Recent advances in bioactivity evaluation methods of uric acid-lowering compounds
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摘要:
高尿酸血症(hyperuricemia，HUA)是由于体内尿酸升高所导致的一种代谢性疾病，与心血管疾病、代谢紊乱和肾脏并发症风险升高密切相关。活性评价是降尿酸药物研发至关重要的环节。目前，降尿酸药物的活性筛选方法大致分为体外和体内两种，体外筛选主要是基于黄嘌呤氧化酶、尿酸转运蛋白、嘌呤核苷磷酸化酶等靶点建立模型，而体内降尿酸筛选则通过啮齿类、禽类动物及类器官等模型实现。因此，从体内、体外两个方面全面综述了降尿酸化合物的活性评价方法，旨在为降尿酸药物的研发提供信息。
Abstract:Hyperuricemia is a metabolic disease caused by elevated uric acid in the body, and is closely related to the increased risk of cardiovascular disease, metabolic disorders, and renal complications. In the development process of uric acid-lowering drugs, activity evaluation is a crucial step. At present, the activity screening methods of uric acid-lowering drugs can be roughly divided into two categories: in vitro and in vivo. In vitro screening is mainly for such targets as xanthine oxidase, urate transporters, and purine nucleoside phosphorylase, etc.; while in vivo screening is achieved by rodent, poultry and organoid models. In this article, the activity evaluation methods for uric acid-lowering compounds are comprehensively summarized both in vitro and in vivo, aiming to provide some insight for the development of uric acid-lowering drugs.
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Keywords:
- hyperuricemia /
- gout /
- uric acid lowering /
- activity evaluation /
- drug discovery
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高尿酸血症(hyperuricemia, HUA)以体内血清尿酸盐水平升高为主要特征，是痛风、肾结石等疾病的重要生化基础。近年来，HUA和痛风的患病率越来越高，并与高血压、高血脂、肾损伤及心血管疾病等有着密切联系[1]，严重威胁人类健康。尿酸作为HUA诱发的危险因素，其在人体内的产生与代谢过程中至关重要。人体内约80%的尿酸来源于体内氨基酸等其他小分子化合物合成或由体内核酸分解代谢，其余尿酸则通过富含嘌呤或核蛋白的食物分解代谢产生[2]。血清尿酸盐的代谢则主要由肾脏或肠道中的尿酸盐转运蛋白进行调节。多种酶或转运体参与尿酸的产生和排泄过程，如黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)、嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase, PNP)、葡萄糖转运体9 (glucose transporter 9, GLUT9)、尿酸转运蛋白1 (urate transporter 1, URAT1)和三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2 (ATP-binding cassette superfamily G member 2, ABCG2)等。因此，在尿酸的生成与代谢过程中，酶和转运体的失调会导致尿酸生成过多和(或)排泄减少，最终诱发HUA和痛风。
在降尿酸新药研发过程中，建立安全稳定且可靠的降血尿酸化合物的活性筛选方法尤为重要。目前降尿酸药物的活性筛选方法包括体外和体内筛选。体外筛选方法主要是基于降尿酸药物的治疗靶标，建立针对关键靶点的筛选模型。体内筛选方法则是通过给予一定的造模药物或是基因干预手段建立HUA动物模型。本文综述了近年来降尿酸化合物的体内外活性筛选方法的研究进展，为降尿酸药物的早期筛选和研发提供参考依据。
1. 基于靶标的体外活性评价方法
在尿酸的生成与排泄过程中，有多种酶和尿酸转运蛋白共同维持体内尿酸代谢平衡。腺苷是体内尿酸合成的起始原料，通过肝脏中PNP的水解后形成次黄嘌呤(hypoxanthine)，再经XOD氧化形成黄嘌呤 (xanthine, XA)进而生成尿酸[3]。此外，腺嘌呤核苷脱氨酶(adenosine deaminase, ADA)同样也参与了嘌呤代谢，其间接催化次黄嘌呤生成尿酸(图 1-A)。人体内生成的尿酸在生理条件下(pH 7.4)主要以阴离子形式存在，其代谢主要在肾脏中进行，由多种分布在肾近端小管细胞基底外侧膜和顶端膜上的尿酸转运蛋白进行调节。如位于近端小管顶端膜上的URAT1、有机阴离子转运蛋白4 (organicanion transporter 4, OAT4)、有机阴离子转运蛋白10 (organicanion transporter 10, OAT10)和位于肾小管上皮细胞的GLUT9等可介导尿酸盐从管腔进入细胞；位于肾小管管腔顶端膜上的无机磷酸盐转运蛋白1 (inorganic phosphate transporters 1, NPT1)、无机磷酸盐转运蛋白4 (inorganic phosphate transporters 4, NPT4)、多药耐药蛋白4(multidrug resistance protein 4, MRP4)和ABCG2蛋白等可将胞内尿酸盐外排至肾小管管腔中；同时，肾近端小管基底外侧膜也有尿酸转运蛋白控制尿酸盐的转运，可将尿酸盐运输至近端小管细胞，包括有机阴离子转运蛋白1 (organicanion transporter 1, OAT1)、有机阴离子转运蛋白2 (organicanion transporter 2, OAT2)、有机阴离子转运蛋白3 (organicanion transporter 3, OAT3)[4−5] (图 1-B)。
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Figure 1. Diagram of uric acid formation(A) and excretion process(B)PNP: Purine nucleoside phosphorylase; ADA: Adenosine deaminase; XOD:Xanthine oxidase; ABCG2: ATP-binding cassette superfamily G member 2; GLUT9: Glucose transporter 9; OAT1: Organicanion transporter 1; OAT2: Organicanion transporter 2; OAT3: Organicanion transporter 3; URAT1: Urate transporter 1综上，建立以上关键靶标的体外活性评价方法对于降尿酸药物小分子的筛选及药效学评价具有重要意义。因此，本节主要介绍尿酸生成与排泄过程中的关键酶及尿酸转运蛋白的活性筛选方法研究进展，希望能够为降尿酸药物的研发提供参考。
1.1 XOD抑制剂体外活性筛选模型构建及应用
XOD在催化次黄嘌呤和XA最终生成尿酸过程中发挥关键作用。因此，抑制XOD的活性可达到降尿酸的效果。以别嘌醇(allopurinol)、非布司他(febuxostat)为代表的XOD抑制剂是临床使用的一线降尿酸药物(图 2)，但这些药物均存在严重的毒副作用，且可能对肝肾功能及心肌功能造成一定的损伤[6]。托匹司他(topiroxostat)于2013年在日本上市，属新型非嘌呤类XOD抑制剂，其有效性与安全性均优于别嘌醇[7]。此外，Welfide公司研发的一种新型XOD抑制剂(Y-700)，其IC50为0.0043~0.0065 μmol/L，目前正处于临床研究阶段[8]。因此，此类药物的优化仍具有重要的意义。
目前已构建的较稳定的XOD抑制剂体外筛选方法主要包括酶动力学法[9]、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)和电化学生物传感法[10]和紫外分光光度法等，但由于酶动力学法易受环境等因素影响，HPLC法不适于大量样品的分析，电化学生物传感法不适于含有复杂成分的分析。因此，在体外活性评价中，紫外分光光度法最为常用。
1.1.1 紫外分光光度法
在XOD的催化下，底物次黄嘌呤或XA被氧化生成尿酸。在此反应过程中，尿酸的生成量和XOD的活力成正比，因此可通过分光光度法测定反应体系中单位时间内尿酸(在约290 nm处有特征吸收峰)的生成量，从而反映XOD活性的大小(图 3)。Zhu等[11]选用16.7 U/L的XOD，200 μmol/L的底物XA浓度，反应温度25 ℃及反应30 min的体系建立了XOD抑制剂的高通量筛选模型，并使用该模型筛选到27个活性较好的化合物。Yan等[12]选择牛奶来源的XOD，以XA为反应底物，在恒定的温度、时间及pH下反应，于特定波长下检测生成尿酸的水平，并以非布司他作为阳性对照药(IC50 = 0.0010 μmol/L)，建立了XOD抑制剂的体外筛选模型。同时，利用该模型探究化合物CC18013对XOD的抑制活性(图 2)，具体方法为在磷酸钠缓冲体系(pH 7.4)中，加入3 U/L的XOD、50 μmol/L的XA以及不同浓度的化合物CC18013，于37 ℃恒温条件下反应20 min后采用酶标仪读取293 nm波长处的光密度值。结果表明，化合物CC18013对XOD的IC50为0.0046 μmol/L，与非布司他效果相当[13]。需要注意的是，体外筛选XOD抑制剂时，要设置空白对照实验以排除待测样品的吸光度干扰。同时，XOD在有氧条件下催化次黄嘌呤和XA转化为尿酸的代谢过程中，伴有大量的超氧阴离子自由基(O2· −)和过氧化氢(H2O2)等活性氧分子产生[14]。因此，XOD活性的测定也可基于超氧阴离子含量来表征(图 3)。四氮唑蓝染料(WST-1)可作为超氧阴离子生成量的探针，其与超氧阴离子反应生成水溶性的染料甲臜，因此通过测定在450 nm处甲臜的光吸收也可以反映XOD的活性。Xie等[15]在50 μL反应体系中，加入10 U/L XOD反应15 min后，再加入1 mmol/L XA底物，利用酶标仪进行双波长检测A295和A450，发现XOD抑制剂别嘌醇对XOD(IC50 = 3.28 μmol/L)和氧自由基的生成均有抑制作用(IC50 = 3.31 μmol/L)。同时该实验也测得超氧阴离子清除剂丹酚酸A仅对氧自由基有清除作用(IC50 = 1.44 μmol/L)，进而验证了该体系可用于XOD抑制剂和自由基清除剂双机制的筛选。
此外，利用紫外分光光度法也可探究化合物与XOD的作用模式。依据酶动力学实验结果可将XOD抑制剂分为竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂、混合型抑制剂。其测试方法和上述XOD活性实验方法相同，不同之处在于底物的浓度。结果以米氏常数(Km)和最大反应速度(Vmax)表征：当酶的表观Km增加时，酶的Vmax减小，则为混合型抑制剂；当Km增加，Vmax不变时，则为竞争性抑制剂；当Km不变时，Vmax减小时，则为非竞争性型抑制剂。如Zhang等[16]在不同的底物浓度(75、100、150、200、250、300 μmol/L)下探究代表化合物1和2与XOD的作用模式，发现其均为混合型抑制剂，优先与游离酶结合，而不是与酶底物复合物结合。
1.1.2 细胞模型构建及应用
HUA体外细胞模型相比于体内动物模型更适合筛选降尿酸药物，但目前采用HUA细胞模型筛选降尿酸药物鲜有报道。HK-2细胞来源于人肾小管上皮细胞，缺乏尿酸酶，是模拟人体内尿酸生成与代谢的良好模型。Hou等[17]利用尿酸前体物质腺苷(2.5 mmol/L)诱导HK-2细胞30 h后，再添加XOD 继续孵育8 h，经HPLC分析，模型组尿酸水平显著升高，基本构建了HUA细胞模型。随后，该课题组进一步优化了细胞模型：利用0.5 mmol/L的腺苷孵育HK-2细胞24 h后，添加外源性XOD联合诱导HK-2细胞1 h，使腺苷诱导的次黄嘌呤最终转化为尿酸。经HPLC分析，细胞上清液中的尿酸水平达到1.519 mmol/L，这与HUA患者的尿酸水平相当(图 4)。因此，该课题组利用此细胞模型评估WML和PGASCN两种多肽的活性，结果显示其尿酸水平降低至1.183 mmol/L和1.292 mmol/L，验证了该HUA细胞模型的可靠性[18]。此外，该方法大大缩短了加入XOD后的孵育时间，药物作用机制更清晰，适合于高通量筛选。
1.2 PNP体外筛选模型及应用
PNP是嘌呤补救合成途径的关键酶之一，能可逆催化嘌呤核苷磷酸解反应，将底物嘌呤核苷分解成对应的嘌呤碱及核糖-1-磷酸。Ulodesine 是美国Biocryst公司研发的一种高度专一抑制PNP的新型降尿酸药物，目前处于临床Ⅱ期。其作用于嘌呤代谢上游途径，进而减少体内次黄嘌呤及XA的累积，以达到降低血尿酸的目的。同时研究者还发现Ulodesine还能用于治疗免疫系统疾病、淋巴系统疾病以及银屑病等，处于早期临床研究阶段。PNP抑制剂的筛选方法相似于XOD活性测试方法，但所用底物不同。PNP可将肌苷转化为次黄嘌呤，再经XOD将其转化为尿酸。因此，Bantia等[19]利用该原理，选用终浓度为50 μmol/L 的肌苷作为底物，将不同浓度的Ulodesine加到含有PNP、XOD以及PNP分析缓冲液的96孔板中，之后孵育10 min，再加入底物，随即测定293 nm下的吸收度。同样，Yang等[20]采用酶动力学分析方法测定了Ulodesine对PNP的体外抑制作用：取50 μL不同浓度的Ulodesine溶液和50 U/L的PNP溶液及浓度为0.56 mmol/L肌苷底物100 μL，依次加入到96孔板中，采用酶标仪在293 nm处每隔1 分钟测定吸收度。结果显示在Ulodesine终浓度大于6.25 nmol/L时，抑制率高达90%，其IC50为0.002 3 µmol/L，表明Ulodesine对PNP具有极强的抑制作用。
1.3 URAT1抑制剂体外筛选模型及应用
URAT1是人肾小管重吸收尿酸的重要转运蛋白，控制肾小球滤过后大部分的尿酸重吸收。2002年，Enomoto等[21]首次通过人类基因组数据库分析鉴定出肾脏特异性尿酸盐转运蛋白URAT1 (由SLC22A12编码)，并证明该分子是改变血清尿酸盐水平并引起特发性肾性低尿酸中毒的药物靶标。随后，研究者们发现许多已批准的降尿酸药物属于URAT1抑制剂。因此，通过使用抑制尿酸重吸收进而促进尿酸排泄的URAT1抑制剂成为治疗痛风新的有效治疗手段。丙磺舒(probenecid)和苯溴马隆(benzbromarone) 是高效促尿酸排泄剂，但因严重的肝肾毒性和有限的疗效已从欧洲和美国市场上退出了痛风治疗，仅在亚洲和其他地区仍为临床一线痛风治疗药物[22]。2015年美国FDA批准新型促尿酸排泄抑制剂雷西纳德(lesinurad)用于治疗HUA，但由于其药效低且存在严重肾毒性，目前已逐渐撤市[23]。2020年，日本Mochida制药公司和富士药品联合开发的一种最新的URAT1抑制剂多替诺雷(dotinurad)，其作为苯溴马隆的衍生物，具有远超先导化合物的体内降血尿酸活性[24]。近年来，新型URAT1抑制剂是降尿酸药物的开发热潮，如雷西纳德衍生物RDEA-3170和SHR4640是目前用于治疗HUA和痛风最有开发前景的候选药物，正处于临床评估阶段。此外，还有URC-102、SAP-001等新型URAT1抑制剂也正处于临床早期研究阶段，故建立URAT1抑制剂筛选模型具有十分重要的意义。
目前，以URAT1为作用靶点的HUA治疗药物体外筛选模型主要在细胞水平开展。主要采用肾小管细胞模型，包括人胚肾293 (HEK293)细胞、人胚肾293T (HEK293T)细胞、肾小管上皮(HK-2)细胞、狗肾(MDCK)细胞、小鼠肾(RTECs)细胞等。然而，不论选用哪种细胞模型，主要方法均为基于放射性元素标记法，但该方法存在一定局限性。值得注意的是，随着荧光探针广泛应用于体外化合物筛选过程中，以荧光物质作为蛋白底物的荧光检测法用于体外筛选URAT1抑制剂成为新的选择。
1.3.1 放射性元素标记法
Wempe等[25]将人的尿酸转运蛋白1 (human urate transporter 1, hURAT1)与非洲爪蟾卵母细胞结合，使体外表达的卵母细胞系统在体内模拟hURAT功能。将14C尿酸和受试化合物置于卵母细胞外液中，60 min后测定细胞内的放射性，由此研究新型苯溴马隆类似物对14C尿酸摄取的能力。Zhao等[26−27]在高效稳定表达hURAT1的HEK293T细胞系中，加入特定浓度化合物溶液50 μL共孵育30 min，随后加入50 μmol/L 14C尿酸进行URAT1介导的尿酸吸收。最后向细胞裂解液中加入闪烁液0.2 mL，使用Micro Beta2液体闪烁检测仪测定代表化合物在不同浓度下细胞摄取14C尿酸的放射值，从而计算各化合物对于URAT1的体外抑制活性(图 5)。由此方法筛选得到的化合物3 (IC50 = 1.57 μmol/L, lesinurad: IC50 = 13.21 μmol/L)和4 (IC50 = 1.36 μmol/L, lesinurad: IC50 = 5.54 μmol/L)对URAT1的抑制活性远超阳性药物雷西纳德。另外，Chen等[28]构建了表达SLC22A12 (hURAT1编码基因)的慢病毒载体，通过感染MDCK细胞后筛选出稳转细胞株，采用Western blot及免疫荧光方法检测目的蛋白的表达，并通过液闪计数仪检测hURAT1稳转株对14C尿酸的摄取作用及URAT1抑制剂苯溴马隆及丙磺舒对14C尿酸摄取的抑制效果。实验结果表明，hURAT1稳转株对尿酸吸收的Km为365.4 μmol/L，苯溴马隆及丙磺舒对尿酸吸收的IC50分别为0.18和66.82 μmol/L，验证了该方法的准确性。虽然放射性同位素方法具有灵敏度高的优点，但其存在成本高昂和污染环境的问题，限制了该方法的应用。
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Figure 5. HEK293T cell system expressing human urate transporter 1(hURAT1) protein was constructed by gene transfection1.3.2 荧光检测法
Zhou等[29]建立了一种以6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein, 6-CFL)为底物的基于荧光法的URAT1抑制剂体外评价方法。首先将hURAT1基因连接在质粒，并将其成功转染至HEK293T细胞系，作为URAT1抑制剂体外活性筛选的细胞模型。随后将经细胞毒性测试后的待测化合物及底物6-CFL加入培养基中，得到混合物后进行共培养。结果以细胞对荧光底物摄取能力的变化，即荧光强度的变化，来评价化合物对URAT1的体外抑制活性。该团队利用该模型筛选得到的化合物5具有较强的URAT1抑制效力，其IC50为10.82 μmol (苯溴马隆、丙磺舒和雷西纳德的IC50分别为14.25、1518.67和273.5 μmol)。该方法相比于放射性元素标记法，成本较低，无环境污染，还可进行高通量筛选，是一种新颖的URAT1抑制剂筛选方法。
1.4 GLUT9抑制剂体外筛选模型及应用
GLUT9主要位于肾小管上皮细胞基底膜，主要负责将管腔内的尿酸转运到血液中，对于维持体内正常血尿酸水平发挥重要的作用，是开发降尿酸药物的潜在靶点。GLUT9有两种剪接变异体，即GLUT9a和GLUT9b, 但二者对尿酸的转运功能无差异。Chen等[30]将目标基因片段GLUT9a克隆到表达载体pcDNA3.1(–)中，表达小鼠GLUT9a cDNA的质粒转化到大肠埃希菌中，于37 ℃下培养16 h。再将pcDNA3.1(–)-GLUT9a重组质粒与增强型绿色荧光蛋白表达质粒转染24 h后，成功建立高表达的小鼠GLUT9a的HEK293T细胞模型。并使用膜片钳技术进行了电生理记录(图6)。为评估该细胞模型用于GLUT9抑制剂筛选的适用性，作者进一步探究了苯溴马隆和丙磺舒对尿酸盐诱导电流的抑制作用。结果表明，苯溴马隆和丙磺舒呈剂量依赖性抑制尿酸盐诱导的电流，IC50分别为28.58和731.40 µmol/L。该方法操作较简单，且结果重复性好。
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Figure 6. Schematic representation of the experimental protocol of patchlamp experiments1.5 ABCG2抑制剂体外筛选模型及应用
ABCG2是ABC转运蛋白超家族的成员，其最早在乳腺癌细胞中发现[31]。ABCG2不仅在癌组织中表达，在许多正常组织(如小肠和肾)中也高度表达，同时也是维持体内尿酸稳态的重要转运体，负责将尿酸经肾脏与肠道排出体外[32]。由于ABCG2为尿酸外排转运体，普通细胞无法进行摄取实验研究降尿酸化合物的ABCG2抑制能力，因此将细胞制备成膜囊泡摄取同位素标记的14C尿酸是目前最直接有效的方法。Zheng等[33]优化膜囊泡制备的方法建立了ABCG2抑制剂的体外筛选模型。利用脂质体将表达ABCG2的载体转染至HEK293细胞，筛选阳性克隆株后，鉴定ABCG2稳转细胞株。再利用差速离心法提取膜囊泡，通过14C尿酸同位素摄取实验筛选ABCG2抑制剂(图7)。具体方法为：将14C尿酸加入膜囊泡混合物中并加入不同浓度待测化合物后于37 ℃孵育30 min。再加入4 mmol/L ATP开始反应，15 min后用冰冷DPBS缓冲液停止反应。离心洗掉囊泡外尿酸溶液后，将沉淀取出，加入0.1 mol/L NaOH使囊泡溶解，此时，囊泡内释放的尿酸即为ABCG2摄取的尿酸。加入闪烁剂0.5 mL，与同位素充分混匀，随后用液体闪烁计数仪测定每分钟的放射值，并计算化合物抑制率。利用该细胞模型，作者评估了苯溴马隆(IC50 = 3.45 μmol/L)对ABCG2的抑制活性，且首次发现RDEA-3170对ABCG2也有抑制活性(IC50 = 9.90 μmol/L)。
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Figure 7. Procedures of ATP-binding cassette superfamily G member 2(ABCG2) membrane vesicle preparationand inhibitor screening1.6 OAT1、OAT3、OAT4体外筛选模型及应用
有机阴离子转运体家族(OATs)主要包括OAT1、OAT2、OAT3、OAT4、OAT10，其中OAT1、OAT3分别由SLC22A6和SLC22A8基因编码，介导尿酸盐的分泌；OAT4位于肾小管上皮刷状缘，由SLC22A11基因编码，参与尿酸盐的重吸收和转运[34]。在筛选方法中这些转运蛋白底物的使用有所差异。OAT1的底物常采用对氨马尿酸或荧光底物6-CFL。Wu等[35]构建pcDNA3.1-OAT1的质粒，随后转染至MDCK细胞，经筛选获得阳性克隆。通过测定OAT1的经典底物6-CFL在单克隆细胞内的积聚量对蛋白含量的比值衡量OAT1功能的指标。作者选取了对OAT1抑制能力较强的中药单体(50 μmol/L)测定对OAT1的抑制作用，其中，白杨素、槲皮素、大黄酸、木犀草素，对OAT1的抑制率分别达到84.49%、82.18%、91.20%和90.30%，与500 μmol/L丙磺舒的活性相当。由此证明该细胞模型可用于初步筛选OAT1抑制剂。Zhao等[36]利用上述OAT1的体外筛选模型及14C尿酸同位素摄取实验，测得新骨架化合物异补骨脂黄酮对OAT1和OAT3的IC50分别为4.38和3.64 μmol/L。Louisse等[37]评估了一系列全氟烷基化合物的体外转运能力，结果表明，与对照组细胞相比，OAT4转染的细胞对全氟烷基化合物的摄取增加了两倍以上，因此可作为OAT4的底物。
2. 体内降尿酸活性评价方法
体外筛选方法作用靶点较准确，数据较直观，且适用于药物的高通量筛选，但其不能充分反映药物的药理作用、药代动力学性质及安全性，需在安全且稳定的HUA动物体内模型中进一步验证。近年来，HUA的模型建立已见诸很多报道，其中啮齿类动物和禽类动物的模型被广泛应用，也有部分研究者选用家兔[38]或者斑马鱼[39]建立HUA模型。本节主要对增加尿酸来源、减少尿酸去路及其他造模方法进行系统的总结，并对常见的HUA动物类型进行综述。
2.1 HUA造模方法
由于腹腔注射尿酸会导致一过性血尿酸升高，不适于建立长期模型[40]。因此，增加体内尿酸的产生可以通过直接补充尿酸或尿酸前体物质，如腺嘌呤(adenine)、次黄嘌呤等，或通过饮食诱导的方式来实现。腺嘌呤是含氮杂环衍生物，结构与尿酸相似，给予高剂量的腺嘌呤可以增强体内XOD活性，加快尿酸的生成。但高浓度的腺嘌呤同时也会通过XOD的作用变成极难溶于水的2,8-二羟基腺嘌呤，其沉积在肾小管及肾小管间质，最终引起肾功能损害[41]。因此，基于腺嘌呤的模型更适合于评价慢性肾衰竭模型[42]。次黄嘌呤是尿酸生成的前体物质，在XOD的作用下生成尿酸前体物质XA，经过一系列酶促反应可转化为尿酸。单独使用次黄嘌呤可以升高体内尿酸的水平，但无法维持长期稳定的模型。同样，利用饮食结构的改变也可以诱导体内血尿酸水平升高。酵母在体内水解产生嘌呤碱和嘧啶碱等含氮有机碱，引起嘌呤代谢紊乱，促进尿酸生成。果糖是目前已知的唯一的能增加血尿酸水平的糖类[43]。由10%果糖诱导的模型表现为HUA、高血压和胰岛素抵抗，甚至代谢综合征，因此这种模型更有利于研究HUA伴随代谢综合征的复杂疾病。
减少尿酸的去路可以通过抑制尿酸排泄或抑制尿酸酶代谢的方式使体内尿酸升高[44]。乙胺丁醇(ethambutol)和烟酸是最常用的抑制尿酸排泄的药物，单独应用乙胺丁醇及烟酸诱导HUA少有报道，其常与其他机制造模药物联合诱导。同时，乙胺丁醇的肝毒性也限制了该药物的使用。氧嗪酸钾(postassium oxonate)是一种尿酸酶抑制剂，可竞争性与尿酸酶结合，抑制尿酸的分解，增加体内血清尿酸水平，被广泛应用于HUA动物筛选模型[45]，但其在数小时内可被小鼠快速代谢，无法长期单独用于建立HUA动物模型，常与酵母、腺嘌呤或乙胺丁醇联合使用以提高模型的成功率。
基因干预也是用于构建HUA动物模型的方法。尿酸排泄过程中，尿酸酶可将尿酸分解为尿囊素排出体外，肾小管上的转运蛋白体起分泌尿酸作用，因此通过敲除尿酸酶或尿酸转运蛋白基因，均可升高尿酸水平，建立HUA动物模型。
2.2 啮齿类动物模型建立
啮齿类动物属于哺乳动物，其生理病理过程以及种属上都与人类相近，是目前最常用的造模动物。实验室最常用的实验动物为小鼠(KM小鼠、C57小鼠)和大鼠(SD大鼠、Wistar大鼠)[46]。其饲养方便，繁殖快且价格便宜，可根据HUA不同的病理机制构建出不同类型的模型。人类在进化过程中尿酸酶基因缺失，而大鼠、小鼠体内尚存，因此在建立啮齿类HUA模型时与人类的患病机制仍存在较大的差异，常选用氧嗪酸钾与次黄嘌呤或其他造模药物联合应用，以消除尿酸酶带来的差异[47]。
2.2.1 小鼠HUA及合并其他代谢性疾病模型
常见的小鼠HUA造模法包括增加外源性尿酸、补充尿酸前体物质、抑制尿酸酶活性等。根据不同的造模药物、造模方式及造模剂量，可构建不同病程的HUA模型。表1、表2总结了小鼠HUA及合并其他代谢综合征的各种造模方法。
Table 1. Modeling method of hyperuricemia(HUA) and other metabolic syndrome in miceMedicine and dose Period Method Type Reference 250 mg/kg Uric acid 10 min ip Acute HUA [48] 75 mg/kg Adenine 28 d ig HUA [49] 250 mg/kg Postassium oxonate＋150 mg/kg Hypoxanthine 7 d sc＋ip HUA [50] 50 mg/kg Adenine＋200 mg/kg Postassium oxonate 21 d po HUA and kidney injury [51] 300 mg/kg Postassium oxonate 14 d ip HUA and kidney injury [52] 300 mg/kg Postassium oxonate＋300 mg/kg Hypoxanthine 10 d ip HUA in acute kidney disease [53] 400 mg/kg Postassium oxonate＋600 mg/kg Hypoxanthine 4 h sc＋ig Acute HUA [26] 2.2.2 小鼠痛风性关节炎模型
体内尿酸升高会导致尿酸盐(monosodium urate, MSU)晶体沉积，进而会引起痛风性关节炎、关节畸形，严重的可能导致痛风性肾病等。Coderre等[54]通过在踝关节局部垂直注射MSU晶体1.25 mg 成功建立急性痛风性关节炎动物模型，该经典造模方法是目前最常用、易于操作且稳定的动物模型，可以根据不同的实验目的改变方法或剂量。如Yin等[55]为研究桉油醇对痛风性关节炎的治疗作用及其相关机制，向小鼠踝关节内注射MSU晶体0.5 mg ，以注射后关节出现明显肿胀和机械性痛觉过敏判断造模成功与否，成功诱导小鼠痛风性关节炎模型，而且发现桉油酚能够显著降低MSU诱导的痛风关节炎小鼠踝关节组织中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3 (NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)和白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)等炎症因子的表达水平。同样，Vieira等[56]在研究肠道微生物群和代谢物传感受体G蛋白偶联受体43在痛风小鼠模型中的作用时也采用了向关节腔内注射MSU晶体混悬液100 µg的方式制备痛风关节炎模型。值得注意的是，在此模型中，MSU仅作为一种外源性介质，它与痛风实际所产生的尿酸盐有所不同，从本质上并不能完全代替人类痛风性关节炎的模型，故该模型仅适用于局部关节炎症的观察。
2.2.3 基因敲除小鼠模型
有研究者通过胚胎干细胞同源重组技术构建了第一个尿酸氧化酶基因敲除模型[57]，该尿酸酶缺陷型小鼠的平均血清尿酸盐浓度为11.0 mg/dL，约为野生型对照组(0.9 mg/dL)的12倍，但由于严重的肾病，死亡率高达65%，限制了该模型的使用。Lu等[58]通过转录激活物样效应核酸酶技术构建以C57BL/6J小鼠为背景的尿酸酶缺陷型小鼠，尿酸酶缺乏小鼠的平均血清尿酸盐浓度为11.0 mg/dL，约是野生型对照组(0.9 mg/dL)的12倍。但由于严重的肾病，死亡率高达65%；Lu等[58]通过转录激活物样效应核酸酶技术构建以C57BL/6J小鼠为背景的尿酸酶缺陷小鼠，尿酸酶缺陷小鼠的血清尿酸盐浓度与患有HUA的人类相似(即雄性为8.7 mg/dL，雌性为7.1 mg/dL)。此外，还有敲除GLUT9和ABCG2等相关尿酸转运蛋白基因位点的HUA动物模型。如Preitner等[59]在C57BL/6J和C57BL/6N混合遗传背景上构建了SLC2A9(编码GLUT9)敲除小鼠模型(G9KO)和一个肝脏特异性的SLC2A9敲除模型(LG9KO)。与野生型小鼠的平均血浆尿酸盐浓度(0.4~0.8 mg/dL)相比，所有SLC2A9敲除小鼠的血浆尿酸盐含量均增加：雄性和雌性G9KO小鼠分别为1.5和1.8 mg/dL，雄性和雌性LG9KO小鼠则分别为2.0和3.1 mg/dL。Toyoda等[60]通过使用CRISPR-Cas9系统敲除小鼠GLUT12基因，发现其功能障碍会导致血尿酸盐浓度升高，由此验证了GLUT12也是一种尿酸转运体。Takada等[61]在研究小鼠ABCG2基因敲除对尿酸排泄途径的影响时发现，该基因对尿酸肠道排泄途径影响较大，对肾脏排泄途径无影响，由此证明ABCG2基因在肠道尿酸转运过程中的重要性。
2.2.4 大鼠HUA及合并其他代谢性疾病模型
据统计，在HUA动物模型选择过程中以SD大鼠、Wistar大鼠、KM小鼠最为常见，其中SD大鼠占比49.82%[46]。
Table 2. Modeling method of hyperuricemia and other metabolic syndrome in ratsMedicine and dose Period Method Type Reference 600 mg/kg Adenine 5 d po HUA and acute renal failure [62] 750 mg/kg Postassium oxonate＋20% Yeast extract paste 21 d ig HUA [63] 100 mg/kg Adenine＋1500 mg/kg Postassium oxonate 28 d ig HUA nephropathy [64] 250 mg/kg Ethambutol＋200 mg/kg Adenine 28 d ig＋sc HUA and kidney injury [65] 300 mg/kg Postassium oxonate＋300 mg/kg Pyrazinamide 7 d sc＋ip HUA with poor uric acid excretion [66] 250 mg/kg Postassium oxonate＋250 mg/kg Ethambutol 42 d sc＋ig Chronic HUA [67] 100 mg/kg Adenine＋1500 mg/kg Postassium oxonate 35 d ig Chronic HUA and kidney injury [68] High-fat diet＋High-purine diet＋50 mg/kg Adenine＋100 mg/kg Potassium bisulfate 28 d po＋sc HUA causes atherosclerosis [69] Postassium oxonate＋2% NaCl 49 d po HUA and hypertension [70] 10% Fructose＋10% Postassium oxonate 98 d ig＋sc HUA and kidney injury [71] High-fat diet＋High-glucose diet＋275 mg/kg Postassium oxonate 28 d＋28 d po＋ip HUA and diabetes [72] 2.2.5 大鼠急性痛风性关节炎模型
由于小鼠急性痛风关节炎模型的建立存在MSU晶体注射失败率高、模型成功率低的问题，因此许多研究者选择大鼠作为研究对象。Zhou等[73]采用MSU晶体建立痛风性关节炎大鼠模型，其滑膜组织和血清中多种细胞炎症因子IL-1β、肿瘤坏死因子α 和白细胞介素6明显升高，且促炎因子富半胱氨酸蛋白61在MSU晶体诱导的大鼠滑膜组织中高表达，证明其通过上调促炎细胞因子发挥了重要的免疫调节作用。同样，Li等[74]在Wistar大鼠关节内注射MSU晶体诱导急性痛风性关节炎模型，探究低分子量透明质酸的抗炎作用，发现在较高剂量时(50 μg)，能够抑制因MSU注射导致的踝关节肿胀的发展。除此以外，Yao等[75]采用氧嗪酸钾(1.5 g/kg)灌胃21 d诱导HUA后，又使用在SD大鼠右踝关节注射MSU晶体50 μL 的方法制备了HUA和痛风炎双重疾病的动物模型。
2.2.6 基因敲除大鼠模型
Gao等[76]使用CRISPR/Cas9技术，通过删除尿酸酶基因的第2至第4外显子，构建了大鼠尿酸酶基因敲除模型。该尿酸酶缺陷型大鼠的血尿酸水平升高至48.3 µg/mL，显著高于野生型大鼠，且表现出明显的健康状态，超过95%的大鼠存活长达1年，成为研究HUA及相关疾病的替代模型动物。
2.3 禽类动物模型建立
禽类和人类一样本身不存在尿酸酶，其嘌呤代谢途径与人类更为相似，即尿酸是嘌呤代谢的最终产物。由于缺失尿囊素，禽类动物更易形成自发性HUA和痛风，故禽类比较适合作为HUA研究的模型。但禽类动物的遗传代谢与人类相差较大，且由于其饲养不便，模型的使用受到一定限制。当前，常用的以禽类为主的HUA模型主要选择鸡或鹌鹑作为实验动物。Hong等[77]用高蛋白饲料长期饲喂鸡，并在不同时间点检测血清尿酸水平的含量，发现在饲喂48 h后，血清尿酸水平升高，当鸡接受高蛋白饲料 144 h后，血清尿酸水平升高至约650 µmol/L，由此建立了长期HUA鸡模型。
Lin等[78]选择鹌鹑作为HUA动物模型，通过连续14 d给模型组鹌鹑饲喂高脂饲粮，引起鹌鹑腹部脂肪堆积，并伴有HUA和高胆固醇血症。与对照组相比，模型组高脂饲料饲喂14 d后腹部脂肪含量(P<0.05)、腹部及肝脂质指数(P<0.01)均显著升高。这种现象与腹部肥胖、HUA、高脂血症等代谢综合征患者的情况类似。Bian等[79]通过给模型组鹌鹑饲喂酵母浸膏粉配方建立HUA模型。与对照组相比，模型组尿酸水平从第7 天开始显著升高，并持续至第35 天，由此表明，用富含嘌呤日粮饲料饲喂鹌鹑，可成功建立HUA模型。
2.4 灵长类动物模型建立
与禽类动物相比，灵长类动物与人类高度同源，在进化过程中也失去了尿酸酶基因。其尿酸的合成代谢途径与人类最为相似，但其体型大，实验成本高，饲养难度大，不适于化合物的早期筛选，因此鲜有使用灵长类动物建立HUA模型。Tang等[80]在成年雄性恒猴体内腹腔注射200 mg/kg肌苷，1 h后血清尿酸值达到峰值(178.32 µmol/L)，成功建立了急性HUA模型。
2.5 类器官模型建立及应用
类器官是由多种细胞类型组成的三维(three-dimensional, 3D)结构，相比于传统的二维(two-dimensional, 2D)细胞培养，其更接近生理细胞的组成与行为而占据优势。许多类器官可以在培养基中长期扩增并保持基因的稳定性，更适于生物转染和高通量筛选[81−82]。与动物模型相比，类器官的操作更简便[83]。此外，由于动物模型存在物种差异，且人为诱发疾病只能模拟疾病的某一阶段，无法研究疾病发生和发展的全过程，而类器官既可用于体内外研究，还能用于研究疾病发生和发展的相关机制，是较好的能用于评估药物疗效的临床前模型。肝脏3D类器官技术在某种程度上概括了人类肝细胞的形态和功能特征，可用于分析复杂的遗传性疾病和癌症，在分析人类生物学与疾病机制体现出巨大的优势，也为类器官在医学应用中提供可能的机会[84]。Hou等[85]成功地从人类肝组织中培养了肝类器官，经XA诱导后其能产生高水平的尿酸，建立了在体外模拟HUA的3D类器官培养系统。并通过上市药物别嘌呤醇及已报道的具有HUA生物活性作用的葛根素对其进行验证，实验结果表明二者均可降低类器官的尿酸水平。因此，这种新型类器官模型具有用于降尿酸化合物的高通量筛选系统的开发潜力。
3. 总结与展望
随着社会的发展，人们生活方式和饮食结构发生改变，HUA的患病率逐年升高，目前已成为继高血压、高血糖、高血脂之后的“第四高”，同时其发病群体逐渐趋于年轻化[86]。因此，建立合适的降尿酸药物化合物的活性筛选方法是研究HUA发病机制和研发药物的关键步骤。
近年来，研究者对HUA动物模型的建立做出了很多新探索，根据不同的疾病需要建立了相应病理机制的HUA模型。虽然啮齿类动物和禽类动物因独特的优势深受研究者的青睐，但其与人类的种系差异依旧有较大的差别。动物种属的不同和检测方法的差异，使得目前尚未存在统一的造模药物标准，因此，动物HUA模型的标准建立还存在一定困难。与体内筛选方法相比，体外筛选方法可以在细胞和分子水平上进行，提高了药物的筛选效率，但是缺乏精准性，不能充分反映药物的药理作用以及机体对药物的吸收代谢过程，药物的有效性和机制还需要进一步在动物模型中验证。近年来研究者也在动物模型中探索长期模型以解决体内血尿酸水平不持续性、不稳定性的问题，比如，有研究者通过连续14 d给予小鼠氧嗪酸钾和腺嘌呤成功诱导HUA性肾病模型[87]，该模型表现出明显肾损伤，但其具体机制尚未阐明。因此，发掘更具新颖性和实用性的体外筛选方法仍然是未来新药开发的重要方向。
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Figure 1. Diagram of uric acid formation(A) and excretion process(B)PNP: Purine nucleoside phosphorylase; ADA: Adenosine deaminase; XOD:Xanthine oxidase; ABCG2: ATP-binding cassette superfamily G member 2; GLUT9: Glucose transporter 9; OAT1: Organicanion transporter 1; OAT2: Organicanion transporter 2; OAT3: Organicanion transporter 3; URAT1: Urate transporter 1
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Figure 5. HEK293T cell system expressing human urate transporter 1(hURAT1) protein was constructed by gene transfection
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Figure 6. Schematic representation of the experimental protocol of patchlamp experiments
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Figure 7. Procedures of ATP-binding cassette superfamily G member 2(ABCG2) membrane vesicle preparationand inhibitor screening
Table 1 Modeling method of hyperuricemia(HUA) and other metabolic syndrome in mice
Medicine and dose Period Method Type Reference 250 mg/kg Uric acid 10 min ip Acute HUA [48] 75 mg/kg Adenine 28 d ig HUA [49] 250 mg/kg Postassium oxonate＋150 mg/kg Hypoxanthine 7 d sc＋ip HUA [50] 50 mg/kg Adenine＋200 mg/kg Postassium oxonate 21 d po HUA and kidney injury [51] 300 mg/kg Postassium oxonate 14 d ip HUA and kidney injury [52] 300 mg/kg Postassium oxonate＋300 mg/kg Hypoxanthine 10 d ip HUA in acute kidney disease [53] 400 mg/kg Postassium oxonate＋600 mg/kg Hypoxanthine 4 h sc＋ig Acute HUA [26] 
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Table 2 Modeling method of hyperuricemia and other metabolic syndrome in rats
Medicine and dose Period Method Type Reference 600 mg/kg Adenine 5 d po HUA and acute renal failure [62] 750 mg/kg Postassium oxonate＋20% Yeast extract paste 21 d ig HUA [63] 100 mg/kg Adenine＋1500 mg/kg Postassium oxonate 28 d ig HUA nephropathy [64] 250 mg/kg Ethambutol＋200 mg/kg Adenine 28 d ig＋sc HUA and kidney injury [65] 300 mg/kg Postassium oxonate＋300 mg/kg Pyrazinamide 7 d sc＋ip HUA with poor uric acid excretion [66] 250 mg/kg Postassium oxonate＋250 mg/kg Ethambutol 42 d sc＋ig Chronic HUA [67] 100 mg/kg Adenine＋1500 mg/kg Postassium oxonate 35 d ig Chronic HUA and kidney injury [68] High-fat diet＋High-purine diet＋50 mg/kg Adenine＋100 mg/kg Potassium bisulfate 28 d po＋sc HUA causes atherosclerosis [69] Postassium oxonate＋2% NaCl 49 d po HUA and hypertension [70] 10% Fructose＋10% Postassium oxonate 98 d ig＋sc HUA and kidney injury [71] High-fat diet＋High-glucose diet＋275 mg/kg Postassium oxonate 28 d＋28 d po＋ip HUA and diabetes [72]
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期刊类型引用(1)
1. 王莉婷，刘湉，母磊鑫，王凯赫，柯彩依，吉莉，徐广，马群. 基于网络药理学和分子对接技术探讨车前子治疗高尿酸血症的作用机制. 江苏大学学报(医学版). 2024(05): 369-376+382 . 
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