Optimization of prescription process of lifitegrast eye drops and evaluation of its efficacy for dry eye disease
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摘要:
为了研制更有效的用于治疗干眼症的药物，进行了立他司特滴眼液的制备研究，并进行了体内外的安全性和有效性考察。首先开发了滴眼液中立他司特的含量测定方法。通过文献调研及单因素实验确定了制剂的处方组成和制备工艺。最后通过Draize眼刺激性试验和HE染色进行滴眼液安全性评价，以泪液分泌试验及ELISA试验评价其对于干眼兔的治疗有效性。结果表明，立他司特滴眼液的最终处方组成为立他司特5%、氯化钠0.4%、无水磷酸氢二钠0.3%~0.4%、五水硫代硫酸钠0.3%，氢氧化钠0.3%，外观为透明略带棕黄色的溶液，pH满足7.75±0.05，渗透压200~330 mOsmol/kg 范围内，且60 ℃下3个月内稳定性良好。刺激性研究与生理盐水对比无显著差异，立他司特滴眼液治疗后兔泪液分泌增加且泪液中炎症因子IL-6和IL-1β、TNF-α表达均显著性降低，且相比于市售乳剂环孢素滴眼液起效更快。结果表明，立他司特滴眼液制备方法简单，稳定性好，是干眼症快速治疗更优的选择。
Abstract:In order to develop a more effective drug for dry eye disease, the preparation of lifitegrast eye drops was carried out, and the safety and efficacy of lifitegrast eye drops in vitro and in vivo were investigated. First the method for the determination of lifitegrast content was established, and then the composition and preparation process of the preparation were determined by literature review and single factor experiment. Finally, the safety of lifitegrast eye drops was evaluated by Draize eye irritation test and HE staining, and the therapeutic efficacy was evaluated by Schirmer test and ELISA test. The results showed that the final prescription of lifitegrast eye drops consisted of 5% lifitegrast, 0.4% sodium chloride, 0.3%−0.4% anhydrous disodium hydrogen phosphate, 0.3% sodium thiosulfate pentahydrate and 0.3% sodium hydroxide. The appearance of lifitegrast eye drops was transparent and slightly brownish yellow solution, the pH was7.75±0.05, the osmotic pressure was in the range of 200−330 mOsmol/kg and it had good stability at 60℃ for 3 months. There was no significant difference in irritation study compared with normal saline. Schirmer test showed that tear secretion was increased and the expression of inflammatory factors IL-6, IL-1β and TNF-α in tears were significantly decreased after treatment with lifitegrast eye drops and compared to the commercially available emulsion cyclosporine eye drops, it takes effect faster. The above results indicate that lifitegrast eye drops are simple to prepare and stable, which is a better choice for the rapid treatment of dry eye disease.
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Keywords:
- lifitegrast /
- preparation process /
- methodology /
- in vivo-in vitro evaluation /
- dry eye disease
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膜蛋白是细胞各种生命活动的重要参与者，并通过膜蛋白间的相互作用发挥其功能，因此深入研究膜蛋白相互作用对探究细胞调节机制和细胞信号通路的传导具有重要意义。传统的膜蛋白相互作用研究方法可能会破坏膜蛋白结构，遗漏某些膜蛋白相互作用。近些年来，邻近标记技术（proximity labeling, PL）得以快速发展，并随着生物化学及酶化学领域多种生物催化酶的不断发现，开发出多种研究膜蛋白相互作用的方法，弥补了传统研究方法的不足。
1. 膜蛋白的相互作用
膜蛋白是一类以嵌入、贯穿或完全暴露的方式定位在细胞膜或细胞器膜上的蛋白[1]。根据其整合方式可将膜蛋白进一步分为外周膜蛋白、整合膜蛋白和脂锚定蛋白[2]。在人类基因组中，编码膜蛋白的基因占基因组中编码蛋白基因的20%~30%[3]，其表达产物包括糖蛋白[4]、载体蛋白[5]和酶[6]等。膜蛋白参与调控多种生物功能，包括信号转导[7]、跨膜转运[8]、细胞黏附[9]、催化胞内生化反应[10]、细胞稳态调节[11]、免疫识别[12]和能量产生[13]等，在细胞生命过程中扮演重要角色。同时，膜蛋白发挥功能不仅与其自身功能相关，而且也通过彼此的相互作用参与调控细胞的多种生理过程[14−15]。因此，采取多种方法探究膜蛋白之间的相互作用，对深入研究细胞内生理生化过程、探究细胞内结构以及疾病治疗靶点预测等方面具有重要的意义[16]。
2. 传统的膜蛋白相互作用研究方法
由于膜蛋白的跨膜结构具有很强的疏水性，所以膜蛋白的提取纯化较困难，而且膜蛋白与其互作蛋白间的相互作用时间较短且作用力微弱，这就增加了探索膜蛋白间相互作用的难度。传统的鉴定膜蛋白相互作用的方法主要包括免疫共沉淀技术（Co-IP）[17]、融合蛋白沉降技术（pull-down）[18]、质谱技术[19]、噬菌体展示技术[20]以及酵母双杂交技术[21]等等。其中结合质谱的免疫共沉淀技术与蛋白沉降技术灵敏度较低，可能无法检测到低亲和力或瞬时的蛋白相互作用，使得该类方法不完全适用于膜蛋白相互作用的鉴定。近年来，以噬菌体、酵母为载体的膜蛋白展示技术成为了研究膜蛋白相互作用的有力工具。
2.1 噬菌体展示技术
1985年，George Smith首创了噬菌体展示技术，并将其用于多肽或蛋白的展示。目前该技术已成为一种研究膜蛋白相互作用的经典方法[22−23]，其原理是利用基因工程将外源编码多肽或蛋白的基因插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白而被展示在噬菌体表面（图1-A）[24]。展示在噬菌体表面的蛋白仍然具有相对独立的空间结构和生物活性，当与其固相靶蛋白识别并结合后，通过收集结合的噬菌体即可进一步测序得到与靶蛋白结合的蛋白序列信息[25]。得益于噬菌体的个体微小、增殖能力强等特点，噬菌体展示技术的筛选周期较短[26]，经过多轮筛选后，可高效富集与配体结合的蛋白。但是，噬菌体展示技术需要经过细菌转化、噬菌体包装等过程，这也限制了其文库容量与展示分子的多样性。其次，噬菌体的宿主大肠埃希菌的生物合成系统有自身的表达限制，其蛋白合成、折叠以及修饰机制不同于真核细胞，这可能影响真核膜蛋白与其共配体相互作用，从而降低筛选结果的准确度[27]。
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图 1 几种传统的膜蛋白相互作用研究方法与邻近标记技术传统膜蛋白相互作用研究方法：（A）噬菌体展示技术；（B）分裂泛素化酵母双杂交系统；（C）基于过氧化物酶APEX的邻近标记技术;（D）基于Apt-Gq/h（Aptamer against POI G-quadruplex/hemin, G-四链体-血红素复合物）的邻近标记技术；（E）基于生物素连接酶的邻近标记技术，包括BirA*、TurboID、miniTurbo;（F）基于分裂型生物素连接酶的Split-TurboID邻近标记技术；（G）基于细菌蛋白PUP连接酶PafA（Proteasome accessory factor A，蛋白酶体辅助因子A）的邻近标记技术;（H）基于SrtA（Sortase A, 转肽酶）的邻近标记技术；（I）基于FT[H. pyloria(1, 3)Fucosyltransferase，岩藻糖基转移酶]的邻近标记技术;（J）基于Fe（Ⅲ）催化探针的邻近标记技术2.2 分裂泛素化酵母双杂交展示系统
酵母表面展示系统是继噬菌体展示技术之后快速发展并得到广泛应用的一种真核蛋白展示系统。作为一种真核模式细胞，酵母的翻译后修饰机制更接近于哺乳动物细胞的蛋白修饰机制，使其能够产生与哺乳动物细胞的天然蛋白相同或高度相似的复杂蛋白，从而克服了噬菌体展示技术的部分不足[28]。酵母双杂交系统是将编码两个待测蛋白的基因分别与酵母细胞的DNA结合域或转录激活域相融合，通过检测在酵母细胞中报告基因的表达情况而对目的蛋白的相互作用进行鉴定的一种技术。但是传统的酵母双杂交系统并不适合研究无法被转运入核的蛋白，如膜蛋白。为解决这一问题，基于分裂的泛素蛋白再重组的膜酵母双杂交系统被开发出来。在膜酵母双杂交系统中，泛素被分为两部分，分别与诱饵蛋白和目的蛋白融合表达后在酵母细胞中杂交，通过诱饵蛋白和目的蛋白的相互作用而形成完整的泛素蛋白，从而被泛素特异性蛋白酶（ubiquitin-specific protease, UBP）识别并剪切，释放转录因子并激活报告基因的表达以反映膜蛋白间的相互作用[29]（图1-B）。该方法对仪器要求低且通量较高，还避免了蛋白提纯引起的蛋白变性问题，但是该系统中诱饵蛋白和目的蛋白的过度表达很容易导致假阳性结果[30]。
3. 邻近标记技术
虽然传统的膜蛋白相互作用研究方法已被广泛使用，但它们仍存在一定的局限性，无法适用于各种类型的膜蛋白间相互作用的鉴定或筛选。为了准确全面地研究膜蛋白相互作用，一类以化学催化为基础的邻近标记技术被开发出来，并被应用于膜蛋白相互作用的研究中。邻近标记技术使用生物工具酶以及小分子探针对与特定的诱饵蛋白发生相互作用的目的蛋白进行共价标记[31]。邻近标记技术应用了多种生物工具酶，按照类型可分为过氧化物酶[32]和生物素连接酶，包括抗坏血酸过氧化物酶（engineered ascorbate peroxidase, APEX）[33]、 BirA*及其突变体[34−37]等。这些生物工具酶能够将惰性底物催化为半衰期短的活性小分子，促使它们定向扩散到邻近的标记位点上。在这些小分子与标记位点结合后，研究者可以通过流式细胞术[37]、激光扫描共聚焦显微镜成像[38]、质谱[39]等方法对被标记的膜蛋白进行测定[40−41, 31]。
接下来，将介绍邻近标记技术为基础的膜蛋白相互作用研究方法，并总结归纳它们各自的优点与不足之处（表1）。
表 1 传统的膜蛋白相互作用研究方法与邻近标记技术的优缺点及应用方向分 类 研究方法 优 点 不 足 应用方向 传统的膜蛋白相互作用研究方法 噬菌体展示技术 操作简单，筛选周期短 文库容量与多样性受限，蛋白合成等机制与真核细胞不同 抗原表位筛选、抗体与疫苗制备等 分裂泛素化酵母双杂交展示系统 通量高，对仪器要求低，适用于真核细胞蛋白的研究 易因蛋白过度表达导致假阳性结果 真核细胞蛋白相互作用研究、膜蛋白文库筛选等 基于生物素连接酶的邻近标记技术 BioID邻近标记技术 无细胞毒性，适用于细胞膜蛋白弱相互作用研究 共孵育时间长、反应所需生物素浓度高 弱相互作用或瞬时相互作用筛选、蛋白互作网络构建等 基于TurboID的邻近标记技术 标记速度快、标记半径大 产生一定的细胞毒性、易因内源性生物素导致非特异背景 低丰度膜蛋白相互作用、细胞筛选等 基于miniTurbo的邻近标记技术 灵敏度与适用范围高于基于TurboID的邻近标记技术 生物素化活性低于TurboID 信号通路与信号转导研究 基于分裂型生物素连接酶的Split-TurboID邻近标记技术 能够有效展示膜蛋白重组与相互作用的过程 易因酶的空间位阻造成假阴性结果 细胞膜蛋白或细胞器膜蛋白间相互作用等 基于过氧化物酶的邻近标记技术 基于抗坏血酸过氧化物酶APEX的邻近标记技术 催化标记效率高于BioID和基于TurboID的邻近标记技术 体系中引入了H2O2，易产生细胞毒性，导致细胞氧化应激 目标蛋白互作网络构建、空间转录组分析等 基于G-四链体/血红素复合物Apt-Gq/h的邻近标记技术 复合物制备方便，相对分子质量小能够避免空间位阻导致的假阴性结果 受含酚底物标记半径限制 活细胞与组织切片胞间连接检测、生物标志物扩增检测等 基于其他工具酶的邻近标记技术 基于细菌蛋白PUP连接酶PafA的邻近标记技术 细胞毒性小，能通过胞内遗传表达的方式应用于活体动物体内研究 不适于细胞器膜蛋白相互作用的研究，且连接酶存在自我修饰情况，易致自身失活与底物耗尽 胞间与活体动物体内的细胞膜蛋白相互作用检测 基于转肽酶SrtA的邻近标记技术 底物易合成，可结合多种标签，且该反应细胞毒性低 催化速度慢，需要较高浓度多肽底物维持可逆反应进行 胞间与活体动物体内细胞膜蛋白相互作用研究 基于岩藻糖基转移酶FT的邻近标记技术 特异性高，操作简单，具有临床治疗 应用的潜力 标记时间较TurboID、APEX等更长，标记范围小 抗原特异性T细胞的筛选与捕捉 基于小分子催化探针的邻近标记技术 基于Fe（Ⅲ）催化探针的邻近标记技术 该邻近标记技术的特异性高 底物H2O2可能破坏膜蛋白，且外因导致的蛋白氧化易造成假阳性结果 细胞膜蛋白参与的蛋白相互作用网络研究 3.1 基于生物素连接酶的邻近标记技术
基于生物素连接酶的邻近标记技术通过在诱饵蛋白上融合一个具有特定催化活性的生物素连接酶，并在孵育体系中加入其小分子底物——生物素，催化与诱饵蛋白发生相互作用的邻近蛋白发生生物素化修饰。最后，利用链霉亲和素对生物素标记的蛋白进行富集与分析，即可获得与诱饵蛋白相互作用的蛋白信息[42]。
3.1.1 基于生物素连接酶BirA*和TurboID的邻近标记技术
Roux等[43]开发了一种能在活细胞中研究膜蛋白相互作用的邻近标记系统，称为BioID。该系统利用一种高灵敏、高特异性的生物素连接酶BirA*，即大肠埃希菌连接酶BirA的R118G突变体，催化与诱饵蛋白发生相互作用的邻近蛋白生物素化。May等[44]将生物素连接酶与诱饵蛋白相融合，并在体系中添加了生物素底物。当诱饵蛋白与目的蛋白结合后，邻近的生物素底物被催化为高活性分子生物素酰-5'腺苷酸，并共价结合到目的蛋白的赖氨酸残基上而完成标记（图1-E）。而后通过对生物素化的蛋白进行质谱分析，即可获得目的蛋白的信息。BioID邻近标记技术能够鉴定细胞膜蛋白间的弱相互作用，且由于生物素-亲和素连接具有高亲和力，通过多次洗涤的方式可以降低非特异性蛋白结合[45]，而且BirA*的细胞毒性较小，适用于活细胞膜蛋白相互作用的研究。但该方法所依赖的生物素连接酶突变体活性不高，通常要共孵育16 h以上才能成功标记，且体系中需添加高浓度的生物素。
在BirA*的基础上，Branon等使用易错PCR技术生成突变体文库，利用酵母表面展示定向进化筛选改良的生物素连接酶。经过多轮筛选，得到了一种有15个突变的生物素连接酶，被称为TurboID。TurboID的活性要优于BirA*，仅用10 min即可在室温下完成蛋白的共价标记，且标记半径更大[46]。但是在某些情况下，TurboID会产生一定细胞毒性，且标记结果中存在由内源性生物素导致的非特异标记。在对BirA*进行13个氨基酸位点突变并去掉一些N端序列后，得到了一个相对分子质量更小的生物素连接酶——miniTurbo[37]。虽然miniTurbo的生物素化活性略低于TurboID，但在无外源生物素添加的情况下，它的非特异性标记更少，背景更干净，适用于有精确控制标记时间要求的细胞膜蛋白相互作用研究。
3.1.2 基于分裂型生物素连接酶的Split-TurboID邻近标记技术
在细胞的生理生化活动中，细胞器膜蛋白间的接触与信号传递也是一个重要的组成部分。为了提高邻近标记技术的特异性与多功能性，满足对细胞器膜蛋白相互作用的研究需求，Cho等[6]开发了一种将生物素连接酶分裂为两个无活性的小分子的邻近标记技术，称为Split-TurboID。他们将TurboID分裂后的两个无活性小分子片段分别与FK506结合蛋白（FK506 binding protein, FKBP）和FKBP雷帕霉素结合蛋白（FKBP–rapamycin binding, FRB）融合，过表达在两种细胞上，而后在体系中加入雷帕霉素，诱导FRB-FKBP二聚体的形成，促进小分子蛋白重组为TurboID，并催化生物素分子共价连接到邻近的蛋白上（图1-F）。最后通过共聚焦荧光成像对标记结果进行验证，再以链霉亲和素磁珠富集并通过质谱分析细胞器膜蛋白相互作用情况。利用这一工具，Cho等标记并探究了胞内线粒体与内质网的膜蛋白组成情况，并获得了若干个内质网-线粒体膜蛋白接触位点。Split-TurboID在研究胞内离子运输[6]、线粒体分裂[6]和甾醇代谢[6]等方面发挥着重要的作用。然而，与基于TurboID的邻近标记技术类似，Split-TurboID也存在因生物工具酶自身的空间位阻而造成假阴性结果的情况。
除了上述所介绍的几种生物素连接酶外，BirA*的优化酶BioID2[44]、AirID[47]、BASU[44]等也逐渐被开发出来，不断提高邻近标记技术的灵敏度，扩宽其应用范围。
3.2 基于过氧化物酶的邻近标记技术
在基于生物素连接酶的邻近标记技术中，生物素连接酶往往在与诱饵蛋白融合后发挥作用，但生物素连接酶分子本身的空间位阻会对膜蛋白间相互作用产生影响[48]，且生物素连接酶进行标记所花的时间较长。为了降低酶分子位阻对膜蛋白相互作用的影响，同时提高标记效率，研究者们开发了一系列基于过氧化物酶的邻近标记技术。
3.2.1 基于抗坏血酸过氧化物酶APEX的邻近标记技术
APEX是除生物素连接酶BirA*外的另一种常用工具酶。APEX在与H2O2及生物素-苯酚共孵育时，能够利用H2O2将生物素-苯酚活化为活性苯氧自由基，该自由基优先标记富含酪氨酸残基的相邻蛋白，在短短1 min内就能够将诱饵蛋白半径20 nm范围内的邻近蛋白生物素化[49]。利用APEX的邻近标记功能，Hung等[49]构建了一种线粒体膜蛋白标记体系，他们将APEX与膜内丝氨酸β-内酰胺酶样蛋白（serine beta-lactamase-like protein, LACTB）相融合，再将H2O2与生物素-苯酚加入胞内，催化苯氧自由基的生成，标记邻近的内源性蛋白（图1-C），最后通过质谱鉴定与线粒体膜蛋白发生相互作用的蛋白。APEX的催化效率远高于BirA*和TurboID，且相对分子质量小于生物素连接酶，其空间位阻更小，对膜蛋白间相互作用的影响更小[50]。但是APEX的反应过程需要H2O2的参与，易产生细胞毒性，引起细胞氧化应激。
3.2.2 基于G-四链体/血红素复合物Apt-Gq/h的邻近标记技术
在基于APEX的邻近标记过程中，H2O2的加入可能影响胞内氧化还原平衡从而产生细胞毒性，因此研究者们一直在不断尝试开发细胞毒性低的邻近标记方法。Yang等[51]构建了一种基于核酸的类辣根过氧化酶工具，用于邻近标记技术的建立，该工具被称为Apt-Gq/h（Aptamer against POI G-quadruplex/hemin）。Gq/h，即G-四链体/血红素复合物，它被锚定在诱饵蛋白上，催化含酚底物产生苯氧自由基，共价标记与诱饵蛋白发生相互作用的目的蛋白（图1-D）。研究者可通过对被标记的蛋白进行亲和力富集与蛋白组学分析，获得膜蛋白相互作用的信息。Apt-Gq/h系统能够识别膜蛋白细微的定量变化，可进一步用于活细胞或组织切片中胞间连接以及生物标志物扩增检测。Gq/h分子经一步组装即可完成，制备方便，热稳定性好，其自身较小的相对分子质量也避免了因空间位阻引起的假阴性结果。但是受含酚底物标记半径的影响，该系统难以用于细胞膜蛋白相互作用的精确研究。
3.3 基于其他生物工具酶的邻近标记技术
邻近标记技术在细胞生物学研究中被广泛使用，但是常用的两类生物工具酶都有各自的局限性：BirA*及一系列优化的生物素连接酶具有较大的空间位阻，而过氧化物酶则需要在反应体系中添加H2O2，易产生细胞毒性。随着生物化学和邻近化学标记的不断发展，其他一些具有共价标记能力的工具酶也逐渐应用到邻近标记技术中。
3.3.1 基于细菌蛋白Pup连接酶PafA的邻近标记技术
研究人员在细菌内发现一种叫做Pup的小分子蛋白，该蛋白由64个氨基酸组成，其C端带有由甘氨酸（G, Gly）-甘氨酸-谷氨酰胺（Q, Gln）三氨基酸组成的末端残基[52]。在细菌内，Pup最末端的Gln脱氨形成Glu，成为PUP（E），在ATP的辅助下，被Pup连接酶——蛋白酶体辅助因子A（proteasome accessory factor A, PafA）催化磷酸化，并共价连接到邻近蛋白的赖氨酸残基侧链上。利用该反应过程，Liu等[52]开发了一种全新的邻近标记系统并命名为PUP-IT（pupylation-based interaction tagging）。他们将PafA蛋白与诱饵蛋白融合，以Pup为底物，标记与诱饵蛋白发生相互作用的目的蛋白，实现对膜蛋白相互作用的捕捉（图1-G）。利用该系统，他们以细胞膜上CD28蛋白为研究对象，鉴定得到多个已知可与CD28发生相互作用的蛋白，同时也发现了大量目前未知但潜在的可能与CD28存在相互作用的细胞膜蛋白。PUP-IT系统能够捕捉较弱的细胞膜蛋白相互作用，且参与反应的各组分均可在细胞中表达，能够通过基因转导的方式在活体动物体内表达并进行膜蛋白相互作用的研究。另外，该系统的标记过程不需H2O2的参与，细胞毒性小。但是底物Pup相对分子质量相对较大，无法跨膜，因此不能用于细胞器膜蛋白相互作用的鉴定。且PUP-IT系统中存在自我修饰的情况，可能导致酶的失活与底物的耗尽，在质谱分析中产生较大的非特异性背景。
3.3.2 基于转肽酶SrtA的邻近标记技术
细胞-细胞相互作用是生命过程中最基本的信息传递方式之一，在免疫系统和神经系统的多种生理过程中承担着重要的角色[53]，大多数的免疫反应都是通过细胞间的接触与信号交换来进行的，细胞膜蛋白之间的相互作用就是其中一个重要途径。为了检测不同类型免疫细胞及其靶细胞间的膜蛋白相互作用，Pasqual等[54]利用金黄色葡萄球菌分选酶A（Sortase A, SrtA）和5个N端甘氨酸残基组成的标签（G5）构建了一种邻近标记方法，称其为LIPSTIC（Labelling Immune Partnerships by SorTagging Intercellular Contacts）。他们将SrtA和G5与不同的受体配体蛋白分别融合，在293T细胞中过表达，并以生物素-LPETG肽作为标记底物。当在两种细胞因膜表面的受体配体作用而靠近时，SrtA催化生物素-LPETG肽与G5的共价连接，以标记邻近细胞膜蛋白（图1-H），通过流式细胞术对生物素进行跟踪即可对细胞膜蛋白相互作用进行鉴定。利用LIPSTIC技术，他们在体内和体外的情况下探究了树突状细胞（dendritic cell, DC）与CD4+T细胞间的相互作用。LIPSTIC技术中的生物素底物易合成，而且SrtA的细胞毒性低[55]，适于动物体内进行活体研究。但是SrtA催化的共价连接是可逆的，催化速度较慢，且需要加入较高浓度的多肽底物来保证连接效率[56−57]。
3.3.3 基于岩藻糖基转移酶FT的邻近标记技术
邻近标记技术已经被广泛应用于膜蛋白相互作用以及空间蛋白组学的研究中，但其在细胞间通讯方面的实际应用并不充分。下面，介绍一种从细胞膜蛋白相互作用角度探究细胞间相互作用的技术。Wu等[58]利用DC细胞能够吞噬、分解并呈递肿瘤抗原的特性，构建了一种基于活细胞并以岩藻糖基转移酶[H. pyloria(1, 3)Fucosyltransferase, FT]为核心的邻近标记技术，为FucoID。FT可识别天然供体底物鸟苷二磷酸岩藻糖（guanosine 5'-diphospho-fucose, GF）并将其与蛋白的偶联物转移到细胞膜的N-乙酰乳糖胺（N-acetyllactosamine, LaNAc）上。利用这一反应，研究者在DC上表达诱饵蛋白，与化学合成的GF-FT复合物共孵育，构建DC-FT细胞偶联物。当DC与表达目的蛋白的细胞发生相互作用后，FT将生物素化的底物转移到表达目的蛋白的细胞表面的LacNAc上，完成标记过程（图1-I）。通过流式细胞术和RNA测序技术（RNA sequencing, RNA-Seq）即可鉴定细胞膜蛋白之间的相互作用。利用该技术，研究者在黑色素瘤、乳腺癌和结肠癌模型中捕获了肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen, TSA）反应性CD8+T细胞，并对其中的效应T细胞与旁观者T细胞加以区分。该系统能够兼容MHC Ⅰ类和MHC Ⅱ类分子，特异性高且操作简单，具有临床应用的潜力，适用于原代细胞胞间相互作用的研究。但是与基于生物素连接酶或过氧化物酶的邻近标记技术相比，FucoID标记所需时间较长，且标记范围有限。
3.4 基于小分子催化探针的邻近标记技术
基于催化探针的邻近标记技术是一种依靠受体-配体蛋白相互作用进行标记的特异性邻近标记技术，通过在受体与配体蛋白上分别结合标记反应基团和待标记氨基酸残基鉴定膜蛋白相互作用。其标记过程与天然酶的邻近效应相似，在受体与配体蛋白足够接近的时候，通过小分子探针催化的共价交联反应即可实现蛋白的共价标记[59−60]。
基于Fe（Ⅲ）催化探针的邻近标记技术就是这类邻近标记技术中的一种。在Fe3+的催化作用下，H2O2被分解产生羟基自由基，氧化邻近的蛋白分子。结合羟基自由基蛋白印迹（hydroxyl radical protein footprint，HRPF）技术和邻近标记技术，Li等[61]构建了一种抗原抗体邻近标记方法（antigen-antibody proximity labeling，AAPL）。他们先将抗体通过共价修饰引入Fe3+催化基团，构建FeDBAb抗体。而后，他们以Na+/K+ATP酶α1（ATPase Na+/K+ transporting Subunit Alpha 1, ATP1A1）或表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）作为诱饵蛋白，将配对抗体加入培养液中与该蛋白特异性结合，在H2O2存在的情况下，Fe3+催化羟基自由基生成，氧化标记与诱饵蛋白发生相互作用的目的膜蛋白（图1-J）。他们以两种细胞的正常蛋白氧化水平为标准，对细胞膜上蛋白氧化情况进行打分，得到了发生相互作用的目的膜蛋白库。通过该方法，研究者发现了与ATP1A1和HER2发生相互作用的已知的大部分膜蛋白，同时也发现了大量未知的具有相互作用的膜蛋白。该技术在研究细胞膜蛋白相互作用方面具有较高的特异性，适用于膜蛋白参与的蛋白相互作用网络的探究。但是该方法的标记反应需要H2O2，对细胞活力有一定影响。另外，其他因素导致的蛋白氧化也可能会导致假阳性的标记结果。
4. 总结与展望
近年来，随着细胞膜蛋白相互作用在生理生化过程中的意义逐渐被人们所重视，多种邻近标记技术已经被开发出来，并被应用于细胞与细胞器膜蛋白相互作用的研究中。传统的邻近标记技术利用生物工具酶与诱饵蛋白融合，催化标记与诱饵蛋白发生相互作用的目的蛋白，其中生物素连接酶经过多代突变改良，其活性与标记效率有明显提高，但因相对分子质量大而产生的空间位阻仍可能对膜蛋白相互作用的鉴定造成一定影响。而过氧化物酶的标记效率高，空间位阻小，但其标记体系需要H2O2的参与，会产生细胞毒性。基于其他新开发催化酶与催化探针的邻近标记技术对传统的邻近标记技术进行了补充，但也存在标记半径小、非特异性背景高等问题，仍具有改进的空间。随着分子生物学、生物化学与蛋白组学等学科的发展，细胞膜蛋白邻近标记技术由生物素与蛋白的共价连接向更丰富的方向发展，目前已出现利用金属离子催化氧化[61]、蛋白-糖基结合[58]以及利用细菌蛋白进行邻近标记[52]的方法。在生命科学的不断进步之下，还会有更多高特异性、高灵敏度的邻近标记技术被开发出来。
目前的邻近标记技术被广泛应用于信号通路分析、酶-底物相互作用研究、蛋白相互作用的解析以及对基因组特定位置的结合蛋白的分析等，但其在细胞相互作用领域的应用仍有较大发展空间。从这些邻近标记技术的应用方向中也可以发现，研究者们已经逐渐认识到它们在免疫学领域的应用价值，并开始在抗原特异性TCR筛选、抗体筛选等方面进行尝试。本文中基于SrtA、岩藻糖基转移酶FT和Fe（Ⅲ）催化探针的邻近标记技术在抗原特异性T细胞的筛选和肿瘤新靶点的获得的研究中具有巨大潜力，这也为未来邻近标记技术的构建与应用前景发展指引了方向。而且伴随着检测分析技术的发展，未来邻近标记技术将会通过与质谱技术、RNA-seq技术、流式细胞术等技术相结合而不断进步，提高检测结果的准确性与灵敏度，获目的蛋白的基因序列信息，从分子水平上对膜蛋白相互作用进行更深一步的研究。
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Figure 2. Influence of excipient prescription dosage on osmotic pressure ($ \bar{x}\pm s $, n=3)
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Figure 3. Effect of sodium thiosulfate pentahydrate dosage on content stability ($ \bar{x}\pm s $, n=3)
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Figure 7. Comparison of IL-6,IL-1β,TNF-α and IL-17α between lifitegrast eye drops and CsA eye drops ($ \bar{x}\pm s $, n=3)
*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs 0 d group
Table 1 Accuracy test results of lifitegrast eye drops
Solution Added/ (mg/mL) Measured/ (mg/mL) Average/% SD/% 80% 0.4018 0.4081 101.55 0.8124 100% 0.5023 0.5117 101.88 0.6113 120% 0.6028 0.6096 101.13 0.7079 
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Table 2 Precision test results of lifitegrast eye drops
Solution Added/
（mg/mL）Measured/
（mg/mL）Content/% RSD/% Repeatability-1 0.5 0.5189 103.79 0.5 Repeatability-2 0.5153 103.06 Repeatability-3 0.5134 102.68 Repeatability-4 0.5149 102.97 Repeatability-5 0.5128 102.56 Repeatability-6 0.5126 102.51 Intermediate precision-1 0.5230 104.60 1.5 Intermediate precision-2 0.5134 102.68 Intermediate precision-3 0.5141 102.83 Intermediate precision-4 0.5189 103.78 Intermediate precision-5 0.5026 100.52 Intermediate precision-6 0.5230 104.61
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Table 3 Ocular irritation result of lifitegrast eye drops
t/d Left eye Right eye A1 A2 A3 Total Average A1 A2 A3 Total Average 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 6 0.25 0.25 0 0.25 0.16 0 0 0 0 0 7 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0 0 0 0 0 A1: Assesment 1; A2: Assesment 2; A3: Assesment 3
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