Effects of Pseudomonas aeruginosa PmrB△Leu172 mutation on polymyxin B resistance
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摘要:
研究铜绿假单胞菌PmrB△Leu172突变对多黏菌素B耐药的影响。利用同源重组技术构建铜绿假单胞菌PmrB△Leu172突变株，利用微量肉汤稀释法测定多黏菌素B对野生株和突变株的最低抑菌浓度，利用转录组测序明确PmrB△Leu172缺失突变对基因转录水平的影响，利用反转录荧光定量PCR验证PmrB△Leu172缺失突变对铜绿假单胞菌中受PmrB调控的基因表达水平影响。PmrB△Leu172缺失突变株较野生株最低抑菌浓度与最低杀菌浓度分别提高了4和2倍，突变株表现出对多黏菌素B更强的耐受性；突变株中受PmrB调控的基因表达水平均显著提高。铜绿假单胞菌PmrB△Leu172缺失突变可引起PmrA-PmrB双组分系统的调控能力提升，从而导致铜绿假单胞菌对多黏菌素B产生抗性。
Abstract:This study aimed to investigate the effects of PmrB△Leu172 on polymyxin B resistance in Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa PmrB△Leu172 strain was constructed by homologous recombination technology, and the minimum inhibitory concentration of polymyxin B against wild type and mutant strains were determined by the broth microdilution technique. The effect of PmrB△Leu172 mutation on gene transcription level was determined by RNA sequencing. Reverse transcription quantitative PCR was used to verify the effect of PmrB△Leu172 mutation on the transcription level of PmrB-regulated genes in P. aeruginosa. The results showed that the minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of mutant strain were 4 and 2 times higher than that of wild-type, respectively, and the transcription level of PmrB-regulated genes was also up-regulated. The results suggested that PmrB△Leu172 mutation of P. aeruginosa can enhance the regulation of PmrA-PmrB two-componentsystem, which leads to the resistance of P. aeruginosa to polymyxin B.
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Keywords:
- Pseudomonas aeruginosa /
- pmrB /
- drug resistance /
- polymyxin B
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铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, PA）是一种常见的医院感染病原体[1]，可在患有慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、癌症、创伤、烧伤及免疫缺陷个体中发生急性或慢性感染[2]。近年来，随着广谱抗生素的广泛使用，多重耐药（multidrug-resistant, MDR）的PA引起的感染变得越来越常见。多重耐药指的是对3种或3种以上类别的抗生素不敏感，因此临床上治疗手段非常有限，而多黏菌素类抗生素是为数不多的对MDR-PA仍然有效的药物[3]。
多黏菌素类抗生素是20世纪40年代开发的一类用于治疗革兰氏阴性菌感染的脂肽类抗生素[4]。由于其抗菌谱窄，并具有明显的肾毒性和神经毒性，逐渐退出了临床[5]。然而，随着MDR革兰氏阴性菌感染逐年增加，尤其是耐碳青霉烯类革兰氏阴性菌的出现，使得多黏菌素类抗生素又重新在临床上使用[6]。
临床上使用的多黏菌素类抗生素主要有多黏菌素B和多黏菌素E。其中，多黏菌素B作为带有正电荷的阳离子多肽，可与革兰氏阴性菌外膜上带负电荷的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）结合，使得外膜破裂进而胞内容物流失，最终导致细菌死亡[7]。然而，PA可通过修饰LPS的脂质A成分，从而降低多黏菌素B与LPS的亲和力，最终导致耐药[8]。由arnBCADTEF操纵子编码的蛋白质介导，在脂质A成分中添加带正电荷的4-氨基-L-阿拉伯糖（4-amino-4-deoxy-L-arabinose, L-Ara4N），是PA的LPS修饰的常见形式[9−10]。而上述操纵子基因的表达可由双组分系统PmrA-PmrB调控[11]。有研究表明，PA的pmrB上的碱基发生突变，可导致PA对多黏菌素B产生抗性。如Abraham等[12]从临床上发现的一株耐多黏菌素B的PA，其pmrB第292位碱基发生（T→C）突变；Barrow 等[13]发现pmrB在739位的（G→A）突变也可引起PA对多黏菌素B的耐药。
本研究通过阶梯式诱导的方式，获得了一株对多黏菌素B耐药的PA菌株。全基因组测序结果显示其pmrB基因第514−516位发生了缺失突变。通过同源重组、转录组测序（RNA sequencing，RNA-seq）、反转录荧光定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR）以及抗菌活性检测发现该缺失突变可导致pmrA、pmrB及arnBCADTEF操纵子基因的转录水平升高，细菌对多黏菌素B的敏感性下降。因此，本研究发现了一个新的可引起PmrA-PmrB功能改变的缺失突变形式，从而拓展了人们对多黏菌素B耐药机制的认识。
1. 材 料
1.1 菌株和质粒
PA标准菌株ATCC27853购自ATCC菌株保藏中心，pEX18Tc质粒购自上海禾午生物科技有限公司，大肠埃希菌DH5α感受态细胞、含有pUC57-pmrB⊿514-516质粒的大肠埃希菌Top10菌株购自上海生工生物工程有限公司。
1.2 培养基
LB液体培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母粉、5 g/L NaCl。BHI（brain heart infusion）液体培养基：脑心浸粉17.5 g/L、葡萄糖2 g/L、胰蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、Na2HPO4 2.5 g/L。TYS10（tryptone yeast extract and sucrose 10）培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，10%的过滤（0.22 µm）蔗糖。固体培养基：加琼脂粉于上述液体培养基至15 g/L。除特殊提及外，菌株在37 ℃的LB或BHI液体培养基中220 r/min振荡培养，37 ℃的LB或BHI固体培养基中静置培养。
1.3 试剂和仪器
MH（Mueller Hinton）培养基、胰蛋白胨、酵母粉、琼脂粉等（英国Oxoid公司）；NaCl、MgSO4、Na2HPO4（上海BBI生命科学有限公司）；质粒小提试剂盒、细菌基因组DNA提取试剂盒、细菌总RNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；氨苄西林、四环素、RT Master Mix for qPCR Ⅱ试剂盒、SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒（美国MedChem Express公司）。引物的合成由上海生工生物工程有限公司完成。微量分光光度计（美国Biochrom SimpliNano公司），PCR扩增仪、实时荧光定量PCR仪、Gene Pulser Xcell™ 电穿孔仪（美国Bio-Rad公司）。
2. 方 法
2.1 多黏菌素B自发耐药PA（PA-PBsr）的筛选
将单菌落的PA ATCC27853接种在含有多黏菌素B （1 mg/mL）2 µL的LB液体培养基2 mL中培养过夜。按1∶100转移到含有多黏菌素B（1 mg/mL）4 µL的LB液体培养基2 mL中继续培养过夜。重复上述操作，逐级增加多黏菌素B的浓度，直至细菌无法生长。将在多黏菌素B最大浓度下能够生长的细菌涂布在LB平板上，挑取单菌落后接种至LB液体培养基3 mL中培养至A600 为 0.6~0.8。采用微量肉汤稀释法测定出多黏菌素B对纯化菌株的最低抑菌浓度（ MIC），对MIC发生变化的菌株进行全基因组测序。
2.2 全基因组测序
挑取对MIC发生变化的菌株的单菌落，加入到LB培养液5 mL中培养过夜，按照细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，取基因组DNA 1 µg（质量浓度≥10 ng/µL，A260/280=1.8~2.0）送至上海生工生物工程股份有限公司进行全基因组测序。使用Qubit 3.0对文库浓度进行初步定量，使用Agilent 2100检测文库片段的完整性。文库检测通过后，使用Illumina Hiseq 2000进行测序。测序得到的原始数据经过质控筛选、去除接头等后，利用SPAdes 3.12.0进行基因组组装，得到菌株PA-PBsr基因组序列。
2.3 PA的pmrB基因第514−516位缺失突变株（PA-pmrB⊿514-516）的构建
将含有pUC57-pmrB⊿514-516 质粒的大肠埃希菌TOP10单菌落接种于含有氨苄西林（50 µg/mL）的LB培养基5 mL中培养过夜；使用质粒小提试剂盒提取质粒。在冰上，将pUC57-pmrB⊿514-516 质粒5 µg与DH5α感受态细胞100 µL混合后孵育30 min，2.5 kV条件下于2 mm电转杯中电转, 添加LB培养基700 µL后转移至1.5 mL离心管培养1.5 h，
5000 r/min离心5 min，弃去部分上清液，留培养基100 µL重悬细菌并涂布于含氨苄西林（50 µg/mL）的LB平板继续培养；挑取单菌落接种至LB培养基3 mL培养过夜，提取质粒后使用引物pmrB-MUT-CXF1和pmrB-MUT-CXR1进行PCR验证。使用KpnⅠ和HindⅢ对pUC57-pmrB⊿514-516进行双酶切。酶切体系为：10×buffer（Cutsmart）10 µL，DNA模板4 µg，KpnⅠ（
20000 U/mL）2 µL，HindⅢ（20000 U/mL）2 µL，ddH2O补充至100 µL。使用KpnⅠ和HindⅢ对pEX18Tc质粒进行双酶切，酶切体系为：10 × buffer（Cutsmart）20 µL，DNA模板8 µg，KpnⅠ（20000 U/mL）4 µL，HindⅢ（20000 U/mL）4 µL，ddH2O补充至200 µL。37 ℃水浴酶切过夜进行胶回收。使用连接酶将回收后的目标片段和载体片段连接，酶连体系为：10 × T4 DNA 连接酶缓冲液 10 µL，T4 DNA 连接酶（40000 U/mL）2 µL，目标片段5 µg，载体片段5 µg，ddH2O补充至100 µL，16 ℃孵育过夜。将pEX18Tc-pmrB⊿514-516电转至（方法同上）DH5α感受态细胞100 µL，将菌液涂布于含四环素（20 µg/mL）的BHI平板继续培养。挑取单菌落培养后以pEX18-F和PA-pmrB-R引物进行PCR验证。将PCR阳性菌落接种至含有四环素（20 µg/mL）的LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜后提取质粒（pEX18Tc-pmrB⊿514-516）。取PA ATCC27853单菌落，接种至LB培养基5 mL中，42 ℃静置培养过夜，
12000 r/min离心1 min后，使用MgSO4（1 mmol/L）1 mL洗涤3次，室温下重悬于MgSO4（1 mmol/L）50 µL中。冰上将pEX18Tc- pmrB⊿514-516 质粒5 µg与上述感受态50 µL混合孵育30 min，2.2 kV条件下于2 mm电转杯中电转，添加BHI培养基700 µL后转移至1.5 mL离心管后培养3 h，6000 r/min离心3 min后弃部分上清液，留培养基100 µL重悬细菌并涂布于含四环素（100 µg/mL）的BHI平板中培养64 h。挑取单菌落接种至含有四环素（20 µg/mL）的LB培养基3 mL中培养过夜，提取基因组DNA，以pEX18-F和PA-pmrB-R为引物进行PCR反应；将PCR结果为阳性的菌液涂布至含有四环素（100 µg/mL）的BHI平板培养过夜，挑取单菌落接种至TYS10平板上23 ℃培养64 h，挑取单菌落至LB培养基5 mL中培养过夜后提取基因组DNA，以pmrB-MUT-CXF1和pmrB-MUT-CXR1为引物进行PCR验证。扩增产物送上海生工生物工程有限公司进行测序验证。本研究所用引物参见表1。Table 1. Primers used in this studyPrimer Sequence(5′→3′) Sources pmrB-MUT-CXF1 CGCCTGCTGGTCAACCT This study pmrB-MUT-CXR1 CAGCAGGAGGTTGAGTTCGT This study pEX18-F GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG This study PA-pmrB-R GCAGGAGGTTGAGTTCGTCG This study rpsL-QF GTGGTGAAGGTCACAACCTG [14] rpsL-QR CCTGCTTACGGTCTTTGACA [15] pmrA-QF CACCAGGTGACCCTGTCC [14] pmrA-QR CGTAGAGGCTCTGCTCCAGT [15] pmrB-QF CCTCTCGCTGAAGCAGGTGA [15] pmrB-QR CTGGTCTTCGGTGGCAAGGT [16] arnB-QF CGCGATCAAGAACCTGACCT This study arnB-QR GGTCGGCCAGGTTGTATTTG This study arnC-QF AGTTGCGGTTGAGGATCACC This study arnC-QR TCTACAACGAGGAAGCCAGC This study arnA-QF CATCGGCATCCATTCGGAGT This study arnA-QR CGTTTGCCGTATTTCACGCA This study arnD-QF GCGACCTTCTTCTTCAGCGT This study arnD-QR AGCAGGATGTCCCAGCCATA This study arnT-QF CCGCAATTCACCTTCTGGGTC [16] arnT-QR CGAGGAAGCCCTTGGTCAGG [16] arnE-QF TCTGCTGGCTGCTGCTCCTG [16] arnE-QR CATCGAAGACGAAGCGTGCC [16] arnF-QF GTGCTTTCCTCGACGGATGA This study arnF-QR CAGTACCAGCAAGACCCTGG This study 2.4 MIC的测定
使用Ca2+、Mg2+调节过的MH培养基将对数生长期（A600 = 0.6~0.8）的PA野生株、PA-PBsr及PA-pmrB⊿514-516稀释至A600 为 0.001，96孔板第1孔加入待测菌液200 µL，第2孔至第10孔每孔加入菌液100 µL；第1孔加入多黏菌素B（1 mg/mL）6.4 µL，混匀后吸取菌液100 µL至第2孔，以此类推进行倍比稀释直至最后一孔混匀后弃掉100 µL。MH培养基、不含药物的菌液及DMSO 100 µL分别作阴性、阳性和空白对照。37 ℃静置培养18 h后，在每孔加入噻唑蓝（5 mg/mL）10 µL，37 ℃静置培养30 min后测量595 nm波长下的吸收度。
2.5 时间杀菌曲线
分别挑取PA野生株和PA-pmrB⊿514-516单菌落至LB培养基3 mL，培养至A600 为0.5。加入多黏菌素B至野生株与突变株菌液，使终浓度为0、16、32 µg/mL，在96孔板中按每孔总体积200 µL，37 ℃条件下培养。以2 h的间隔测量600 nm波长下的吸收度，平行试验3次，数据取均值。
2.6 抑菌圈
分别用棉拭子蘸取麦氏浊度0.5的野生株PA和突变株PA-pmrB⊿514-516的菌液，均匀涂布在MH平板上。滴加多黏菌素B（0.1 mg/mL）3 µL至MH平板，以生理盐水为阴性对照，37 ℃条件下培养过夜。游标卡尺测量抑菌圈直径，平行试验3次，数据取均值。
2.7 RNA-seq
分别培养野生株PA和突变株PA-pmrB⊿514-516 3 mL至对数生长期（A600 = 0.6~0.8），使用细菌总RNA提取试剂盒提取总RNA，取总RNA （质量浓度>50 ng/µL，A260/280=1.8~2.0）1 µg。使用RT Master Mix for qPCR Ⅱ 试剂盒进行反转录，使用NEB Next® Ultra™ Directional RNA Library Prep Kit for Illumina®试剂盒对样本进行建库。文库构建完成并质检后，使用Illumina Novaseq
6000 进行转录组测序。采用DESeq2进行基因差异表达分析。差异基因筛选条件以差异倍数（Fold change，FC）和P值作为参考指标。|log2FC| > 0.5和P < 0.05作为差异基因判断标准。测序工作主要由上海伟寰生物科技有限公司完成。2.8 RT-qPCR
取对数生长期（A600 = 0.6~0.8）的PA野生株及PA-pmrB⊿514-516 3 mL，使用细菌总RNA提取试剂盒提取总RNA。取总RNA 2 µg，使用RT Master Mix for qPCR Ⅱ 试剂盒进行反转录后，使用SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒检测基因表达水平。以rpsL的表达作为内参对照，采用2−ΔΔCt法分析基因表达的相对变化。两组之间的比较采用非配对t检验。
2.9 数据处理及分析
采用GraphPad Prism 8.0.2对试验数据进行数据处理，P< 0.05作为显著性差异的标准。
3. 结 果
3.1 PA-PBsr的筛选及测序
通过阶梯式诱导的方式获得了一株对多黏菌素B耐药的PA菌株PA-PBsr（MIC=8 µg/mL），与野生型相比，其MIC增加到了原来的4倍。全基因组测序显示，与亲本株ATCC27853相比，PA-PBsr的pmrB基因第514−516位碱基发生了缺失突变，导致其编码蛋白同步发生了第172位亮氨酸缺失突变。
3.2 突变菌株的构建与验证
如图1所示，pmrB-MUT-CXF1和pmrB-MUT-CXR1扩增条带大小为657 bp，表明pUC57-pmrB⊿514-516成功电转至感受态细胞中；pEX18-F和PA-pmrB-R扩增条带大小为325 bp（图2），表明已成功将pmrB⊿514-516片段连接至pEX18Tc。引物pmrB-MUT-CXF1和pmrB-MUT-CXR1扩增产物测序结果见图3，测序结果表明pmrB的第514−516位碱基缺失突变株构建成功。
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Figure 1. pUC57-pmrB⊿514-516 positive bacteria were verified by PCRM: DL1200 DNA Maker; Lane 1: Negative control (empty plasmid); Lane 2: Blank control (without plasmid); Lane 3: Experimental hole![]()
Figure 2. pEX18Tc- pmrB⊿514-516 positive bacteria were verified by PCRM: DL1200 DNA Maker; Lane 1: Negative control (empty plasmid); Lane 2: Blank control (without plasmid); Lane 3: Experimental hole![]()
Figure 3. Deletion mutation site sequencing verification resultsA: Wild-type strain; B: Strain after homologous recombination3.3 多黏菌素B对突变株的MIC、杀菌曲线和抑菌圈的测定
多黏菌素B对野生株PA及突变株PA-pmrB⊿514-516的MIC分别是2和8 µg/mL，表明pmrB第514−516位点缺失突变与PA对多黏菌素B的耐药性改变有关。
时间杀菌曲线结果表明，如图4所示，多黏菌素B对野生株PA及PA-pmrB⊿514-516的最低杀菌浓度分别为16和32 µg/mL，表明PA-pmrB⊿514-516对多黏菌素B表现出更强的耐受性。
当多黏菌素B质量浓度为0.1 mg/mL时，野生株PA和突变株PA-pmrB⊿514-516形成的抑菌圈如图5所示。野生株PA的抑菌圈平均值为11.4 mm，突变株PA-pmrB⊿514-516的抑菌圈平均直径为6.1 mm，表明突变株对多黏菌素B敏感性降低。
3.4 差异表达基因分析
如图6所示，与野生株PA相比，突变株PA-pmrB⊿514-516总共有787个基因发生显著变化，其中有418个基因表达上调，369个基因表达下调。其中，与多黏菌素B耐药性相关的pmrA、pmrB及arnBCADTEF都发生了上调（表2）。
Table 2. Changes in the related gene expression regulated by pmrBSymbol log2 Fold change P Stat Product pmrA 5.9 0 up PmrA: two-component regulator system response regulator PmrA pmrB 6.1 1.1 × 10−260 up PmrB: two-component regulator system signal sensor kinase PmrB arnB 7.5 7.3 × 10−5 up ArnB arnC 6.9 4.0 × 10−212 up ArnC arnA 7.2 0 up ArnA arnD 8.1 8.9 × 10−8 up ArnD arnT 7.0 0 up inner membrane L-Ara4N transferase ArnT arnE 7.4 1.6 × 10−26 up ArnE arnF 7.4 6.5 × 10−7 up ArnF 3.5 RT-qPCR结果分析
如图7所示，与野生型相比，在PA-pmrB⊿514-516中，受PmrB调控的基因pmrA、pmrB及arnBCADTEF的表达量均显著升高。其中pmrA和pmrB基因表达分别升高8.6倍和 3.4倍，而arnBCADTEF操纵子各基因组分的表达量分别升高31.3、56.9、43.8、5.1、45.2、5.3和19.9倍。结果与转录组测序结果相一致。
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Figure 7. Histogram of RT-qPCR to validate of microarray results**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1 vs control group4. 讨 论
随着抗生素的广泛使用，对抗生素产生耐药性的PA越来越常见。全国细菌耐药监测网显示，2021年我国PA对碳青霉烯类抗生素的耐药率为17.7%[17]。多黏菌素B是治疗对碳青霉烯耐药PA的重要手段。细胞外膜脂质A成分的修饰可使PA对多黏菌素B产生耐受性，其常见形式是在脂质A成分中添加正电荷的L-Ara4N，从而降低多黏菌素B与LPS的亲和力，而该过程是由arnBCADTEF操纵子编码的蛋白质介导的，该操纵子则受双组分系统PmrA-PmrB调控。目前已有文献表明，PA对多黏菌素B产生抗性，与PA的pmrB上的碱基发生突变存在一定关系[12−13]。
本研究使用多黏菌素B对PA进行亚抑菌浓度诱导，获得了一株PA-PBsr，该菌株在pmrB基因发生了第514−516位的缺失突变。我们通过同源重组，构建PA-pmrB⊿514-516突变株后发现，该突变可介导PA对多黏菌素B产生抗性。另外，RNA-seq和RT-qPCR结果显示该突变可引起pmrA、pmrB和操纵子arnBCADTEF表达量升高，提示PmrA-PmrB功能表达增强。因此，本研究明确了一个可以引起PA对多黏菌素B产生耐药性的新的pmrB突变形式，对于进一步认识和了解PA对多黏菌素B的耐药机制提供了新的数据。鉴于该突变形式目前还未在临床耐药株中发现，因此，在今后使用多黏菌素B治疗PA感染时应注意由该突变引起的耐药，从而体现了本研究对于临床用药的指导意义。然而，PA的pmrB⊿514-516突变是如何导致双组分系统PmrA-PmrB功能增强，其具体作用机制还需要进一步研究。
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Figure 1. pUC57-pmrB⊿514-516 positive bacteria were verified by PCR
M: DL1200 DNA Maker; Lane 1: Negative control (empty plasmid); Lane 2: Blank control (without plasmid); Lane 3: Experimental hole
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Figure 2. pEX18Tc- pmrB⊿514-516 positive bacteria were verified by PCR
M: DL1200 DNA Maker; Lane 1: Negative control (empty plasmid); Lane 2: Blank control (without plasmid); Lane 3: Experimental hole
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Figure 3. Deletion mutation site sequencing verification results
A: Wild-type strain; B: Strain after homologous recombination
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Figure 7. Histogram of RT-qPCR to validate of microarray results
**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.000 1 vs control group
Table 1 Primers used in this study
Primer Sequence(5′→3′) Sources pmrB-MUT-CXF1 CGCCTGCTGGTCAACCT This study pmrB-MUT-CXR1 CAGCAGGAGGTTGAGTTCGT This study pEX18-F GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTG This study PA-pmrB-R GCAGGAGGTTGAGTTCGTCG This study rpsL-QF GTGGTGAAGGTCACAACCTG [14] rpsL-QR CCTGCTTACGGTCTTTGACA [15] pmrA-QF CACCAGGTGACCCTGTCC [14] pmrA-QR CGTAGAGGCTCTGCTCCAGT [15] pmrB-QF CCTCTCGCTGAAGCAGGTGA [15] pmrB-QR CTGGTCTTCGGTGGCAAGGT [16] arnB-QF CGCGATCAAGAACCTGACCT This study arnB-QR GGTCGGCCAGGTTGTATTTG This study arnC-QF AGTTGCGGTTGAGGATCACC This study arnC-QR TCTACAACGAGGAAGCCAGC This study arnA-QF CATCGGCATCCATTCGGAGT This study arnA-QR CGTTTGCCGTATTTCACGCA This study arnD-QF GCGACCTTCTTCTTCAGCGT This study arnD-QR AGCAGGATGTCCCAGCCATA This study arnT-QF CCGCAATTCACCTTCTGGGTC [16] arnT-QR CGAGGAAGCCCTTGGTCAGG [16] arnE-QF TCTGCTGGCTGCTGCTCCTG [16] arnE-QR CATCGAAGACGAAGCGTGCC [16] arnF-QF GTGCTTTCCTCGACGGATGA This study arnF-QR CAGTACCAGCAAGACCCTGG This study 
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Table 2 Changes in the related gene expression regulated by pmrB
Symbol log2 Fold change P Stat Product pmrA 5.9 0 up PmrA: two-component regulator system response regulator PmrA pmrB 6.1 1.1 × 10−260 up PmrB: two-component regulator system signal sensor kinase PmrB arnB 7.5 7.3 × 10−5 up ArnB arnC 6.9 4.0 × 10−212 up ArnC arnA 7.2 0 up ArnA arnD 8.1 8.9 × 10−8 up ArnD arnT 7.0 0 up inner membrane L-Ara4N transferase ArnT arnE 7.4 1.6 × 10−26 up ArnE arnF 7.4 6.5 × 10−7 up ArnF
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