遗传密码子拓展技术在赖氨酸酰化修饰研究中的应用
Applications of genetic code expansion in the study of lysine acylation
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摘要: 赖氨酸酰化修饰在细胞中普遍存在，控制着蛋白质的多种功能；然而，在活细胞中进行特定位点酰化修饰的生物学功能研究还存在困难。近年来发展的遗传密码子拓展（genetic code expansion，GCE）技术通过正交的氨酰基-tRNA合成酶/tRNA能够在活细胞内定向插入与天然酰化修饰结构一致的非天然氨基酸(unnatural amino acids, UAAs)，实现在精准引入酰化修饰的基础上研究目的蛋白的理化性质和生物学行为的改变。此外，GCE技术还能定点引入无法被去酰化酶识别的模拟酰化修饰的UAAs，从而提高目的蛋白赖氨酸酰化修饰产物的稳定性。在目的蛋白特定位点插入“光交联”型UAA则被用于阐明酰化修饰蛋白的互作蛋白质组。根据不同结构和功能的酰化修饰分类，分别阐述了GCE技术结合上述3类UAAs的新颖设计，及其在研究蛋白酰化修饰对目的蛋白的活性、稳定性、细胞定位、蛋白质-DNA相互作用和蛋白质-蛋白质相互作用等功能影响中的应用。最后，展望了GCE技术在蛋白质酰化修饰研究中的局限和应用前景。Abstract: Lysine acylation is a ubiquitous protein modification that controls various aspects of protein function. However, it can be challenging to decipher the biological function of site-specific acylation modifications in living cells.The recently developed genetic code expansion (GCE) technology has enabled site-specific incorporation of unnatural amino acids (UAAs) that are structurally consistent with the natural acylation modifications in vivo through orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase/tRNA pairs, thus facilitating the study of physicochemical properties and biological behaviors of homogeneously acylated proteins.Besides, GCE technology allows for the targeted introduction of UAAs that mimic acylation modifications but cannot be recognized by deacylases, which improves the stability of lysine acylation modification products.Moreover, the insertion of photo-crosslinked UAAs at specific sites of the target protein has been used to elucidate the reciprocal proteome of acylated modified proteins.Based on the introduction of different structural and functional acylation modifications, we described the novel design of GCE technology combined with three types of UAAs, and their application in studying the functional effects of protein acylation modifications on the enzyme activity, protein stability, cellular localization, protein-DNA interactions and protein-protein interactions of target proteins, with a description of the limitations and prospects of GCE technology in studying protein acylation modification.
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Keywords:
- unnatural amino acids /
- lysine acylation /
- genetic code expansion /
- proteomics
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皮肤及其附属物组成的外皮系统是人体最大的器官，由表及里可分为3层：表皮、真皮和皮下组织，是人体对抗外界环境的重要屏障，能够防止身体水分与电解质流失，抵御病原体并防止病原微生物的感染[1]。皮肤结构的完整性对维持其正常生理功能至关重要，皮损发生后，伤口愈合过程主要包括止血期、炎症期、增殖期和组织重构期4个相互级联、部分重叠的阶段。皮肤损伤的修复需要多处精细调控并按照特定的顺序进行，一个或多个阶段的失调会影响整体伤口愈合的速率和质量，甚至影响到整个机体的健康。临床上根据伤口愈合的时间长短将伤口分为急性伤口和慢性伤口，急性伤口如手术切割伤，通常在3~4周内可恢复。慢性伤口由于各种原因（高血糖、缺氧、血液循环障碍、细胞因子分泌失调、肿瘤、神经损害等）导致皮肤组织溃疡长久不愈，愈合过程大于8周，严重影响患者的生活质量。
微针是一种新型经皮给药技术，其由微米级的尖锐小针阵列构成，刺入皮肤后会在皮肤上留下微孔道，可以提高药物分子在皮肤上的通透性。与口服、注射给药相比，微针给药能够避免胃肠道中各种消化酶和化学因素所致的药物降解和肝首过效应，尤其适用于局部病灶如皮肤感染、慢性伤口等，可避免全身给药带来的不良反应并减少局部血药浓度波动[2]。与传统伤口敷料相比，微针可以穿透愈合过程中形成的微生物膜[3]和焦痂，使活性成分进入健康细胞扩散起效，此外，微针制剂具有较好的黏附力[4]且搭载的药物分子可无痛穿透表皮至真皮组织[5]，提高创面上治疗药物的浓度和生物利用度，显著改善治疗效果。本文介绍了微针的分类及特点，并对各种类型的微针在伤口愈合研究中的应用及作用机制进行综述。
1. 微 针
1.1 微针的分类
微针作为一种新兴的经皮给药方式，具有微创、使用方便、患者依从性佳等优点。根据作用方式的不同，微针分为以下5种：实心微针、包衣微针、空心微针、可溶性微针和水凝胶微针（图1）。
1.1.1 实心微针
实心微针多采用硅树脂、金属（不锈钢和钛）、陶瓷和聚合物等具有优秀机械强度且不可降解的材料制成，本身不装载药物，通过穿透皮肤屏障在皮肤中形成微通道，使药物制剂被动扩散穿过通道进入真皮层发挥作用。Omolu等[6]利用实心微针增强多西环素的跨膜递送来抑制高基质金属蛋白酶(MMPs)活性以治疗慢性伤口。
1.1.2 包衣微针
包衣微针是在实心微针的外表面包覆药物涂层，当微针刺入皮肤后，涂覆在微针上的药物直接释放发挥作用。由于包衣微针的载药量较小，多用于只需少量抗原即可诱导免疫反应的疫苗接种。Choi等[7]使用微成型方法制备聚乳酸（PLA）微针阵列贴片，在其尖端涂覆二代天花疫苗，接种小鼠后成功诱导了小鼠的细胞免疫应答，产生的抗体水平可维持12周。
1.1.3 空心微针
空心微针一般使用不可降解的材料制成具有一定机械强度的外壳，药物被制成纳米粒子、脂质体等装载在中心空腔内，刺入皮肤后在压力作用下从针尖或外壳侧壁的孔洞中释放。除能容纳更高剂量的药物外，空心微针具有快速递送负载物质和增强纳米载体透皮递送能力的优势[8]。有研究使用空心微针装置将用于靶向治疗的细胞递送至皮肤，经孔径≥75μm的空心微针注射后，不会影响靶向治疗细胞的活力和功能[9]。
1.1.4 可溶性微针
可溶性微针一般由机械强度适中、可降解、生物相容性良好的材料制成，在刺入皮肤后针体逐渐溶解实现药物释放。常用的基质材料有壳聚糖(CS)、透明质酸(HA)、羧甲基纤维素(CMC)、丝素蛋白(SF)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)等。可溶性微针具有溶解速度可控、给药步骤简单、无须专门的锐器回收与处理等优点。但与空心微针相比其载药量有限，且对角质层的穿刺能力比不溶性微针弱。为增加可溶性微针载药量，有报道使用两步离心法制备了针尖与背衬层均载药的雷公藤甲素-双室-可溶性微针，为给药剂量较大的中药复方药物的经皮给药设计提供了思路[10]。
1.1.5 水凝胶微针
水凝胶微针是由可溶胀的交联聚合物制成，刺入皮肤后，聚合物吸收组织液发生溶胀，药物分子通过溶胀后疏松的孔洞释放，给药完成后需要拔除微针。水凝胶微针一般由温度响应性N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)[5]、甲基丙烯酸酯化明胶(GelMA)[11]、γ-聚谷氨酸(γ-PGA)[12]、PVA [13]、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)[14]等为材料制成，这些材料均具备较好的生物相容性。
不同分类微针的制备方法和特点总结如表1[8, 15−17]。
表 1 不同微针的制备方法和特点微针类型 制备方法 优 势 不 足 实心微针 干法蚀刻、湿法蚀刻、3D打印、激光烧蚀、微成型、机械切割、电镀 技术简单，临床应用广；结合水凝胶、涂膜剂等载药量大；穿刺力强 微孔扩张时间短（2 h），无法持续给药；两步给药步骤烦琐；微针重复利用度低造成浪费 包衣微针 制成固体微针后再浸涂、滚涂、喷涂 给药步骤简单；适用于疫苗接种 载药量小；微针重复利用度低造成浪费 空心微针 多种蚀刻技术、激光微加工、基于数字光处理的投影立体光刻、微量吸管拉动、微成型 载药量大；与皮下注射相比，减少患者对针头恐惧，增加顺应性 制作成本高、技术复杂 可溶性微针 真空法、离心法、熔融法、铸浇法 给药步骤简单；可实现药物控释；减少材料消耗浪费；无须回收针头 机械强度较差，对角质层穿透能力有限 水凝胶微针 光刻工艺、微模塑工艺、真空法、离心后交联 可设置储库提高载药量；水凝胶本身具有控释缓释的优势，可保持长时间释药 疏松膨胀的水凝胶移除后留下的微孔过大，恢复时间较长，容易感染；对角质层穿刺能力较低 2. 微针制剂在伤口愈合不同阶段中的作用
伤口愈合通常分为4个阶段：止血、炎症、增殖和组织重构（图2）。具体而言，皮肤损伤发生后机体通常会启动创面愈合的生理过程：①血管收缩、纤维蛋白形成以止血；②中性粒细胞、淋巴细胞与巨噬细胞共同对抗炎症反应；③增殖阶段，伤口开始再上皮化，生成血管，沉积胶原蛋白，形成细胞外基质；④胶原蛋白重塑，血管成熟和退化，完成伤口的修复。
微针作为一种提供物理穿透的经皮给药技术，通过使用功能性基质材料并搭载抗菌抗炎、生长因子等药物，产生止血、抗菌、减轻炎症反应、促进血管生成、细胞迁移和胶原蛋白沉积等效果，在伤口愈合的全过程发挥重要作用。
2.1 止血阶段
2.1.1 物理止血
皮肤外伤、手术切割等导致的出血，除传统的处理方法外，也可以使用具有特殊仿生结构的微针通过牵引缩小伤口区域或密封创面进行止血。Jeon等[18]受体内寄生虫通过膨胀口器来锚定至宿主组织中的启发，开发了一种水凝胶制成的仿生黏合剂微针贴片，该贴片由可膨胀的贻贝黏附蛋白外壳和非膨胀性SF核心组成，穿透组织后贻贝黏附蛋白外壳快速膨胀形成芽状结构，与周围组织物理互锁，可密封体外伤口，在体内使用时防止腔隙泄露的效果与缝合相当。Deng等[19]以七鳃鳗牙齿为灵感设计的仿生定向抗菌丝胶微针，可通过定向牵引力“缩小”伤口区域止血，同时氧化锌纳米颗粒、丝胶的掺入，使该微针还具备抑菌、促进毛囊再生和血管生成的能力（图3）。值得注意的是，尽管仿生微针在伤口封闭性能上展现出了卓越性能，然而其制备过程中对工艺精度的要求较高。具体而言，在微针的脱模阶段，由于针尖结构易发生弯曲变形，可能导致微针结构不完整并对微针的伤口密封效能产生显著影响。
2.1.2 药物止血
一种中草药微针贴片的制备方法是将积雪草酸溶于豆腐柴叶汁液，再用3%草木灰水固化制成可溶性微针，用于创面愈合。由于豆腐柴叶中含有丰富的果胶和多种氨基酸，使该微针贴片具有清热解毒、消肿止血的功效[20]。此外，以CS为基质材料制作的水凝胶微针贴片，除抗菌、镇痛外，也具有止血作用[21]。
2.2 炎症阶段
2.2.1 抗菌作用
皮损处常常会受到环境微生物或/和病原微生物的感染，特别是细菌感染，细菌过度累积会产生细菌生物膜，该生物膜会抵抗局部或全身抗生素对细菌的杀伤力 [1]。目前对细菌生物膜治疗的难点在于抗生素难以穿透其物理屏障、抗生素脱靶和抗生素耐药性等方面 [22]。而具有抗菌作用的微针可以穿透生物膜屏障，释放其抗菌活性药物，导致生物膜被破坏。
微针在伤口愈合阶段发挥抗菌作用主要有3种途径，将抗菌剂装载在微针中，制作微针的基质材料采用抗菌聚合物，以及包含抗菌纳米结构。微针发挥抗菌作用的部分应用实例列于表2。
表 2 微针发挥抗菌作用的应用实例途径 应用实例 作用 参考文献 装载抗菌剂 利用真空微成型技术将阿奇霉素装载到透明质酸（HA）和PVP制成的聚合物微针中 破坏感染伤口中的生物膜 [23] 将氯霉素装载到含明胶酶敏感的明胶纳米粒子的微针中 响应活性细菌群落产生的明胶酶，释放氯霉素以破坏生物膜，帮助伤口愈合 [22] 在双层微针中装载镁和三七皂苷 同时达到抗菌、促进新生血管形成和激活良性免疫反应的效果 [24] 将PVA水凝胶、S-亚硝基谷胱甘肽（一种NO释放剂）以及氧化石墨烯在低温下集成制作的微针能够随着温度升高或红外辐射加热在皮下逐渐释放NO NO能够抑制细菌生长并增加组织再生，同时缩短生物膜感染伤口的愈合时间 [13] 抗菌聚合物基 以具有天然抗菌性的壳聚糖（CS）为基质材料制作的微针 带有正电荷的CS，能够穿透带负电荷的细菌细胞壁，最终导致细菌细胞内液溢出而死亡 [25] 康复新、CS和岩藻糖为原料制作的微针 良好的抗菌特性和细胞相容性，对大鼠全层伤口的愈合具有显著促进作用 [26] 采用真空法制备的含有麦卢卡蜂蜜的微针 较好地杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA）的活性，可用于感染性伤口治疗 [27] 可溶性金属有机框架(MOF)微针 光热抗菌疗法，利用光热剂在近红外光照射下产生局部热量，对细胞造成不可逆损伤来达到抑菌效果 [28-29] 抗菌纳米结构 背衬层由γ-PGA水凝胶和氧化石墨烯-银纳米复合材料制成的微针 优异的抗菌效果，可加速伤口愈合 [30] 纳米银、氧化锌纳米颗粒等被集成为微针中的抗菌模块 抑制微针制剂给药部位病原微生物的生长 [19, 31] 装载香芹酚的细菌酶响应纳米粒子的空心微针 香芹酚具有抗多药耐药细菌生物膜潜力，微针液体注射系统可提高目标部位的药物浓度，并延长所载药物的作用时间，能达到良好的抑菌效果 [32] 为达到良好的抗菌效果，几种抗菌途径常结合使用。一种由CS、单宁酸、AgNO3和白芨多糖通过分步离心制备的多功能复合微针，包含抗菌聚合物基质材料CS、能被单宁酸还原为银纳米颗粒的Ag+和可以刺穿生物膜的活性分子白芨多糖，该微针在体外和体内均显示出较好的抗菌作用，具有可穿透细菌生物膜、清除过量自由基、抑制炎症因子、促进伤口愈合的作用[33]。尽管现有文献一致证实微针在抗菌性能和穿透生物膜方面表现优异，然而在其制备过程及实际应用过程中，无菌操作同样至关重要。若无菌操作未能按照规范进行，或消毒步骤执行得不够彻底，可能增加皮肤感染的风险。
2.2.2 抑制炎症反应
在创伤愈合的炎症阶段，巨噬细胞和中性粒细胞释放一定量的活性氧（ROS），ROS在适当浓度范围内可以有效保护机体抵抗细菌与真菌感染，促进伤口愈合。当创面的炎症未得到有效控制时，产生的ROS超出细胞的抗氧化能力，超出一定浓度时会杀伤细胞，抑制细胞迁移和增殖，导致组织损伤及炎症的持续。所以ROS过低或过高对伤口愈合都是不利的[34]。
Gong等[35]设计了一种Zn2GeO4:Cu2+持久发光纳米棒可溶性微针，该微针在穿透生物膜后，预光照的纳米棒可保持长时间的光催化作用，能持续产生多种ROS，具有优异的抗菌活性和生物相容性，可用于MRSA感染性伤口治疗。
对于糖尿病患者的伤口等难愈合创面，持续的炎症反应产生过多的ROS，ROS又诱导炎症反应，使患者遭受巨大痛苦。一种基于镁有机骨架的微针贴片其尖端释放的Mg2+诱导细胞迁移和内皮小管生成，装载的没食子酸是一种ROS清除剂，具有抗氧化效应，可用于治疗糖尿病伤口[30]。
在当前学术研究文献的范围内，微针在抑制炎症反应方面的机制主要依托于其ROS浓度的有效调控策略，这既包括通过强化清除途径以减少ROS总量，也涵盖通过精细调节释放过程以维持适宜的ROS水平。然而，目前尚未有确切文献明确设定出在伤口愈合进程中ROS的理想浓度范围阈值。另外，考虑到检测和精确量化ROS浓度的技术难度，微针技术在实际临床应用中调控ROS浓度的效果及其潜在影响仍有待深入探索，并需通过进一步的实证研究加以验证。
2.3 增殖阶段
增殖阶段，首先巨噬细胞释放生长因子促进血管新生，确保有足够的血管系统提供氧气和营养并清除废物，随后血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)等生长因子刺激损伤处角质形成细胞增殖，伤口开始再上皮化。同时真皮层成纤维细胞增殖并迁移至损伤处，产生大量细胞外基质，胶原蛋白在创面沉积，表皮屏障功能开始恢复[36−37]。
Schmitt等[38]在人体皮肤的标准化体外全层3D模型中检查微针治疗创面效果，通过实时荧光定量PCR和微阵列研究分析，显示微针治疗在mRNA水平上调了与组织重塑和伤口愈合、上皮增殖和分化、免疫细胞募集和热休克蛋白相关的基因的表达，下调了促炎细胞因子和抗菌肽的表达。这表明，微针在真皮重塑中发挥重要作用，能够增加表皮分化，并促进胶原蛋白合成。目前多种已开发的微针制剂通过苏木素-伊红（HE）染色法、Masson三色染色、免疫组织化学和免疫荧光染色等检测方式被证明具有促进血管生成、细胞迁移和胶原蛋白沉积的作用（表3）。
表 3 微针在增殖阶段对伤口愈合的促进作用活性分子 作 用 特 点 参考文献 氧分子 缓解糖尿病伤口缺氧程度，加速组织生成 基于黑磷的光热转换特性，与血红蛋白的可逆氧结合特性，实现响应性氧释放 [39] 一氧化氮分子(NO) 消除炎症，加速血管生成与胶原沉积 基于光热响应材料氧化石墨烯在近红外下的温度调节特性，使NO可控释放 [40] 铁-间充质干细胞衍生的人工纳米囊泡(Fe-MSC-NVs)、聚多巴胺纳米粒子(PDA NPs) PDA NPs抑制 ROS诱导的炎症反应、Fe-MSC-NVs促血管生成 复合核壳结构，快速释放的核心层（Fe-MSC-NVS）和缓慢释放的壳层（PDA NPS）组装而成，壳层在伤口愈合的各个阶段抑制ROS，核心层促进血管生成 [41] VEGF、CS 促进炎症抑制、胶原沉积、血管生成、组织再生 抗菌性CS作为基材，VEGF由温度敏感性水凝胶包裹在CS微针的微孔中，通过伤口部位炎症反应引起的温度升高来可控地实现药物智能释放 [21] 锌离子(Zn2+)、低分子量透明质酸(HA) 抗菌、促进新生血管形成和上皮再生 以简单的微成型方法制造了一种可降解、生物相容性佳的Zn-MOF封装的甲基丙烯酸化透明质酸(MeHA)微针阵列，同时实现抗菌与组织再生 [42] 甲状旁腺激素 促进伤口闭合、再上皮化和胶原沉积 全身性给药甲状旁腺激素，通过Smad3/mTOR通路促进胶原沉积 [43] 重组人源化III型胶原蛋白、负载萘普生的PLA-乙醇酸纳米颗粒 促进细胞迁移与增殖、增强血管生成、促进胶原沉积 合成的重组人源化Ⅲ型胶原蛋白具有很强的细胞黏附性，该微针的生物相容性良好 [44] 胰岛素 促进糖尿病伤口愈合 葡萄糖响应性胰岛素释放 [45] 2.4 组织重构阶段
伤口愈合的最后阶段为组织重构阶段，此时胶原蛋白重塑，血管成熟，部分血管退化，富含成纤维细胞的肉芽组织逐步被瘢痕组织所取代。但过多的细胞外基质沉积会使成纤维细胞进入高应力状态，使伤口过度修复，导致增生性瘢痕，甚至导致组织功能障碍[36-37]。
有研究表明，一种SF微针贴片可通过调整微针的大小和密度，物理干预减弱成纤维细胞产生的收缩和机械应力来抑制瘢痕形成[46]。装载了含有酪胺改性明胶和用于SPARC（通过调节成纤维细胞功能参与伤口纤维化的基因）的siRNA纳米复合物的可溶解微针，通过减少SPARC基因表达，使伤口部位胶原蛋白生成减少并防止瘢痕形成[47]。中药丹参中含量较高的丹参酮ⅡA具有抗炎、抗纤维化等作用，装载丹参酮ⅡA的微针能通过干预TGF-β1/Smad信号通路的表达，抑制创伤瘢痕部位成纤维细胞的增殖活性来抑制增生性瘢痕生成[48]。现有研究表明，在组织修复与重塑阶段，微针可以通过整合物理调控机制与药物递送策略，双管齐下有效地抑制瘢痕形成的过程，这一特性揭示了微针技术在改善瘢痕问题上具有广阔的应用潜力和前景。具体而言，一方面，微针凭借其独特的微结构可对皮肤进行物理干预，影响组织修复过程；另一方面，其作为药物载体，能够实现精确、高效的局部药物传递，从而抑制增生性瘢痕形成。
3. 总结与展望
近年来，微针作为先进的药物递送系统的潜力已被广泛证明，现有研究表明，载药微针在止血、抑菌、抑制炎症反应、促进胶原蛋白沉积和血管生成等伤口愈合的关键步骤能发挥显著疗效。微针在促进伤口愈合领域的发展，与新材料与新技术的出现相关联，研究者将光热响应、温度响应、pH响应以及微生物响应等能够智能监测伤口环境变化的新材料和新技术与微针相结合，已逐步实现了智能、完整的伤口管理。
微针制剂在促进伤口愈合方面的应用前景良好，但完成从实验室到临床应用的转化仍面临很多挑战。在设计更强大创伤用载药微针的过程中，除验证新开发微针制剂的疗效、机械强度、生物相容性等常规项外，还需关注材料在长期使用下的代谢和消除途径以及沉积到皮肤中的安全性。此外，考虑到临床实际应用，还必须控制好由于药物递送系统复杂程度的增加带来的应用难度上升的问题，否则将与微针的简便易用特性相违背。
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