1的肿瘤疫苗（PD-L1-NitraTh）的抑瘤活性，选择了作用机制不同的几种佐剂进行比较，以期筛选出最适用于此类疫苗的佐剂。研究结果显示，Poly(I:C)、CPG1018、肿节风多糖SGP2及GM-CSF等佐剂均可以提高PD-L1-NitraTh疫苗的免疫原性，其中，Poly(I:C)组诱导产生的抗体滴度最高。对T细胞分化相关转录因子的qPCR检测结果显示，Poly(I:C)减少了GATA3和FoxP3的表达，提示对CD4+T细胞分化有较强的影响。同时，相比其他佐剂，Poly(I:C)可以辅助PD-L1-NitraTh增加肿瘤内T淋巴细胞以及CD11b+细胞浸润，提示 Poly(I:C)佐剂可能适用于以硝基化T表位为基础的肿瘤疫苗。
Abstract:To enhance the anti-tumor activity of tumor vaccine targeting PD-L1 based on the nitrated T-epitope (PD-L1-NitraTh), this research compared several adjuvants with different mechanisms to screen out the adjuvant most suitable for PD-L1-NitraTh. The results showed that Poly(I:C), CPG1018, swollen knotted polysaccharide SGP2 and GM-CSF could enhance the immunogenicity of PD-L1-NitraTh when used as adjuvants, with the Poly(I:C) group inducing the highest antibody titer. The results of qPCR for T cell differentiation-related cytokines showed that Poly(I:C) reduced the expression of GATA3 and FoxP3, indicating a strong effect on CD4+ T cell differentiation. Besides, compared with other adjuvants, Poly(I:C) could assist PD-L1-NitraTh to increase the infiltration of T cells as well as CD11b+ cells within tumor, suggesting that Poly(I:C) may be the suitable adjuvant for tumor vaccines based on the nitrated T epitopes.
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Keywords:
- tumor vaccine /
- adjuvant /
- Toll-like receptor /
- Poly(I:C)
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治疗性肿瘤疫苗利用患者的免疫系统诱导产生持续的抗肿瘤免疫能力，从而治疗和预防肿瘤复发及转移[1−2]，由于具备作用特异性强、毒性小、可诱导机体产生免疫记忆等优点而受到广泛的关注[3−5]。佐剂是疫苗的重要组成部分，可以通过增强机体对抗原的免疫应答反应来提高疫苗的保护作用[6]。目前的佐剂大致可以分为5类：（1）矿物盐类佐剂，可以介导强烈的体液免疫，但也因此增加了患者对其产生过敏反应的风险[7]；（2）油乳剂佐剂，能够刺激机体产生很强的细胞和体液免疫，其中弗氏佐剂是目前动物实验中运用最为广泛的佐剂，但其不易被机体代谢，毒性较强[8]；（3）抗原递送类佐剂，该类佐剂可以利用载体控制抗原在免疫系统中的时空呈现, 从而提高疫苗的靶向性并促进疫苗持续释放,但因制备技术性较高，其所需费用也较高[9]；（4）细胞因子佐剂，这类佐剂具有广泛的生物活性，在较低水平时就可表现出生物学活性，但其有一定的剂量相关毒性、免疫原性弱等原因也使其使用受到了一定的限制[10]；（5）靶向模式识别受体的佐剂，模式识别受体在多种细胞上表达，所以机体在自然状态下就可对其产生效应，可以诱发较强的细胞免疫，且生产成本低[11]。不同类型的佐剂以不同的方式刺激免疫系统，因此针对不同的疫苗，其最佳佐剂也各不相同。佐剂的合理使用是影响治疗性疫苗疗效的关键因素之一[12]。
本课题组前期设计了一种基于硝基化表位的PD-L1疫苗PD-L1-NitraTh[13−14]，可以诱导小鼠产生PD-L1特异性的体液免疫和细胞免疫,在小鼠B16F10黑色素瘤肺转移、小鼠CT26结肠癌皮下移植瘤等模型中体现出一定的抑瘤活性。为了筛选出适用于该疫苗的佐剂，本研究分别选择了TLR3激动剂Poly(I:C)、TLR4激动剂肿节风多糖SGP2、TLR9激动剂CPG1018及粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）作为佐剂，对不同佐剂增强PD-L1-NitraTh疫苗免疫原性和抑瘤活性的能力进行比较，为PD-L1-NitraTh疫苗的开发提供有效的佐剂选择。
1. 材 料
1.1 试 剂
CPG1018（北京擎科生物科技有限公司）；Poly(I:C)（美国InvivoGen公司）；肿节风多糖SGP2（课题组前期表达纯化）；GM-CSF（PerpoTech生物科技有限公司）；PD-L1-NitraTh（课题组前期表达纯化）；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；TMB（Solarbio）、EasyPure RNA Kit试剂盒、RPMI 1640培养基（北京全式金生物技术有限公司）；2×Cham Quantity Universal SYBR qPCR Master Mix、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（南京诺唯赞生物科技公司）；肿瘤消化试剂盒（德国美天旎生物技术公司）；红细胞裂解液、APC标记的抗小鼠CD3抗体、PE标记的抗小鼠F4/80抗体、FITC标记的抗小鼠CD11b抗体（美国BD公司）；鼠干扰素-γ ELISPOT试剂盒（德国AID公司）；DMEM高糖培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）；胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）。
1.2 仪 器
Nanodrop ND-2000分光光度计、PCR仪、qQPCR仪QuantStudio、高速冷冻离心机（美国赛默飞公司）；水平离心机( 湖南湘仪离心机仪器有限公司)；Spectra Max 190酶标仪（美谷分子仪器有限公司）；Countstar 全自动细胞计数仪 (上海泽权仪器设备有限公司)；Accuri C6 流式细胞仪(美国BD公司)；Countstar全自动细胞计数仪（上海泽权仪器设备有限公司）。
1.3 动 物
清洁级C57BL/6J雌性小鼠(6~8周龄)购自杭州子源实验动物科技有限公司，合格证号：SYXK(苏)2018−0019。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。
1.4 细胞株
小鼠黑色素瘤细胞株B16F10(中国药科大学江苏省生物药物成药性研究重点实验室保存)。细胞在使用前通过Hoechst染色检测支原体，并且从解冻到植入最多经历3次传代。
2. 方 法
2.1 ELISA检测PD-L1-NitraTh特异性抗血清滴度
将30只6~8周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分为6组，每组5只，每只皮下注射一定剂量佐剂和PD-L1-NitraTh蛋白。具体分组和免疫剂量见表1。每周免疫1次，共3次，最后1次免疫1周后，眼眶取血分离血清。PD-L1-NitraTh蛋白作为抗原包被于酶标条中，37 ℃孵育2 h; PBST清洗5次; 然后每孔用3% BSA 200 μL于4 ℃孵育过夜; PBST清洗5次; 每孔加入稀释后的小鼠血清100 μL; 37 ℃孵育2 h; PBST清洗6次; 每孔用稀释后的HRP标记的山羊抗小鼠 IgG 100 μL，37 ℃ 孵育30 min; PBST清洗6次;加入TMB底物反应液100 μL显色，37 ℃避光孵育15 min; 每孔加入1 mol /LH2SO4 100 μL终止反应，然后，立即在450、630 nm处读取吸收度。
Table 1. Grouping situation and immune dose of miceGroup Dose of
PD-L1-NitraTh/μgAdjuvant Dose of
adjuvant/μgBlank - - - PD-L1 50 - - CPG1018 50 CPG1018 35 Poly(I:C) 50 Poly(I:C) 50 GM-CSF 50 GM-CSF 0.2 SGP2 50 SGP2 200 Blank group was inoculated with saline, PD-L1 group was inoculated with PD-L1-NitraTh only, and the other groups were inoculated with PD-L1-NitraTh mixed with the corresponding adjuvant respectively
GM-CSF:Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ;SGP2:
An acidic polysaccharide from Sarcandra glabra2.2 ELISPOT检测PD-L1-NitraTh特异性T细胞
最后1次免疫1周后，处死小鼠，提取小鼠脾淋巴细胞。准备IFN-γ ELISPOT试剂板，用灭菌的RPMI 1640完全培养基活化30 min。倒弃培养基，随后在各孔中加入对应的刺激物，阳性刺激物每孔 0. 3 µL，刺激用蛋白PD-L1-NitraTh每孔20 µg。接着加入小鼠脾淋巴细胞悬液，每孔2×106个细胞， 37 ℃、5% CO2条件下培养24 h。PBS洗涤5次。加入稀释后的IFN-γ抗体，室温孵育2 h。PBS 洗涤5次，加入显色液避光显色20 min。用去离子水洗涤IFN-γ ELISPOT试剂板正反面及底座终止显色。将板条避光密封保存，酶联免疫斑点分析仪读取数据。
2.3 不同佐剂联合PD-L1-NitraTh抑瘤活性评价
在含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中于37 ℃、5% CO2条件下培养B16F10细胞。每只C57BL/6J小鼠右后肢靠背部接种1× 105个B16F10细胞，当肿瘤体积达到10~30 mm3时，将造模成功的小鼠分为6组，每组5只，每周免疫1次，共3次，分组及免疫剂量见表1。从第0天开始，每2天进行一次体重和肿瘤体积测量。
2.4 qRT-PCR分析不同佐剂联合PD-L1-NitraTh对相关基因表达影响
使用EasyPure RNA Kit试剂盒从小鼠腹股沟淋巴结或肿瘤组织提取总RNA，使用分光光度计进行定量。根据说明书，使用带有gDNA酶的HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR试剂盒将各样本的总RNA逆转录成cDNA。TNF-α、IFN-γ、GATA3、CD11c、CD206、Foxp3、IL-17和β-肌动蛋白的转录水平通过Cham Quantity Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒进行检测。基因特异性引物序列见表2。在以下循环条件下进行定量实时PCR：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s， 60 ℃ 30 s ，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。
Table 2. Primer sequence for PCRGene Forward primer sequence（5′→3′） Reverse primer sequence（5′→3′） TNF-α CCCTCACACTCAGATCATCTTCT GCTACGACGTGGGCTACAG INF-γ ATGAACGCTACACACTGCATC CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC GATA3 CTCGGCCATTCGTACATGGAA GGATACCTCTGCACCGTAGC CD11c CTGGATAGCCTTTCTTCTGCTG GCACACTGTGTCCGAACTCA CD206 CTCTGTTCAGCTATTGGACGC CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC Foxp3 CCCATCCCCAGGAGTCTTG ACCATGACTAGGGGCACTGTA β-actin ACTCCTATGTGGGTGACGAG CATCTTTTCACGGTTGGCCTTAG 2.5 流式细胞术分析不同佐剂联合PD-L1-NitraTh对小鼠瘤内细胞亚群的影响
取适量大小的肿瘤样本，根据肿瘤消化试剂盒说明书将肿瘤组织制备成单细胞悬液，加入红细胞裂解液孵育15 min后用PBS清洗，所得细胞悬液经70 μm筛网过滤，收集滤液。设置单染组、空染组和实验组，每个样本取3×106个细胞，离心后用含有1% BSA的PBS 1 mL重悬，再次离心后加入APC标记的抗小鼠CD3抗体、PE标记的抗小鼠F4/80抗体、FITC标记的抗小鼠CD11b抗体，CD3、F4/80、CD11b单染管分别加入对应抗体，4 ℃避光孵育0.5 h后用PBS清洗，用PBS 600 μL重悬细胞后经200目筛网过滤，通过流式细胞仪进行检测。
2.6 统计学分析
使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析，采用One-Way ANOVA及Two-Way ANOVA进行数据显著性比较，P<0. 05为显著性差异，具有统计学意义。
3. 结 果
3.1 不同佐剂对PD-L1-NitraTh免疫原性的影响
用PD-L1-NitraTh分别与4种佐剂免疫C57BL/6J小鼠后眼眶取血，ELISA法检测血清中抗体滴度。结果如图1-A所示，与对照组相比，各组小鼠均产生了高滴度的PD-L1特异性抗体。由于硝基化T细胞表位的作用，在无佐剂的条件下PD-L1-NitraTh也能诱导PD-L1抗体产生，Poly(I:C)、CPG1018和GM-CSF佐剂组均能使抗体滴度进一步升高，其中Ploy(I:C)佐剂组抗体滴度最高。
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Figure 1. Immunogenicity of PD-L1-NitraTh with different adjuvants ($ \bar{x}\pm s $, n =5)A: Determination of anti-PD-L1 antibody titer in mouse serum; B: Number of IFN-γ ELISPOT spots of mouse spleen cells; C: IFN-γ ELISPOT speckle pattern of mouse spleen cells **P < 0.01,***P < 0.001, ****P < 0.0001为了进一步分析不同佐剂对PD-L1-NitraTh疫苗活性的影响，用PD-L1-NitraTh分别体外再刺激各组小鼠的脾细胞，ELISPOT 检测结果如图1-B所示，与对照组相比，各组小鼠脾细胞均能产生更多的特异性IFN-γ斑点，提示这4种佐剂均能在一定程度上辅助PD-L1-NitraTh诱导小鼠激活更多IFN-γ分泌的效应T细胞。
3.2 不同佐剂对PD-L1-NitraTh抑瘤活性的影响
为验证不同佐剂对PD-L1-NitraTh抗肿瘤活性影响，选择PD-L1高表达的B16F10黑色素瘤细胞株，构建皮下移植瘤模型评价各佐剂对PD-L1-NitraTh疫苗抑瘤效果的影响。结果如图2所示，在给药第21天，无佐剂的PD-L1组与空白对照组相比无显著差异，而Poly(I:C)佐剂组可以显著抑制肿瘤生长（P<0.01）。CPG1018佐剂体现出一定增加抑瘤活性的作用，但与PD-L1组相比差异无统计学意义。
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Figure 2. Antitumor activity of PD-L1-NitraTh with different adjuvants ($ \bar{x}\pm s $, n =5)A:Tumor volume measured from the beginning of PD-L1-NatriTh treatment; B: Volume of the tumors excised after the mice were sacrificed (circle indicates tumor regression; triangle represents the death of the mouse); C: Tumor volume of mice at the end of the experiment**P < 0.013.3 Poly(I:C)对疫苗免疫后小鼠淋巴结内基因表达情况影响
由于抑瘤实验结果显示Poly(I:C)作为佐剂时PD-L1-NitraTh显示出最强的抑瘤活性，通过qPCR分析了Poly(I:C)佐剂组小鼠淋巴结中几种T细胞分化相关转录因子的mRNA水平，结果如图3所示，与PD-L1组相比， Poly(I:C)组显著降低了小鼠淋巴结内Foxp3和GATA3的mRNA水平（P<0.01），而T-bet的mRNA水平没有显著变化。目前研究认为，CD4+ T细胞的分化方向主要是由几种转录因子分别决定的：T-bet控制T细胞分化成为Th1，GATA-3控制T细胞分化成为Th2，而Treg的代表性转录因子是FoxP3[15]，提示Poly(I:C)佐剂可能影响CD4+T细胞分化，减少Treg和Th2的比例，从而提高PD-L1-NitraTh疫苗的抑瘤作用。
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Figure 3. Detection of relevant proteins relative expression levels in lymph node cells by qRT-PCR（$ \bar{x}\pm s $, n =5）A: GATA3; B: Tbet; C: Foxp3**P < 0.013.4 Poly(I:C)增加肿瘤内免疫细胞浸润
为了进一步考察Poly(I:C)对肿瘤组织中免疫细胞浸润的影响，用流式细胞术分析了各组肿瘤组织内各细胞亚群比例的变化。结果如图4所示， Poly(I:C)组小鼠肿瘤中CD3+ T细胞浸润明显增加，与PD-L1组有显著性差异(P<0.05) 。同时，与PD-L1组相比，Poly(I:C)也显著提高了肿瘤内CD11b+细胞的比例(P<0.0001)，提示以Poly(I:C)为佐剂可能有利于改善肿瘤免疫抑制性微环境。
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Figure 4. Detection of tumor-infiltrating immune cells in mouse tumor tissues（$ \bar{x}\pm s $, n =5）A: Frequency of CD11b+ cells in tumor tissues after immunization; B: Frequency of CD3+ cells in tumor tissues after immunization *P < 0.05, ****P < 0.00013.5 Poly(I:C)对疫苗免疫后小鼠肿瘤组织内基因表达情况影响
进一步通过qPCR分析肿瘤内相关基因表达情况，结果如图5所示。与PD-L1组相比，Poly(I:C)组小鼠肿瘤内T-bet、IFN-γ的mRNA表达均有增加趋势，同时Foxp3的mRNA表达有下降趋势。
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Figure 5. Detection of relevant proteins relative expression levels in tumor cells by qRT-PCR（$ \bar{x}\pm s $, n =5）A:Tbet; B:IFN-γ; C: Foxp34. 讨 论
实验室前期设计了一种基于硝基化T细胞表位的PD-L1-NitraTh疫苗，为了使其充分发挥抗肿瘤活性，本研究选择了TLR3激动剂Poly(I:C)、TLR4激动剂SGP2、TLR9激动剂CPG1018以及细胞因子GM-CSF作为佐剂，对各佐剂的作用进行了比较。结果发现TLR3激动剂Poly(I:C)可以有效地增强PD-L1-NitraTh的免疫原性，改善肿瘤免疫微环境，使PD-L1-NitraTh更好地发挥抑瘤作用。
Toll样受体（TLRs）在免疫细胞中广泛表达，用于识别微生物病原体，引发宿主对感染的反应。不同TLR激动剂通过TLR通路的激活诱导细胞因子和共刺激分子的表达，从而激活和指导适应性免疫反应，调节机体免疫功能[16−17]。Poly(I:C)是一种TLR3激动剂，有研究指出，Poly(I:C)可以诱导IFN-γ的分泌增加，而IL-5的分泌不增加，有利于CD4+ T细胞的Th1极化[18]。研究人员发现，TLR3激动剂可以诱导CD4+ T细胞向Th1型分化[19-20]。本研究中，与单用PD-L1-NitraTh相比，Poly(I:C)显著降低了小鼠淋巴结内GATA3的mRNA表达，同时使肿瘤内Tbet、IFN-γ的mRNA表达呈上调趋势，提示Poly(I:C)可能影响CD4+T细胞分化，减少Th2细胞的比例，使Th1细胞比例增加，从而增强PD-L1-NitraTh疫苗的抑瘤活性。
另一方面，Treg细胞是一种免疫抑制细胞，可以通过分泌TGF-β抑制其他免疫细胞功能，肿瘤内Treg细胞增加可以导致患者存活率下降[21]。有研究指出，TLR3受体激动剂可以下调Treg细胞比例[22]，本研究发现，作为TLR3受体激动剂的Poly(I:C)可以显著下调淋巴结内Foxp3的mRNA表达，同时使肿瘤内Foxp3的表达呈下调趋势，可能会降低Treg细胞的比例，与文献报道一致。
另外，通过流式细胞术分析发现，Poly(I:C)作为佐剂时，小鼠肿瘤内CD11b+细胞比例显著上调，CD11b表达于多种免疫细胞，包括NK细胞、巨噬细胞、单核细胞等，有文献报道CD11b的激活可以影响髓系细胞极化从而抑制肿瘤的生长[23]，同时，Poly(I:C)还上调了瘤内CD3+T细胞的比例，提示了Poly(I:C)作为佐剂可能可以改善肿瘤抑制性微环境。
综上所述， Poly(I:C)可以显著提高PD-L1-NitraTh疫苗免疫应答水平，对基于硝基化T表位设计的肿瘤疫苗而言，Poly(I:C)可能是一种有效的佐剂。
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Figure 1. Immunogenicity of PD-L1-NitraTh with different adjuvants ($ \bar{x}\pm s $, n =5)
A: Determination of anti-PD-L1 antibody titer in mouse serum; B: Number of IFN-γ ELISPOT spots of mouse spleen cells; C: IFN-γ ELISPOT speckle pattern of mouse spleen cells **P < 0.01,***P < 0.001, ****P < 0.0001
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Figure 2. Antitumor activity of PD-L1-NitraTh with different adjuvants ($ \bar{x}\pm s $, n =5)
A:Tumor volume measured from the beginning of PD-L1-NatriTh treatment; B: Volume of the tumors excised after the mice were sacrificed (circle indicates tumor regression; triangle represents the death of the mouse); C: Tumor volume of mice at the end of the experiment**P < 0.01
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Figure 3. Detection of relevant proteins relative expression levels in lymph node cells by qRT-PCR（$ \bar{x}\pm s $, n =5）
A: GATA3; B: Tbet; C: Foxp3**P < 0.01
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Figure 4. Detection of tumor-infiltrating immune cells in mouse tumor tissues（$ \bar{x}\pm s $, n =5）
A: Frequency of CD11b+ cells in tumor tissues after immunization; B: Frequency of CD3+ cells in tumor tissues after immunization *P < 0.05, ****P < 0.0001
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Figure 5. Detection of relevant proteins relative expression levels in tumor cells by qRT-PCR（$ \bar{x}\pm s $, n =5）
A:Tbet; B:IFN-γ; C: Foxp3
Table 1 Grouping situation and immune dose of mice
Group Dose of
PD-L1-NitraTh/μgAdjuvant Dose of
adjuvant/μgBlank - - - PD-L1 50 - - CPG1018 50 CPG1018 35 Poly(I:C) 50 Poly(I:C) 50 GM-CSF 50 GM-CSF 0.2 SGP2 50 SGP2 200 Blank group was inoculated with saline, PD-L1 group was inoculated with PD-L1-NitraTh only, and the other groups were inoculated with PD-L1-NitraTh mixed with the corresponding adjuvant respectively
GM-CSF:Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor ;SGP2:
An acidic polysaccharide from Sarcandra glabra
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Table 2 Primer sequence for PCR
Gene Forward primer sequence（5′→3′） Reverse primer sequence（5′→3′） TNF-α CCCTCACACTCAGATCATCTTCT GCTACGACGTGGGCTACAG INF-γ ATGAACGCTACACACTGCATC CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC GATA3 CTCGGCCATTCGTACATGGAA GGATACCTCTGCACCGTAGC CD11c CTGGATAGCCTTTCTTCTGCTG GCACACTGTGTCCGAACTCA CD206 CTCTGTTCAGCTATTGGACGC CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC Foxp3 CCCATCCCCAGGAGTCTTG ACCATGACTAGGGGCACTGTA β-actin ACTCCTATGTGGGTGACGAG CATCTTTTCACGGTTGGCCTTAG
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