Exploration and practice of mRNA technology in vaccine development
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摘要:
mRNA疫苗是将编码抗原的mRNA递送到人体细胞内，在细胞内翻译后产生相应的抗原蛋白，从而诱导机体产生有效的免疫反应。与传统疫苗相比，mRNA疫苗安全性好、研发周期短、免疫效力高，可以同时刺激细胞免疫反应和体液免疫反应。随着核苷酸修饰技术和递送技术的发展，mRNA疫苗也迎来了广阔的应用前景。本文对mRNA技术及其在疫苗领域的应用进行综述，以期为正在或即将开展mRNA疫苗研发工作的学者提供理论和实践指导。
Abstract:mRNA vaccine delivers antigen-encoding mRNA into human cells, which translates into corresponding antigen proteins in cells, and induce effective immune responses. Compared with traditional vaccines, mRNA vaccines have good safety profile, short development cycle, and high immune efficacy, and can stimulate both cellular immune response and humoral immune response. With the development of nucleotide modification technology and delivery technology, mRNA vaccines also have broad application prospects. This paper reviews mRNA technology and its application in vaccines, in the hope of offering theoretical and practical insights to researchers engaged or to be engaged in the development of mRNA vaccines.
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Keywords:
- vaccine /
- mRNA /
- modified nucleotide /
- nucleotide delivery /
- lipid nanoparticle
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疫苗是将病原微生物（如细菌、立克次氏体、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用转基因等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原微生物刺激机体免疫系统的特性。当机体首次接触到这种不具伤害力的病原后，免疫系统会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等，当机体再次接触到这种病原微生物时，免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原微生物的伤害。根据生产工艺不同，疫苗可分为灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗等。依靠安全有效的全部（灭活或减毒）或部分（亚单位）病毒作为免疫原来训练人体免疫系统，产生预防病毒感染的能力。然而，这些策略的发展往往很慢，难以跟上新出现病毒的步伐[1]。相比之下，基于mRNA技术的药物平台能够极大缩短药物开发时间，从而能够快速应对病原微生物的变异，提供更及时可靠的保护，参考已上市的新冠mRNA疫苗，候选mRNA疫苗能够达到临床试验并获得监管授权速度比传统疫苗更快[2−3]。传统的减毒活病毒疫苗或具有复制能力的病毒载体存在恢复致病形式的可能，而mRNA疫苗不会有这种风险。另外，mRNA疫苗在细胞质中编码目的蛋白，无需进入细胞核，因此也不像DNA疫苗具有整合到宿主基因组或由基因插入引起的突变风险[4−6]。mRNA疫苗的作用原理如图1所示。mRNA作为疫苗的另一项优势在于其自身的免疫原性，可以发挥免疫佐剂的作用。mRNA疫苗是通过体外转录技术生产的，以线性化质粒DNA为模板，以核苷三磷酸（NTP）作为合成原料，在T7，T3或Sp6噬菌体等RNA聚合酶存在的条件下进行体外转录，同时在转录过程中引入5′-帽子结构和3′-Poly（A）尾部结构，最终得到mRNA产品，这一过程无需依赖细胞扩增，因此可快速大量生产，但是一款能够在临床使用的安全且有效的mRNA产品，需要在免疫激活与目的抗原表达之间做好平衡。
mRNA疫苗是在全球新型冠状病毒感染(COVID-19)大流行推动下快速发展的核酸疫苗，其研发的基本思路是将确定的遗传信息（即mRNA）转移到患者（或受种者）的细胞中，使其顺利地翻译出指定的蛋白质，引发有效的体液和细胞免疫应答，以达到预防疾病或改变特定疾病状态的目的。本文对mRNA的分子结构、mRNA的免疫原性、mRNA的分类、核酸递送技术及mRNA技术在疫苗领域的应用进行总结，以期为正在或即将开展mRNA疫苗研发工作的学者提供理论和实践指导。
1. mRNA技术
1.1 mRNA的分子结构
mRNA作为基因转录表达的中间产物，其包含了靶蛋白的编码信息。传统的非复制性mRNA分子由5′-帽子结构（cap），5′-非翻译区（5′-UTR）、编码目的蛋白的开放阅读框（ORF）、3′-非翻译区（3′-UTR）和多聚腺苷酸[Poly(A)]尾巴等子结构构成（如图2所示）。除去ORF区域，其他结构单元都会影响到mRNA的稳定性和翻译效率。
1.1.1 5′-帽子结构
5′-帽子结构可以防止mRNA因外切酶降解，募集翻译起始因子（eukaryotic translation initiation factor 4E, eIF4E）促进核糖体识别和翻译起始，防止mRNA被固有免疫受体识别[7−8]。目前mRNA主要包含3种帽子结构，cap-0 (m7G(5′)pppN1pN2p)，cap-1 (m7G(5′)pppN1mpNp)或cap-2 (m7G(5′)pppN1mpN2mp)。在体外转录（in vitro transcription，IVT）反应过程中，5′-帽子结构的形成可以通过酶法和化学共转录两种方法获得。其中，酶法加帽应用较广泛的是基于痘苗病毒加帽酶(vaccinia virus capping enzyme, VCE)的两步加帽，该方法可以实现近乎100%的加帽效率，但需要高效的VCE表达和纯化[9]。而化学共转录则是采用加帽类似物的一步加帽策略，2018年开发的第3代共转录帽类似物CleanCap™利用初始加帽三聚体产生天然的未修改的加帽结构，实现90%~99%的加帽率。无帽或异常帽的mRNA可以被模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别[10]（如RIG-I和IFIT），从而触发Ⅰ型干扰素反应，阻断mRNA翻译[11]，IVT之后的mRNA可用磷酸酶处理，以去除无帽的磷酸盐，防止PRRs介导的mRNA翻译抑制。
1.1.2 非翻译区
mRNA的5′和3′非翻译区（untranslated region，UTR）包含特定的调节序列元件，通过与RNA结合蛋白相互作用调节mRNA的翻译和稳定性。5′-UTR序列可影响mRNA的稳定性和翻译的准确性，一般遵循以下几个原则：（1）避免出现起始密码子干扰编码区的正常翻译；（2）避免出现稳定的二级结构影响核糖体募集和密码子识别；（3）长度不宜过长[12]。3′-UTR序列也能影响mRNA的稳定性，常规使用的是非洲爪蟾或人类的β-珠蛋白[13]3′-UTR首尾串联起来进一步改善稳定效果，也可使用内部核糖体进入位点(IRESs)和真核延伸因子1α(EEF1A1)的3′-UTR[14−15]。
1.1.3 Poly(A)尾巴
Poly(A)序列可以减缓RNA外切酶的降解过程，增加RNA稳定性，也是翻译起始所必需的[16−17]，并且可以保护5′-帽子不被脱帽酶降解[18]，提高翻译效率。Poly(A)的长度至关重要，有报道显示，具有120个核苷酸的长poly(A)尾比64个核苷酸的poly(A)尾的蛋白表达水平更高；同样有研究表明，poly(A)尾并不是越长越好[19−20]，而大于120个核苷酸的poly(A)尾部并没有进一步提高蛋白的表达水平。Poly(A)尾可通过酶法加尾和质粒DNA模板转录获得。酶法加尾获得的poly(A)尾部的长度并不均一[21−22]。而通过质粒DNA模板转录得到的poly(A)尾长度均一性更佳。
1.1.4 开放阅读框
开放阅读框（open reading frame，ORF）是mRNA最关键的组成部分，包含翻译成蛋白质的编码序列。在不改变蛋白质序列的前提下，可从以下几个方面对ORF进行优化：（1）除某些特殊蛋白外，用tRNA丰度较高的密码子替换ORF中的稀有密码子，或将序列优化为目标细胞中天然高表达蛋白中常见的最佳密码子对，以提高翻译速率；（2）提高ORF中尿嘧啶（G）和胞嘧啶(C)含量，以增加mRNA的稳定性[23]；（3）降低尿苷（U）含量，该策略既能直接增加GC含量，又能减少因mRNA富含U，激活Toll样受体进而抑制蛋白表达[24]；（4）避免高稳定的二级结构和发夹环[16]。目前AI技术已被应用于mRNA的序列设计，序列优化工具、蛋白结构稳定工具和分子设计迭代工具等的人工智能化，是mRNA技术未来发展的大方向。
1.2 mRNA的免疫原性
外源性mRNA作为一种免疫刺激物，可以被细胞表面、内涵体以及胞质中的受体所识别，从而刺激机体的免疫反应。mRNA在细胞质内被核糖体翻译成蛋白质，并被蛋白酶体降解为抗原肽，通过主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）呈递给CD8+ T 细胞，激活细胞介导的免疫反应。此外，基于 mRNA翻译的蛋白质还可以分泌到细胞外环境中，从而进入循环系统被抗原呈递细胞（antigen‐presenting cell，APC）摄取。抗原肽作为外源性抗原被MHC Ⅱ类分子递呈给CD4+ T细胞，通过分泌细胞因子和诱导相应的抗原特异性B细胞活化、增殖分化为浆细胞产生特异性抗体，发挥体液免疫作用。mRNA的这种免疫激活效应是一把双刃剑：一方面，mRNA可以作为一种免疫佐剂来促进树突状细胞（DC）的成熟，诱导T细胞和B细胞免疫；而另一方面，这种mRNA相关的免疫活性可能会降低抗原的表达，从而降低抗原的免疫原性。为了平衡mRNA分子的免疫活性，研究者们也做了大量的努力。
1.2.1 核苷修饰
迄今为止，已有多种核苷酸化学修饰策略可在不影响mRNA翻译特性的前提下降低其免疫原性，常见的修饰核苷如图3所示。N1-甲基腺苷（m1A）或N6-甲基腺苷（m6A）被用来替换天然腺苷[25]。5-甲基尿苷(m5U)、2-硫尿苷(s2U)、5-甲氧基尿苷(5moU)、假尿苷(ψ)、N1-甲基假尿苷(m1ψ)和5-甲基胞苷(m5C)被用来替代天然尿苷和胞苷[8, 25−28]（图3）。修饰核苷酸主要是通过阻碍信号受体对mRNA的识别，避免下游信号通路的激活来逃避先天免疫反应。例如，m6A修饰可降低TLR3/7/8、PKR、MDA5、OAS和RIG-I与mRNA的结合，从而逃避先天免疫；ψ通过阻碍TLR7/8、PKR、OAS和RIG-I介导的信号通路的刺激来降低细胞内先天免疫原性；m5C通过阻止TLR7/8，PKR和RIG-I介导的信号通路刺激来降低细胞内先天免疫原性，并稳定mRNA的降解，从而延长半衰期。其中m5C和ψ修饰不仅可显著降低mRNA固有免疫原性，而且能够提高mRNA在体外和体内的翻译能力[25, 29−30]。值得强调的是，这些细胞受体不仅能感知某些修饰的存在与否，还能感知RNA链特征（单链或双链RNA）以及碱基修饰的位置和组合。两位背后“功臣”卡塔琳·考里科和德鲁·韦斯曼凭借mRNA的核苷碱基修饰技术，荣获2023年诺贝尔生理学或医学奖。最近有研究表明mRNA中引入修饰核苷可能会导致翻译编码滑移[31]，这个仍需进一步的研究。
1.2.2 降低dsRNA
IVT过程中会产生多种副产物，包括未加帽的mRNA、短RNA和dsRNA等[32−33]。其中dsRNA是最主要的副产物，可以激活细胞内的模式识别受体，导致mRNA翻译抑制和固有免疫的激活[33−35]。RIG-I和MDA5是细胞内识别病毒dsRNA的两个主要胞质传感器，一旦识别外源的病毒dsRNA，就会激活抗病毒信号途径，上调干扰素的表达（IFNs）。RIG-I和MDA5拥有不同的RNA特异性，据此来识别各种类型的病毒。RIG-I主要监控dsRNA 5′末端，特别是末端的三磷酸基团（5′PPP），与此形成对比的是，MDA5识别long dsRNA（0.5~1 kb），依赖的是双链长度。目前主要通过3个方面降低dsRNA：（1）通过优化IVT反应体系来降低dsRNA的生成，比如Mg2+离子浓度、反应温度等；（2）通过有效纯化方法（HPLC、柱色谱）步骤去除dsRNA副产物[32−33]；（3）使用修饰核苷减少dsRNA副产物的产生[34−35]。
1.3 mRNA的分类
mRNA分子根据其特征可以分为非复制mRNA、自复制RNA和环状RNA（图4）。
非复制mRNA是在体外转录好的一段编码抗原蛋白的完整mRNA，其结构包含5′-帽子结构、5′和3′非翻译区（UTR）、3′-polyA和ORF区域。5′UTR主要参与mRNA下游ORF序列的翻译，5′端含有7-甲基鸟苷帽状结构（5′-cap，m7G），阻止mRNA被外切酶降解；而3′UTR的功能是维持mRNA的稳定性；3′端含有poly (A)尾结构，这种结构可以保护mRNA不被降解，增强mRNA的稳定性，提高翻译效率。非复制mRNA结构简单、RNA序列短、不编码其他蛋白，目前已上市或正在进行临床试验的mRNA疫苗大部分是非复制型的。但是非复制型mRNA疫苗也存在一些缺点，比如在体内半衰期短，不适合蛋白替代等应用场景。
自复制RNA除包含非复制mRNA的结构外，还额外编码4个病毒非结构蛋白（nsP1-4）和一个亚基因组启动子（该启动子来自甲病毒的基因组）。nsP1-4编码一种复制酶，负责RNA在细胞内进行自我复制。自复制RNA进入细胞质后，与宿主细胞核糖体结合，产生RNA复制酶（RDRP）。RDRP的形成是一个复杂的、多阶段的过程，每个nsPs都具有多种功能，比如nsP2作为RNA解旋酶和蛋白酶进行多蛋白加工；nsP3介导多种病毒与宿主蛋白的相互作用；nsP4是RNA依赖的RNA聚合酶。RDRP复制酶首先以正义链RNA为模板合成互补的反义链RNA，再以反义链RNA作为模板合成复制多条正义链RNA，这一过程就导致了自复制RNA相对于非复制mRNA来说，具有更高且持续的抗原表达水平，也是自复制RNA疫苗只需要较低剂量的原因之一。有研究表明，自复制RNA可将抗原表达周期延长至半个月左右[36]。自复制RNA有诸多优势，同时也面临一些困难需要克服，过度的炎症反应、甲病毒复制子产生的非结构蛋白可能干扰宿主细胞正常的信号转导，以及更长的序列和复杂的结构提高了工艺开发难度。
环状RNA是一类单链闭合的环状RNA分子，制备方式可分为由mRNA前体通过可变剪接（alternative splicing）环化产生；以及酶促反应两种。由于环状RNA不包含5′-cap和3′-poly(A)，缺乏游离末端，因此不易被核酸外切酶降解，比线性RNA更稳定[37]，有利于储存和运输。环状RNA缺乏帽依赖性翻译的基本元件，通过在5′UTR 区域添加IRES元件来起始翻译，所以翻译效率较低；另外在工业应用上，环状RNA的一大制备挑战为纯化步骤，高纯度、大规模制备尤为困难。
1.4 核酸递送技术
外源mRNA需要跨过细胞的脂质双分子层并进入到细胞质中才能发挥其生物学功能，而mRNA分子是由负电性的磷酸二酯骨架构建的大分子化合物，容易受核酸酶影响而降解，因此，稳定有效的核酸递送系统直接决定了mRNA分子功能的发挥。
近年来，核酸递送广泛使用的技术包含脂质体、脂质纳米颗粒（LNP）、聚合物纳米颗粒、外泌体、腺病毒或者腺相关病毒载体等[1, 38−39]。基于脂质化合物及其衍生的脂质纳米复合物由于其良好的生物相容性、低免疫原性和高的药物装载效率等优点被广泛应用[40]。传统的LNP主要包含4种不同脂质成分：阳离子脂质化合物、辅助磷脂化合物、胆固醇和PEG脂质。其中阳离子或者可电离阳离子脂质化合物主要作用是结合mRNA，同时在内涵体逃逸过程中发挥了重要作用。辅助磷脂和胆固醇对于稳定LNP以及提高LNP与细胞膜融合过程中发挥重要作用，脂质PEG则主要是降低血浆清除、延长体内循环、增强稳定性[41−42]。目前已上市的两款mRNA疫苗使用的阳离子脂质分别为ALC-0315（BioNTech公司）和SM-102（Moderna公司），以及一款siRNA药物使用的阳离子脂质化合物为DLin-MC3-DMA（Alnylam公司）。目前已上市的两款mRNA疫苗mRNA1273（Moderna公司）和BNT162.2（BioNTech & Pfizer公司）都采用的LNP递送系统，其LNP的配方如表1所示。
表 1 已上市mRNA疫苗脂质纳米颗粒（LNP）配方
疫苗 阳离子脂质 甾醇 辅助磷脂 PEG脂质 n(阳离子脂质)∶n(甾醇)∶
n(辅助磷脂)∶n(PEG脂质)mRNA1273 SM-102 胆固醇 DSPC DME-PEG2000 50∶38.5∶10∶1.5 BNT162b2 ALC-0315 胆固醇 DSPC ALC-0159 46.3∶42.7∶9.4∶1.6 mRNA递送系统的优化对于mRNA药物实现更广阔的应用至关重要，随着mRNA药物的不断发展，基于mRNA的个性化治疗方案也在不断涌现，对递送载体的给药方式也提出新的挑战，这就要求具有更加精确的递送体系。基于递送方式的改进，mRNA疫苗可以实现局部递送，包括肌肉注射、雾化吸入、鼻腔给药、皮下注射、微针给药和瘤内注射等[43−45]。
传统疫苗的接种方式都是通过肌注的方式来实现免疫，而针对呼吸道相关疾病，通过雾化吸入或者干粉吸入进行免疫接种疫苗可以激活黏膜免疫，从而更好地应对呼吸道相关的疾病[46−48]，因此mRNA疫苗的吸入给药也成为未来发展的重点。目前包含TranslateBio（Sanofi）、Moderna、Arcturus、Recode、阿斯利康等公司都在积极开发mRNA的吸入给药载体，目前多项吸入mRNA疫苗进入临床研究。
通过系统性给药来实现mRNA的靶向递送也成为目前mRNA药物一个重要的发展方向。现有技术报道通过调节LNP中阳离子脂质化合物结构、LNP脂质配方等来调节LNP本身的理化性质，如粒径大小、电势电位等来影响LNP体内的生物学性质等来实现LNP体内的器官或者细胞的被动靶向[49−51]。BioNTech公司采用的LPX递送载体可以将肿瘤疫苗递送至DC细胞，从而可以获得更好的肿瘤免疫效果；也有研究通过在传统脂质纳米颗粒中引入一类选择性器官靶向（SORT）脂质化合物，可以实现LNP对肺部、脾或肝脏的靶向递送[52−53]，还可以通过在LNP表面引入一些具有靶向性的配体基团，通过受体-配体介导mRNA的体内细胞或者器官的靶向递送[54−58]，比如采用CD3或者CD5抗体来做体内的T细胞靶向，CD117抗体来实现LNP的造血干细胞靶向递送，还可以通过在LNP表面修饰N-乙酰半乳糖胺（GalNac）从而提高肝脏的递送效率。因此，未来基于LNP的体内靶向递送可以极大地扩大mRNA-LNP的在体治疗范围。
目前关于mRNA药物还有一个问题亟需解决，那就是存储和运输[59]。现有的mRNA疫苗需要在–20℃以下的温度保存，严重影响了mRNA疫苗的广泛使用，特别是对于一些发展中国家或者欠发达国家，由于缺乏冷链运输的条件而无法普惠到这些地区。目前一个比较好的解决办法是通过冷冻干燥的方式，将液体制剂转变为干粉制剂，从而可以提高药物在2~8 ℃或者常温下的稳定性，降低运输和存储的成本，提高mRNA药物的可及性[60−62]。
2. mRNA技术在疫苗领域的应用
理论上来说，mRNA可以表达任何需要的蛋白，很多难成药的蛋白或胞内蛋白均可由mRNA编码表达，且可分泌至胞外、靶向受体或循环系统，因此mRNA技术平台可用于疫苗（感染性疫苗和肿瘤疫苗）、蛋白替代疗法、细胞工程化和基因编辑等领域。目前，肿瘤免疫治疗和感染性疫苗的应用最多[37, 63]。
2.1 传染病疫苗
利用mRNA疫苗应对传染性疾病一般通过编码病原体特异的结构蛋白，从而用于预防病原感染。如Ⅱ型严重急性呼吸道冠状病毒SARS-CoV2、呼吸道合胞病毒（RSV）、带状疱疹病毒（VZV）、巨细胞病毒（CMV）、流感病毒（Flu）、艾滋病毒（HIV）、Zika病毒、登革病毒、猴痘病毒等[64]。
2019年暴发的新冠疫情给全球带来了极大的健康威胁，Moderna和BioNTech公司研发的基于mRNA的新冠疫苗在临床试验中有效率达到95%以上，先后被美国食品药品监督管理局（FDA）批准紧急使用，这两款疫苗也在全球范围内得到广泛接种。而在变异株流行时，基于mRNA技术能够快速响应，开发的二价mRNA疫苗也相继获得授权。截至目前，进入临床试验的新冠mRNA疫苗已经超过40种。
国际艾滋病疫苗行动组织（IAVI）赞助研发的基于eOD-GT8 60mer抗原的重组亚单位疫苗IAVI G001接种后产生大量的抗HIV IgG抗体，在此研究基础上，Moderna公司与其合作，开发了mRNA-1644和mRNA-1644-Core，并已启动Ⅰ期临床试验。Moderna公司的mRNA-1647疫苗（巨细胞病毒疫苗）、mRNA-1345疫苗（RSV呼吸道合胞病毒疫苗）和mRNA-1010（季节性流感四价疫苗）[65]正在进行Ⅲ期临床试验；而针对Zika病毒的mRNA-1893疫苗也进入了Ⅱ期临床招募阶段[64]。CureVac公司基于RNActive平台开发的狂犬病毒mRNA疫苗（CV7201）在Ⅰ期临床试验中可以诱导抗狂犬病毒的中和抗体。
2.2 肿瘤疫苗
通过mRNA来表达缺陷或改造的抑癌蛋白，调节肿瘤免疫微环境来实现癌症的免疫治疗也广受关注，目前更多的关注焦点是将mRNA作为治疗性疫苗来刺激训练免疫系统杀死癌细胞编码肿瘤相关抗原（TAA）和肿瘤特异性抗原（TSA），促进免疫系统对肿瘤细胞的识别和攻击，从而为mRNA产品提供新机遇。与蛋白疫苗不同，mRNA可以编码整个抗原蛋白，能够递呈多种表位，而无需受限于多肽疫苗中特定的HLA表位[66]。此外，使用多条mRNA链或在同一条mRNA链可同时表达多种抗原，诱发更广泛免疫反应，以应对能够产生多种新抗原的肿瘤类型。除了mRNA疫苗之外，编码细胞因子和免疫检查点抗体的mRNA药物也可以用于肿瘤免疫治疗。不同于预防性疫苗通过体液免疫实现保护性效果，治疗性肿瘤疫苗必须确保产生强效的CD8+ T细胞反应，以清除癌变细胞。此外，治疗性癌症疫苗须与其他免疫疗法（如免疫检查点抑制剂）联用，这将成为未来肿瘤治疗的一个新方向。
2.2.1 肿瘤相关抗原
肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen，TAA）选择性表达在肿瘤细胞表面，是免疫系统杀伤肿瘤细胞的靶标。靶向TAA的癌症疫苗涉及一系列固定的TAA，用以应对不同肿瘤。相较于传统疫苗，mRNA疫苗可以同时递送多种TAA抗原，增加免疫有效性，并且编码的全长肿瘤抗原可以使抗原呈递细胞同时激活人白细胞抗原Ⅰ类分子和Ⅱ类分子，激活更强的T细胞免疫。目前，已经有超过20种治疗肿瘤的mRNA疫苗进入临床试验。BioNTech的BNT111疫苗包含4种黑色素瘤相关抗原（NY-ESO-1、MAGE-A3、tyrosinase、TPTE）。早期临床试验免疫的部分结果显示75%的受试者至少表现出对一种TAA的特异性的T细胞反应。最初评价的42位患者的影像学结果显示：在仅接受该疗法的25位患者中，3例出现部分缓解，7例疾病稳定；而在疫苗-抗PD1联合治疗组的17位患者中，6例出现部分缓解[63，67]。BNT111目前正在进行黑色素瘤Ⅳ期临床试验。
Moderna公司研发的mRNA-5671（V941）包括4种最常见的KRAS突变体（G12D、G12V、G13D、G12C），目前正在处于Ⅰ期临床试验阶段，主要考察mRNA疫苗单用或与pembrolizumab联用效果[68−71]。此外，BioNTech还有多个抗肿瘤mRNA疫苗在研，其中包括BNT112（编码5种前列腺癌特异抗原）、BNT113（编码HPV16来源的肿瘤抗原E6和E7，即病毒的原癌蛋白）、BNT114（编码多种选定的乳腺癌抗原）及BNT115（编码3种卵巢癌抗原）。CureVac公司的mRNA疫苗CV9201和CV9202（编码6种人非小细胞肺癌相关抗原），在临床试验中表现出良好的治疗效果。此外，编码4种前列腺癌抗原的mRNA疫苗CV9103、CV9104延长了去势抵抗性前列腺癌患者的预期生存时间。除了实体瘤外，mRNA疫苗在急性髓细胞白血病的治疗中也展现了很好的效果。
2.2.2 个性化新抗原
肿瘤特异性抗原（TSA），也称为新抗原（neoantigen），是具有更强肿瘤特异性的抗原表位，因此也可作为靶点设计mRNA疫苗。细胞在癌变过程中会表达一些正常细胞中不存在的蛋白，这些蛋白被蛋白酶体处理成多肽后递呈到细胞表面结合MHCⅠ类受体，并被T细胞受体所识别。肿瘤细胞的新抗原具有很强的个体差异，即使同一患者的不同肿瘤细胞也存在差异，这为肿瘤特异和患者特异的免疫疗法带来机遇。利用二代测序和计算机算法预测、发现、鉴定特异新抗原，然后体外制备编码这些新抗原的mRNA并回输患者体内，以诱导免疫反应来治疗肿瘤。目前，该疗法在黑色素瘤、胶质母细胞瘤和其他一类实体瘤中都有良好的治疗效果。
BioNTech公司针对不同癌症已经开发了多款候选疫苗[72]，譬如治疗黑色素瘤的BNT111和BNT121、治疗前列腺癌的BNT112、治疗HPV16阳性头颈部鳞状细胞癌的BNT113、治疗非小细胞肺癌的BNT116以及针对多种癌症研发的BNT122。其中，BNT121在检查点抑制剂治疗的黑色素瘤患者中诱导了持续的缓解[67]。BNT122包含多达20种个性化新抗原，目前正处于治疗包括黑色素瘤、结直肠癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等多项疾病的临床试验中。初步临床试验结果显示，BNT122单用或与PD-L1抗体atezolizumab联用时，安全性处于可接受范围[63]。
Moderna公司针对晚期黑色素瘤的个性化癌症疫苗mRNA-4157包含34种新抗原，目前正处于Ⅱ期临床试验阶段，同时正在进行包括对切除后原发固体肿瘤的单一治疗及对转移性未切除肿瘤治疗的Ⅰ期临床试验研究。在针对人乳头瘤病毒（HPV）阴性头颈鳞癌的临床试验中，该疫苗与帕博利珠单抗（pembrolizumab）联用在保证药物安全性和耐受性的同时也提高了疾病的总缓解率和完全缓解率。同时，mRNA-4157还作为pembrolizumab的辅助药物用于治疗高风险黑色素瘤，正在进行Ⅱ期临床试验[63]。Moderna和Merck公司合作研发编码KRAS新抗原的mRNA-5671疫苗，该疫苗正在开展其单独或与Merck公司的帕博利珠单抗（anti-PD-1 抗体）联合用于胰腺癌治疗的临床试验研究。
3. 总 结
整体来看，虽然目前mRNA疫苗在感染性疾病和肿瘤的预防和治疗中都展现了良好的临床结果和应用前景，但mRNA行业仍处于由实验室研究向医药工业产业化发展的早期阶段，面临巨大挑战。随着mRNA分子结构设计和序列的优化、体外合成、递送技术和制剂工艺等技术的不断完善和优化，mRNA疫苗的发展将会为人类的健康产业发挥更大的作用。
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表 1 已上市mRNA疫苗脂质纳米颗粒（LNP）配方
疫苗 阳离子脂质 甾醇 辅助磷脂 PEG脂质 n(阳离子脂质)∶n(甾醇)∶
n(辅助磷脂)∶n(PEG脂质)mRNA1273 SM-102 胆固醇 DSPC DME-PEG2000 50∶38.5∶10∶1.5 BNT162b2 ALC-0315 胆固醇 DSPC ALC-0159 46.3∶42.7∶9.4∶1.6 
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