Design, synthesis and biological study of BTK/JAK3 dual-target inhibitors
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摘要:
以课题组前期发现的XL-12为先导化合物，通过末端苯环的结构修饰，进一步提高化合物的抗炎活性。设计并合成了12个目标化合物。所有目标化合物的结构经1H NMR、13C NMR和HRMS确证。体外活性测试结果显示大部分化合物对布鲁顿型酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine，BTK) 和Janus激酶3 (JAK3) 具有较好的酶抑制活性，化合物I-3对Daudi细胞和BaF3-JAK3细胞显示中等的细胞增殖抑制活性。在体外抗炎活性评价中，化合物I-3能有效抑制炎症因子IL-6的产生。此外，在小鼠二甲苯致耳廓肿胀模型中，化合物I-3显示出优于阳性药依鲁替尼（ibrutinib）的抗炎活性。
Abstract:In the present study, the compound XL-12 from our previous work was utilized as a lead compound. Through the optimization of the terminal phenyl ring, 12 target compounds were designed and synthesized. The structures of all target compounds were confirmed by 1H NMR, 13C NMR, and H RMS. In vitro enzyme activity assay showed that most compounds demonstrated significant inhibitory activity toward Bruton’s tyrosine kinase (BTK) and Janus kinase 3 (JAK3). Among them, compound I-3 exhibited moderate cell proliferation inhibitory activity toward Daudi cells and BaF3-JAK3 cells. In the evaluation of anti-inflammatory activity in vitro, compound I-3 could effectively inhibit the production of inflammatory factors IL-6; besides, it exhibited superior anti-inflammatory activity compared to ibrutinib in xylene-induced ear swelling model in mice.
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Keywords:
- rheumatoid arthritis /
- BTK inhibitor /
- JAK3 inhibitor /
- dual-target inhibitors /
- anti-inflammatory
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类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis, RA) 是一种以炎性滑膜炎为主的慢性、持久性自身免疫性疾病[1]。目前治疗RA的药物主要分为非甾体抗炎药[2]、糖皮质激素类[3]、改善病情类药物（DMARDs）（包括bDMARDs、csDMARDs、tsDMARDs）[4]。非甾体抗炎药和糖皮质激素类药物可以减缓疾病的进展，但在长期使用中会引起多种不良反应[5−6]；生物制剂类DMARDs（bDMARDs），如TNF-α抑制剂阿达目单抗（adalimumab）和IL-6抑制剂托珠单抗（tocilizumab），疗效和耐受性较好，但顺应性与小分子药物相比较差；传统合成类抗类风湿药物（csDMARDs），如甲氨蝶呤，是目前治疗RA的金标准，但由于起效缓慢、毒性较大，因此在使用中需要监测血药浓度。靶向合成类抗类风湿药物（tsDMARDs），比如托法替尼（tofacitinib）、巴瑞克替尼（baricitinib），这类药物疗效好、成本低，但大多数是非选择性JAK抑制剂，可能会存在一些安全性问题。
研究发现多种信号通路与RA的发生发展密切相关，包括磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信号通路、JAK-信号转导与转录激活因子（JAK-STAT）信号通路、BCR信号通路等[7]。抑制这些信号通路中关键的酶，比如JAK、PI3K、BTK等，可以阻断信号通路的传导，减少炎症因子的产生，从而达到治疗RA的目的[8]。
JAK激酶是细胞内非受体酪氨酸激酶，与细胞的增殖、存活与分化以及基因的表达等生物学功能有关[9−10]。研究表明多种与炎症性疾病有关的细胞因子大多是通过JAK-STAT信号通路进行传导的，JAK已经成为治疗自身免疫性疾病的热门药物靶点。此外，选择性 JAK3 抑制剂可能规避由于抑制JAK2而带来的副作用，具有更好的安全性。目前已有10个JAK抑制剂先后被批准上市，结构式见图1。
BTK是非受体酪氨酸激酶TEC家族的一员[11]，仅在B细胞和髓样细胞中表达，主要通过参与BCR信号通路调节B细胞的增殖、分化和凋亡[12−13]。BTK抑制剂主要用于治疗B细胞淋巴瘤和各种恶性血液病，同时，也是治疗自身免疫性疾病中一个十分有吸引力的靶点。目前多款BTK抑制剂被批准上市，如图2所示。
有文献报道，使用BTK和JAK1的药物组合物ABBV-59[14]或 SYK/JAK双靶点抑制剂PRT-2070[15]，可以有效解决RA治疗过程中，药物疗效较低、安全性差以及适应性耐药等问题。因此，通过组合疗法或多靶点小分子抑制剂治疗RA是目前该领域研究的热点。课题组前期研究得到了对BTK和JAK3都具有较强抑制活性的化合物XL-12[16]，本研究在化合物XL-12（如图3所示）的基础上，进一步研究其构效关系，设计并合成了 12 个目标化合物。
1. 合成路线
1.1 中间体5a~5l的合成
化合物1[16]与不同的羧酸2a~2l经酸胺缩合反应制得中间体3a~3l。随后和中间体4[16]在1,1'-二(二苯膦基)二茂铁二氯化钯(Ⅱ)催化下，经Suzuki偶联反应制得中间体5a~5l（图4）。
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Figure 4. Synthetic routes of compounds 5a–5lReagents and conditions: (i) COCl2, TEA, dichloromethane, 0 ℃– r.t., 2 h;(ii) Pd(dppf)Cl2, Na2CO3 (2 mol/L), dioxane-H2O (4:1), N2, 80 ℃, 3 h1.2 目标化合物І-1和І-2的合成
中间体5a和5b在10%Pd/C和氢气作用下进行还原反应得到中间体6a和6b。6a和6b在饱和氯化氢/乙酸乙酯溶液中脱除叔丁氧羰基（Boc）后得到中间体7a和7b，随后在冰浴条件下与丙烯酰氯反应得到目标化合物І-1和І-2（图5）。
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Figure 5. Synthetic routes of compounds І-1−І-2Reagents and conditions: (iii) H2, 10% Pd/C, methanol-acetic acid(2:1), r.t., 20 h; (iv) HCl/EA, 20 °C, 1 h; (v) acryloyl chloride, TEA, anhydrous dichloromethane/DMF, 0 ℃ then r.t., 3 h1.3 目标化合物І-3~І-12的合成
化合物5c~5l在饱和氯化氢/乙酸乙酯溶液中脱除Boc后得到中间体6c~6l，随后在冰浴条件下与丙烯酰氯经酰化反应得到目标化合物І-3~І-12（图6）。
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Figure 6. Synthetic routes of compounds І-3−І-12Reagents and conditions:(vi) HCl/ethyl acetate, 20 °C, 1 h; （vii) acryloyl chloride, TEA, anhydrous dichloromethane/DMF, 0 ℃ then r.t., 3 h2. 实验部分
2.1 材 料
Micros Q-TOF型高分辨分析仪器（美国Waters公司）；Bruker AV-300 型核磁共振仪，Avance NEO 400 MHz核磁共振仪（美国Bruker公司）；RY-1型熔点仪（天津市分析仪器厂）；200~300目硅胶（山西诺泰生物科技有限公司）；HSG F254型号TLC硅胶板（山东青岛海洋化工有限公司）；常用试剂均为市售分析纯试剂。JAK3、BTK蛋白（北京华新康信生物科技有限公司）；BaF3-JAK3 细胞（中科普瑞昇生物医药科技有限公司）；Daudi细胞（上海青旗生物技术发展公司）；胎牛血清（北京沃卡威生物技术）； 小鼠 IL-6 ELISA 试剂盒 （上海优宁维生物科技股份有限公司）；RAW264.7细胞（中国科学院上海细胞库）；ICR小鼠（南京市江宁区青龙山动物繁殖中心）。
2.2 化学合成
2.2.1 中间体 3a~3l 的合成
甲基(4-N-((7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)氨基甲酰基)苯基)氨基甲酸苄酯 (3a) 将化合物 2a (1.31 g, 4.59 mmol) 和无水二氯甲烷 (20 mL) 混合，冰浴下滴加草酰氯 (1.16 g, 9.19 mmol)，加入三滴DMF，转为室温反应30 min，TLC (石油醚-乙酸乙酯，2∶1) 监测原料反应完全。减压蒸除溶剂，残留物用无水二氯甲烷 (15 mL) 溶解，待用。于50 mL三颈瓶中，加入化合物 1 (1.00 g, 3.80 mmol)、二氯甲烷（15 mL）和三乙胺 (113 μL, 8.2 mmol)，冰浴搅拌下，滴入预先制备的酰氯溶液，加毕，室温反应2 h，TLC (石油醚-乙酸乙酯，3∶1) 监测原料反应完全。有机相分别用水 (10 mL × 3)、饱和氯化钠水溶液 (10 mL × 3) 洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤，滤液减压浓缩。粗品经柱色谱纯化 (石油醚-乙酸乙酯，10∶1~3∶1)，得黄色固体 1.09 g，收率 49.4 %。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 9.67 (1H, s), 8.42~8.38 (2H, m), 7.95 (1H, s), 7.93 (1H, s), 7.52 (1H, s), 7.50 (1H, s), 7.38-7.32 (5H, m), 6.03 (2H, s), 1.27 (12H, s)。
4-硝基-N-(7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)苯甲酰胺 (3b) 以化合物2b (0.76 g, 4.55 mmol)和化合物 1 (1.00 g, 3.80 mmol) 为原料，操作过程同中间体 3a 的合成，得黄色固体 1.39 g，收率 88.7 %，产物不经进一步纯化，直接投下一步反应。MS (ESI+70 V) m/z: 413.1[M+H]+。
4-(吡咯烷-1-基)-N-(7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)苯甲酰胺 (3c) 以化合物2c (0.61 g, 3.19 mmol)和化合物 1 (0.76 g, 2.89 mmol) 为原料，操作过程同中间体 3a 的合成，得白色固体 1.03 g，收率 81.7 %。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 9.68 (s, 1H), 7.83 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.02 (2H, s), 6.56 (2H, d, J = 8.9 Hz), 6.03 (2H, s), 3.31~3.26 (4H, m), 1.98~1.94 (4H, m), 1.27 (12H, s)。
4-(哌啶-1-基)-N-(7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)苯甲酰胺 (3d) 以化合物2d (0.69 g, 3.37 mmol)和化合物 1 (0.80 g, 3.04 mmol) 为原料，操作过程同中间体 3a 的合成，得褐色固体 1.18 g，收率 86.2 %，产物不经进一步纯化，直接投下一步反应。MS (ESI+70 V) m/z: 451.2[M+H]+。
4-吗啉基-N-(7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)苯甲酰胺 (3e) 以化合物 2e (0.75 g, 3.62 mmol)和化合物 1 (0.80 g, 3.04 mmol) 为原料，操作过程同中间体 3a 的合成，得浅褐色固体 1.37 g，收率 99.7 %，产物不经进一步纯化，直接投下一步反应。MS (ESI+70 V) m/z: 453.2[M+H]+。
4-(吡咯烷-1-基甲基)-N-(7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼杂环戊烷-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)苯甲酰胺 (3f) 以化合物 2f (0.75 g, 3.67 mmol)和化合物 1 (0.80 g, 3.04 mmol) 为原料，操作过程同中间体 3a 的合成，得白色固体 0.83 g，收率 60.6 %，产物不经进一步纯化，直接投下一步反应。MS (ESI+70 V) m/z: 453.2[M+H]+。
5-氟-N-(7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)吡啶-2-甲酰胺 (3g) 以化合物2g (0.64 g, 4.54 mmol)和化合物 1 (1.00 g, 3.80 mmol) 为原料，操作过程同中间体 3a 的合成，得白色固体 1.04 g，收率 70.9 %，产物不经进一步纯化，直接投下一步反应。MS (ESI+70 V) m/z: 387.1[M+H]+。
6-甲氧基-N-(7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)吡啶-3-甲酰胺 (3h) 以化合物2h (0.52 g, 3.40 mmol)和化合物1(0.80 g, 3.04 mmol) 为原料，操作过程同中间体 3a的合成，得 0.78 g 白色固体，收率 64.4 %，产物不经进一步纯化，直接投下一步反应。MS (ESI+70 V) m/z: 399.2[M+H]+。
N-(7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)异喹啉-1-甲酰胺 (3i) 以化合物2i (0.55 g, 3.18 mmol)和化合物 1 (0.70 g, 2.66 mmol) 为原料，操作过程同中间体 3a 的合成，得褐色固体 0.92 g，收率 82.7 %，产物不经进一步纯化，直接投下一步反应。MS (ESI+70 V) m/z: 419.2[M+H]+。
4-氯-N-(7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-3-(三氟甲基)苯甲酰胺 (3j) 化合物2j (0.80 g, 3.56 mmol)和化合物 1 (0.80 g, 3.04 mmol) 为原料，操作过程同中间体 3a 的合成，得白色固体 1.32 g，收率 92.5 %。产物不经进一步纯化，直接投下一步反应。MS (ESI+70 V) m/z: 470.1[M+H]+。
N-(7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-2,4-双(三氟甲基)苯甲酰胺 (3k) 以化合物2k (0.94 g, 3.64 mmol)和化合物 1 (0.80 g, 3.04 mmol) 为原料，操作过程同中间体 3a 的合成，得白色固体 1.26 g，收率 82.4 %，产物不经进一步纯化，直接投下一步反应。 MS (ESI+70 V) m/z: 504.1[M+H]+。
4-氟-N-(7-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼戊环-2-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-2-(三氟甲基)苯甲酰胺 (3l) 以化合物2l (0.96 g, 4.60 mmol)和化合物 1 (1.00 g, 3.80 mmol) 为原料，操作过程同中间体 3a 的合成，得白色固体 0.98 g，收率 56.9 %，产物不经进一步纯化，直接投下一步反应。 MS (ESI+70 V) m/z: 439.1[M+H]+。
2.2.2 中间体5a~5l的合成
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(4-(((苄氧基)羰基)(甲基)氨基)苯甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (5a) 向 50 mL 三颈瓶中加入化合物 3a (1.00 g, 1.89 mmol)、化合物 4 (0.76 g, 1.71 mmol) 、1,4-二氧六环 (15 mL)、 2 mol/L Na2CO3 (1.9 mL)和 Pd(dppf)Cl2 (73 mg, 0.10 mmol)，氮气保护，于75 ℃反应3 h，TLC (二氯甲烷-甲醇，15∶1) 监测反应完全。经硅藻土抽滤，滤液减压蒸除溶剂，用二氯甲烷 (30 mL) 溶解，再分别用水 (10 mL × 3)、饱和氯化钠水溶液 (10 mL × 3) 洗涤，无水硫酸钠干燥。抽滤，滤液减压浓缩，经柱色谱纯化 (二氯甲烷-甲醇，200∶1~50∶1) 得淡黄色固体 0.92 g，收率 74.6 %。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 10.30 (1H, s), 8.24 (1H, s), 8.01 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.51 (2H, d, J = 8.5 Hz), 7.46~7.27 (5H, m), 7.19 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.03 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.15 (2H, s), 5.19~5.10 (2H, m),4.73~4.65 (1H, m), 4.19~3.64 (3H, m), 3.33 (3H, s), 3.12~2.86 (1H, m), 2.31~1.86 (3H, m), 1.69~1.53 (1H, m), 1.34 (9H, s)。
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(4-硝基苯甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (5b) 以化合物 3b (0.90 g, 2.18 mmol)和化合物 4 (0.80 g, 1.80 mmol) 为原料，操作过程同中间体 5a 的合成，得白色固体 0.37 g，收率 34.1 %。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 10.52 (1H, s), 8.21 (1H, s), 8.12 (2H, d, J = 8.2 Hz), 8.04 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.19 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.02 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.13 (2H, s), 4.72~4.60 (1H, m), 4.10~3.94 (1H, m), 3.89~3.76 (1H, m), 3.18~3.14 (1H, m), 3.09~2.91 (1H, m), 2.24~2.15 (1H, m), 2.13~2.02 (1H, m), 2.02~1.81(1H, m), 1.62~1.51 (1H, m), 1.32 (9H, s)。
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(4-(吡咯烷-1-基)苯甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (5c) 以化合物 3c (1.12 g, 2.57 mmol)和化合物 4 (1.03 g, 2.32 mmol) 为原料，操作过程同中间体 5a 的合成，得白色固体 0.42 g，收率 28.9 %。 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 9.73 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.87 (d, J = 8.78 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 6.59 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.12 (s, 2H), 4.70~4.65 (m, 1H), 4.17~4.02 (m, 1H), 3.87~3.78 (m, 1H), 3.57~3.43 (m, 1H), 3.35~3.29 (m, 4H), 3.00~2.92 (m, 1H), 2.69~2.54 (m, 1H), 2.23~2.15 (m, 1H), 2.12~2.07 (m, 1H), 2.00~1.95 (m, 4H), 1.60~1.54 (m, 1H), 1.34 (s, 9H)。
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(4-(哌啶-1-基)苯甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (5d) 以化合物 3d (0.90 g, 2.00 mmol)和化合物 4 (0.80 g, 1.80 mmol) 为原料，操作过程同中间体 5a 的合成，得白色固体 0.37 g，收率 32.1 %。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 9.85 (1H, s), 8.24 (1H, s), 7.87 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.19 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.00 (3H, d, J = 8.6 Hz), 6.14 (2H, s), 4.74~4.64 (1H, m), 4.08~3.99 (1H, m), 3.93~3.78 (1H, m), 3.35~3.29 (4H, m), 3.06~2.92 (1H, m), 3.00~2.92 (1H, m), 2.69~2.52 (1H, m), 2.27~2.15 (1H, m), 2.13~2.07 (1H, m), 1.61~1.57 (7H, m),1.37 (9H, s)。
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(4-吗啉苯甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (5e) 以化合物 3e (1.27 g, 2.81 mmol)和化合物 4 (1.00 g, 2.26 mmol) 为原料，操作过程同中间体 5a 的合成，得褐色固体 0.37 g，收率 25.5 %。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 9.91 (1H, s), 8.23 (1H, s), 7.90 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.18 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.01 (3H, m), 6.13 (2H, s),4.71~4.61 (1H, m), 4.19~4.01 (1H, m), 3.98~3.87 (1H, m), 3.76~3.72 (4H, m), 3.38~3.37 (1H, m), 3.27~3.23 (4H, m), 3.05~2.92 (1H, m), 2.24~2.16 (1H, m), 2.11~2.04 (1H, m), 1.97~1.87 (1H, m), 1.59~1.51 (1H, m), 1.28 (9H, s)。
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(4-(吡咯烷-1-基甲基)苯甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (5f) 以化合物 3f (0.80 g, 1.78 mmol)和化合物 4 (0.80 g, 1.80 mmol) 为原料，操作过程同中间体 5a 的合成，得淡黄色固体 0.84 g，收率 72.8 %。 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 10.22 (1H, s), 8.24 (1H, s), 7.96 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.48 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.19 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.04 (1H, d, J =8.5 Hz), 6.15 (2H, s), 4.76~4.61 (1H, s), 4.22~4.01 (1H, m), 3.99~3.85 (1H, m), 3.72 (2H, s), 3.52~3.25 (4H, m), 3.09~2.91 (1H, m), 2.31~2.14 (1H, m), 2.14~2.03 (1H, m), 2.02~1.83 (1H, m), 1.81~1.69 (4H, m), 1.66~1.51 (2H, m), 1.29 (9H, s)。
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(5-氟吡啶-2-甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (5g) 以化合物 3g (0.83 g, 2.15 mmol)和化合物 4 (0.89 g, 2.00 mmol) 为原料，操作过程同中间体 5a 的合成，得淡黄色固体 0.38 g，收率 33.0 %。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 10.37 (1H, s), 8.67 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.27 (1H, dd, J = 8.5, 1.3 Hz), 8.19 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.14 (1H, dd, J = 8.3, 1.4Hz), 7.96~7.90 (2H, m), 7.81~7.76 (1H, m), 7.72 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.18 (2H, s), 4.70~4.61 (1H, m), 4.03~3.94 (1H, m), 3.90~3.72 (1H, m), 3.56~3.57 (1H, m), 3.04~2.90 (1H, m), 2.22~2.12 (1H, m), 2.10~2.02 (1H, m), 1.94~1.83 (1H, m), 1.61~1.51 (1H, m), 1.33 (9H, s)。
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(6-甲氧基吡啶-3-甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (5h) 以化合物 3h (0.80 g, 2.01 mmol)和化合物 4 (0.87 g, 1.96 mmol) 为原料，操作过程同中间体 5a 的合成，得褐色固体 1.06 g，收率 91.9 %。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 10.16 (1H, s), 8.77 (1H, s), 8.27 (1H, dd, J = 8.7, 4.6 Hz), 8.22 (1H, s), 8.04~7.98 (1H, m), 7.71 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.06 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.20 (2H, s), 4.73~4.60 (1H, m), 4.20~3.95 (1H, m), 3.90~3.70 (1H, m), 3.09~2.82 (2H, m), 2.29~2.12 (1H, m), 2.11~2.01 (1H, m), 1.99~1.84 (1H, m), 1.60~1.50 (1H, m), 1.34 (9H, s)。
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(异喹啉-2-甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (5i) 以化合物 3i (0.74 g, 1.76 mmol)和化合物 4 (0.74 g, 1.67 mmol) 为原料，操作过程同中间体 5a 的合成，得褐色固体 0.95 g，收率 93.5 %。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 10.28 (1H, s), 8.81 (1H, s), 8.28~8.22 (2H, m), 7.19 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.03 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.96 (1H, d, J = 8.7 Hz), 6.15 (2H, s), 4.72~4.61 (1H, m), 4.22~4.08 (1H, m), 3.94 (3H, s), 3.84~3.72 (1H, m), 3.59~3.45 (1H, m), 3.07~2.90 (1H, m), 2.28~2.16 (1H, m), 2.12~2.02 (1H, m), 1.99~1.87 (1H, m), 1.60~1.50 (1H, m), 1.34 (9H, s)。
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(4-氯-3-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (5j) 以化合物 3j (1.10 g, 2.34 mmol)和化合物 4 (0.99 g, 2.23 mmol) 为原料，操作过程同中间体 5a 的合成，得淡黄色固体 1.16 g，收率 75.1 %。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 10.62 (1H, s), 8.42 (1H, s), 8.27 (1H, dd, J = 8.4, 2.2 Hz), 8.22 (1H, s), 7.93 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.21 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.05 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.16 (2H, s), 4.73~4.62 (1H, m), 4.05~3.97 (1H, m), 3.93~3.75 (1H, m), 3.57~3.56 (1H, m), 3.06~2.91 (1H, m), 2.24~2.15 (1H, m), 2.12~2.02 (1H, m), 1.96~1.85 (1H, m), 1.62~1.50 (1H, m), 1.34 (9H, s)。
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(2,4-双(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (5k) 以化合物 3k (1.17 g, 2.33 mmol)和化合物 4 (0.98 g, 2.21 mmol) 为原料，操作过程同中间体 5a 的合成，得淡黄色固体 1.24 g，收率 80.9 %。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 10.71 (1H, s), 8.23 (1H, s), 8.20 (2H, s), 7.94 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.48 (1H, d, J = 8.7 Hz), 7.05 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.16 (2H, s), 4.72~4.62 (1H, m), 4.20~4.00 (1H, m), 3.94~3.75 (1H, m), 3.57~3.56 (1H, m), 2.77~2.69 (1H, m), 2.23~2.17 (1H, m), 2.12~2.03 (1H, m), 1.98~1.85 (1H, m), 1.61~1.51 (1H, m), 1.33 (9H, s)。
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(4-氟-2-(三氟甲基)苯甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (5l) 以化合物 3l (0.78 g, 1.73 mmol)和化合物 4 (0.73 g, 1.64 mmol) 为原料，操作过程同中间体 5a 的合成，得褐色固体 0.92 g，收率 82.6%。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 10.16 (1H, s), 8.77 (1H, s), 8.29~8.26 (1H, m), 8.22 (1H, s), 8.04~8.00 (1H, m), 7.71 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.06 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.20 (2H, s), 4.73~4.60 (1H, m), 4.20~3.95 (1H, m), 3.90~3.70 (1H, m), 3.09~2.82 (2H, m), 2.29~2.12 (1H, m), 2.11~2.01 (1H, m), 1.99~1.84 (1H, m), 1.60~1.50 (1H, m), 1.34 (9H, s)。
2.2.3 中间体6a和6b的合成
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(4-(甲氨基)苯甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (6a) 将化合物 5a (0.90 g, 1.25 mmol)、甲醇 (8 mL） 和乙酸 (4 mL) 混合，加入10 % Pd/C (0.09 g)，通入氢气于室温反应 20 h，TLC (二氯甲烷-甲醇，15∶1) 监测反应完全。抽滤，滤液减压蒸除溶剂，粗品经柱色谱纯化 (二氯甲烷-甲醇，150∶1~50∶1)得黑褐色固体 0.64 g，收率 87.3 %。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ: 9.81 (1H, s), 8.23 (1H, s), 8.09 (1H, s), 7.88 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.18 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.01 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.76 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.13 (2H, s), 4.78~4.58 (1H, m), 4.29~4.18 (1H, m), 3.97~3.68 (1H, m), 3.04~2.95 (4H, m), 2.29~2.16 (1H, m), 2.13~2.06 (1H, m), 1.94~1.80 (1H, m), 1.60~1.50 (1H, m), 1.48~1.43 (1H, m), 1.29 (9H, s)。
(R)-3-(4-氨基-3-(7-(4-氨基苯甲酰胺基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯 (6b) 以化合物 5b (0.35 g, 0.58 mmol) 和10 % Pd/C为原料，操作过程同6a的合成，得褐色固体0.32g，收率 96.4 %。MS (ESI+70 V) m/z: 573.3[M+H]+。
2.2.4 中间体7a、7b、6c~6l的合成
(R)-N-(7-(4-氨基-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)- 4-(甲氨基)苯甲酰胺 (7a) 化合物 6a (0.64 g, 1.09 mmol)和无水二氯甲烷(10 mL)混合，冰浴搅拌下加入约 2 mL饱和氯化氢/乙酸乙酯溶液，有大量固体析出，加毕，撤去冰浴。室温搅拌反应2 h，TLC (二氯甲烷-甲醇，20∶1) 监测反应完全，抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤，真空干燥，得淡黄色固体 0.52 g，收率 98.1 %。MS (ESI+70 V) m/z: 487.2[M+H]+。
(R)-4-氨基-N-(7-(4-氨基-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)苯甲酰胺 (7b) 以化合物 6b (0.30 g, 0.52 mmol)，操作过程同化合物 7a 的合成，得褐色固体 0.22 g，收率 91.3 %。不经进一步纯化，直接投下一步。MS (ESI+70 V) m/z: 473.2[M+H]+。
(R)-N-(7-(4-氨基-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)- 4-(吡咯烷-1-基)苯甲酰胺 (6c) 以化合物 5c (0.38 g, 0.61 mmol) 为原料，操作过程同化合物 7a 的合成，得白色固体 0.27 g，收率 84.0 %。不经进一步纯化，直接投下一步。MS (ESI+70 V) m/z: 527.3[M+H]+。
(R)-N-(7-(4-氨基-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)- 4-(哌啶-1-基)苯甲酰胺(6d) 以化合物 5d (0.38 g, 0.60 mmol) 为原料，操作过程同化合物 7a 的合成，得白色固体 0.27 g，收率 82.1 %。不经进一步纯化，直接投下一步。MS (ESI+70 V) m/z: 541.3[M+H]+。
(R)-N-(7-(4-氨基-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-吗啉基苯甲酰胺 (6e) 以化合物 5e (0.37 g, 0.58 mmol) 为原料，操作过程同化合物 7a 的合成，得白色固体 0.26 g，收率 82.6 %。不经进一步纯化，直接投下一步。MS (ESI+70 V) m/z: 543.3[M+H]+。
(R)-N-(7-(4-氨基-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)- 4-(吡咯烷-1-基甲基)苯甲酰胺 (6f) 以化合物 5f (0.84 g, 1.31 mmol) 为原料，操作过程同化合物 7a 的合成，得淡黄色固体 0.68 g，收率 96.0 %。不经进一步纯化，直接投下一步。MS (ESI+70 V) m/z: 541.3[M+H]+。
(R)-N-(7-(4-氨基-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-氟吡啶-2-甲酰胺 (6g) 以化合物 5g (1.22 g, 2.12 mmol) 为原料，操作过程同化合物 7a 的合成，得黄色固体 0.97 g，收率 96.1 %。不经进一步纯化，直接投下一步。MS (ESI+70 V) m/z: 477.2[M+H]+。
(R)-N-(7-(4-氨基-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)- 6-甲氧基吡啶-3-甲酰胺 (6h) 以化合物 5 h (0.94 g, 1.60 mmol) 为原料，操作过程同化合物 7a 的合成，得褐色固体 0.66 g，收率 84.4 %。不经进一步纯化，直接投下一步。MS (ESI+70 V) m/z: 489.2[M+H]+。
(R)-N-(7-(4-氨基-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-异喹啉-1-甲酰胺 (6i) 以化合物 5i (0.38 g, 0.62 mmol) 为原料，操作过程同化合物 7a 的合成，得白色固体 0.31 g，收率 98.3 %。不经进一步纯化，直接投下一步。MS (ESI+70 V) m/z: 509.2[M+H]+。
(R)-N-(7-(4-氨基-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)- 4-氯-3-(三氟甲基)苯甲酰胺 (6j) 以化合物 5j (1.11 g, 1.68 mmol) 为原料，操作过程同化合物 7a 的合成，得淡黄色固体 0.86 g，收率 91.4 %。不经进一步纯化，直接投下一步。MS (ESI+70 V) m/z: 561.1[M+H]+。
(R)-N-(7-(4-氨基-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-2,4-双(三氟甲基)苯甲酰胺 (6k) 以化合物 5k (1.10 g, 1.59 mmol) 为原料，操作过程同化合物 7a 的合成，得白色固体 0.93 g，收率 98.6 %。不经进一步纯化，直接投下一步。MS (ESI+70 V) m/z: 594.2[M+H]+。
(R)-N-(7-(4-氨基-1-(哌啶-3-基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-氟-2-(三氟甲基)苯甲酰胺 (6l) 以化合物 5l (1.11 g, 1.72 mmol) 为原料，操作过程同化合物 7a 的合成，得淡黄色固体 0.86 g，收率 92.0 %。不经进一步纯化，直接投下一步。MS (ESI+70 V) m/z: 544.2[M+H]+。
2.2.5 目标化合物I-1~I-12的合成
(R)-N-(7-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-(甲氨基)苯甲酰胺 (I-1) 将化合物 7a (0.51 g, 1.05 mmol) 加入无水二氯甲烷 (3 mL) 中，加 Et3N (0.22 g, 2.17 mmol)，室温搅拌 1 h，冰浴条件下缓慢滴加丙烯酰氯 (0.086 g, 0.95 mmol) 的无水二氯甲烷 (1 mL) 溶液，滴加完毕，室温搅拌约 3 h。TLC (二氯甲烷-甲醇，15 ∶1) 监测反应完全。向反应液中加入二氯甲烷 (7 mL) 稀释，再分别用水 (10 mL × 3) 和饱和氯化钠水溶液 (10 mL × 3) 洗涤，有机层减压浓缩得粗品。粗品经柱色谱纯化 (二氯甲烷-甲醇，100∶1~50∶1) 得白色固体 0.07 g，收率 12.3 %。mp 158.5~160.4 ℃。纯度: 96.86 %。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.68 (s, 1H), 8.23 (1H, s), 7.80 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.19 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.00 (1H, d, J = 8.4 Hz), 6.91~6.76 (1H, m), 6.58 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.38~6.33 (1H, m), 6.17~6.05 (3H, m), 5.73~5.57 (1H, m), 4.75~4.64 (1H, m), 4.59~4.49 (1H, m), 4.27~4.17 (1H, m), 4.13~3.96 (1H, m), 3.24~3.16 (1H, m), 2.77~2.71 (3H, d, J = 5.0Hz), 2.29~2.21 (1H, m), 2.15~2.08 (1H, m), 1.96~1.88 (1H, m), 1.63~1.53 (1H, m)。 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ∶165.25, 165.03, 158.55, 156.16, 154.13, 153.21, 146.13, 141.07, 139.02, 129.97 (2C), 128.85, 127.87， 122.79, 122.43, 120.51, 119.35, 111.44, 111.23, 110.90 (2C),101.95, 99.09, 53.40 (0.5C), 52.61 (0.5C), 49.72 (0.5C), 46.18 (0.5C),45.61 (0.5C), 42.05 (0.5C), 30.09 (0.5C), 29.88 (0.5C), 29.77, 25.41 (0.5C), 23.88 (0.5C)。 HRMS (ESI) m/z[M+H]+: Calcd for C28H29N8O4: 541.2312; Found: 541.2309。
(R)-N-(7-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-氨基苯甲酰胺 (І-2) 以化合物 7b (0.24 g, 0.51 mmol)和丙烯酰氯 (0.04 g, 0.44 mmol)为原料，操作过程同化合物 І-1 的合成，得白色固体 0.04 g，收率 14.9 %。mp 171.8~173.8 ℃。纯度: 96.56 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.65 (1H, s), 8.23 (1H, s), 7.72 (2H, d, J = 8.3 Hz), 7.19 (1H, d, J = 8.5 Hz), 7.00 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.90~6.72 (1H, m), 6.60 (2H, d, J = 8.4 Hz), 6.16~6.04 (3H, m), 5.77 (2H, br), 5.73~5.57 (1H, m), 4.74~4.64 (1H, m), 4.57~4.50 (1H, m),4.27~4.19 (1H, m), 4.10~3.91 (1H, m), 3.24~3.14(1H, m), 2.31~2.22 (1H, m), 2.16~2.08 (1H, m), 1.97~1.87 (1H, m), 1.65~1.54 (1H, m)。 HRMS (ESI) m/z[M+H]+: Calcd for C27H27N8O4: 527.2155; Found:527.2147。
(R)-N-(7-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-(吡咯烷-1-基)苯甲酰胺 (I-3) 以化合物 6c (0.25 g, 0.47 mmol)和丙烯酰氯 (0.04 g, 0.44 mmol)为原料，操作过程同化合物 І-1 的合成，得白色固体 0.06 g，收率 22.0 %。mp 158.1~160.5 ℃。纯度: 97.98 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:9.76 (1H, s), 8.19 (1H, s), 7.81 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.11 (1H, d, J = 7.9 Hz), 6.98 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.83~6.60 (1H, m), 6.56 (2H, d, J = 8.5 Hz), 6.13~5.97 (3H, m), 5.73~5.55 (1H, m), 4.76~4.61 (1H, m), 4.50~4.44 (1H, m), 4.15~4.06 (1H, m), 4.04~3.87 (1H, m), 3.30~3.22 (4H, m), 3.12~3.03 (1H, m), 2.26~2.17 (1H, m,), 2.12~2.05 (1H, m), 1.96~1.89 (5H, m), 1.60~1.49 (1H, m)。 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ: 164.75, 164.55, 158.05, 155.68, 153.66, 149.88,145.66, 140.64, 138.54, 129.46 (2C), 128.37, 127.48, 122.30, 121.96, 119.54, 118.93, 110.99,110.61 (2C), 101.47, 98.62, 52.92 (0.5C), 52.14 (0.5C), 49.25 (0.5C), 47.24 (2C), 45.70 (0.5C),45.14 (0.5C), 41.57 (0.5C), 29.62 (0.5C), 29.41 (0.5C), 24.97 (2C), 24.75 (0.5C), 23.40 (0.5C)。 HRMS (ESI) m/z[M+H]+: Calcd for C31H33N8O4: 581.2625; Found: 581.2626。
(R)-N-(7-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-(哌啶-1-基)苯甲酰胺 (I-4) 以化合物 6d (0.35 g, 0.65 mmol)和丙烯酰氯 (0.05 g, 0.55 mmol)为原料，操作过程同化合物I-1的合成，得白色固体 0.05 g，收率 12.9 %。mp 157.2~158.8 ℃。纯度: 95.27 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.20 (1H, s), 7.81 (2H, d, J = 8.6 Hz), 7.12 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.98 (1H, d, J = 8.9 Hz), 6.94 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.84~6.59 (1H, m), 6.14~6.07 (3H, m), 5.74~5.57 (1H, m), 4.75~4.64 (1H, m), 4.52~4.47 (1H, m), 4.15~4.08 (1H, m), 4.05~3.92(1H, m), 3.28 (4H, s), 3.23~3.14 (1H, m), 2.26~2.18 (1H, m), 2.13~2.07 (1H, m), 1.96~1.85 (1H, m), 1.45 (7H, m)。 HRMS (ESI) m/z[M+H]+: Calcd for C32H35N8O4: 595.2781. Found: 595.2774。
(R)-N-(7-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-吗啉基苯甲酰胺 (I-5) 以化合物 6e (0.25 g, 0.46 mmol)和丙烯酰氯 (0.04 g, 0.44 mmol)为原料，操作过程同化合物 І-1的合成，得白色固体 0.06 g，收率 21.9 %。mp 156.4~158.2 ℃。纯度: 97.79 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.90 (1H, s), 8.23 (1H, s), 7.90 (2H, d, J= 6.8 Hz), 7.20 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.04~7.00 (3H, m), 6.85~6.73 (1H, m), 6.17~6.04 (3H, m), 5.72~5.58 (1H, m), 4.75~4.64 (1H, m), 4.59~4.46 (1H, m), 4.29~4.18 (1H, m), 4.11~4.00 (1H, m), 3.77~3.72 (4H, m), 3.28~3.23 (4H, m), 3.22~3.15 (1H, m), 2.32~2.20 (1H, m), 2.14~2.08 (1H, m), 1.96~1.88 (1H, m), 1.65~1.52 (1H, m)。 HRMS (ESI) m/z[M+H]+:Calcd for C31H33N8O5: 597.2574; Found: 597.2562。
(R)-N-(7-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-(吡咯烷-1-基甲基)苯甲酰胺 (I-6) 以化合物 6f (0.50 g, 0.93 mmol)和丙烯酰氯 (0.08 g, 0.88 mmol)为原料，操作过程同化合物 I-1的合成，得白色固体 0.04 g，收率 7.2 %。mp 175.1~177.6 ℃。纯度: 96.26 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.24 (1H, s), 8.24 (1H, s), 7.97 (2H, d, J = 8.0 Hz), 7.49 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.20 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.04 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.87 (1H, dd, J = 15.2, 9.1 Hz), 6.84~6.69 (1H, m), 6.18~6.02(4H, m), 5.75~5.58 (1H, m), 4.82~4.65 (1H, m), 4.62~4.49 (1H, m), 4.30~4.17 (1H, m), 4.13~3.99 (1H, m), 3.72 (2H, s), 3.45~3.29 (4H, m), 3.26~3.14(1H, m), 3.03~2.91(1H, m), 2.36~2.20 (1H, m), 2.19~2.00 (1H, m), 1.97~1.87(1H, m), 1.74 (4H, m), 1.61 (1H, m)。 HRMS (ESI) m/z[M+H]+: Calcd for C32H35N8O5: 595.2781; Found: 595.2780。
(R)-N-(7-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-5-氟吡啶-2-甲酰胺 (I-7) 以化合物 6g (0.81 g, 1.70 mmol)和丙烯酰氯 (0.14 g, 1.54 mmol) 为原料，操作过程同化合物 I-1 的合成，得白色固体 0.25 g，收率 27.7 %。mp 167.2~169.4 ℃。纯度: 98.36 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.15 (1H, s), 8.75 (1H, s), 8.26 (1H, m), 8.22 (1H, s), 8.02 (1H, td, J = 8.7, 2.8 Hz), 7.73 (1H, d, J = 8.6 Hz),7.07 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.90~6.71 (1H, m), 6.20 (2H, s), 6.16~6.03 (1H, m), 5.73~5.58 (1H, m), 4.77~4.63 (1H, m), 4.60~4.52 (1H, m), 4.28~4.17 (1H, m), 4.11~4.05 (1H, m), 3.26~3.15 (1H, m), 2.32~2.20 (1H, m), 2.16~2.07 (1H, m), 1.96~1.89 (1H, m), 1.66~1.53 (1H, m)。 HRMS (ESI) m/z[M+H]+: Calcd for C26H24FN8O4: 531.1905; Found: 531.1909。
(R)-N-(7-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-6-甲氧基吡啶-3-甲酰胺 (I-8) 以化合物 6h (0.60 g, 1.23 mmol)和丙烯酰氯 (0.10 g, 1.10 mmol) 为原料，操作过程同化合物 I-1 的合成，得白色固体 0.12 g，收率 18.0 %。mp 156.3~158.4 ℃。纯度: 96.38 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ:10.27 (1H, s), 8.81 (1H, s), 8.28~8.21 (2H, m), 7.20 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.04 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.96 (1H, d, J = 8.7 Hz), 6.83~6.72 (1H, m), 6.15 (2H, s), 6.12~6.04 (1H, m), 5.74~5.57 (1H, m), 4.75~4.64 (1H, m), 4.59~4.51 (1H, m), 4.29~4.18 (1H, m), 4.12~4.04 (1H, m), 3.94 (3H, s), 3.25~3.15 (1H, m), 2.30~2.20 (1H, m), 2.15~2.08 (1H, m), 1.96~1.88 (1H, m), 1.64~1.52 (1H, m)。 HRMS (ESI) m/z[M+H]+: Calcd for C27H27N8O5: 543.2104; Found: 543.2098。
(R)-N-(7-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)异喹啉-1-甲酰胺 (I-9) 以化合物 6i (0.28 g, 0.55 mmol)和丙烯酰氯 (0.045 g, 0.50 mmol) 为原料，操作过程同化合物 I-1 的合成，得白色固体 0.14 g 白色固体，收率 45.2 %。mp 195.7~197.6 ℃。纯度: 97.92 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.42 (1H, s), 8.69 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.31 (1H, d, J = 8.5 Hz), 8.25 (1H, s), 8.22 (1H, d, J = 8.3 Hz), 8.16 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.94 (1H, t, J = 7.7 Hz), 7.85 (1H, d, J = 8.7 Hz), 7.79 (1H, t, J = 7.0 Hz), 7.11 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.91~6.72 (1H, m), 6.27 (2H, s), 6.20~6.05 (1H, m), 5.77~5.58 (1H, m), 4.78~4.65 (1H, m), 4.62~4.54 (1H, m), 4.31~4.19 (1H, m), 4.13~4.06 (1H, m), 3.34~3.16 (1H, m), 2.36~2.21 (1H, m), 2.17~2.08 (1H, m), 2.02~1.90 (1H, m), 1.66~1.53 (1H, m)。 HRMS (ESI) m/z[M+H]+: Calcd for C30H27N8O4: 563.2155; Found: 563.2149。
(R)-N-(7-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-氯-3-(三氟甲基)苯甲酰胺 (I-10) 以化合物 6j (0.86 g, 1.54 mmol)和丙烯酰氯 (0.13 g, 1.44 mmol)为原料，操作过程同化合物 I-1的合成，得白色固体 0.22 g，收率 24.9 %。mp 164.6~166.4 ℃。纯度: 98.83 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.62 (1H, s), 8.43 (1H, s), 8.28 (1H, dd, J = 8.4, 2.2 Hz), 8.24 (1H, s), 7.94 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.23 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.07 (1H, d, J = 8.5 Hz), 6.90~6.71 (1H, m), 6.17 (2H, s), 6.15~6.04 (1H, m), 5.75~5.66 (1H, m), 4.79~4.61 (1H, m), 4.61~4.53 (1H, m), 4.29~4.17 (1H, m), 4.12~4.01 (1H, m), 3.25~3.16 (1H, m), 2.32~2.22 (1H, m), 2.16~2.09 (1H, m), 1.96~1.89 (1H, m), 1.64~1.53 (1H, m)。 HRMS (ESI) m/z[M+H]+: Calcd for C28H24ClF3N7O4: 614.1530; Found:614.1526。
(R)-N-(7-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-2,4-双(三氟甲基)苯甲酰胺 (I-11) 以化合物 6k (0.93 g, 1.57 mmol)和丙烯酰氯 (0.14 g, 1.55 mmol)为原料，操作过程同化合物 I-1 的合成，得白色固体的 0.31 g 白色固体，收率 30.5 %。mp 160.2~162.2 ℃。纯度: 97.38 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.71 (1H, s), 8.24~8.18 (3H, m), 7.94 (1H, d, J = 7.9 Hz), 7.48 (1H, d, J = 8.6 Hz), 7.05 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.76~6.84 (1H, m), 6.17 (2H, s), 6.12~6.05 (1H, m), 5.74~5.58 (1H, m), 4.75~4.65 (1H, m), 4.59~4.53 (1H, m), 4.29~4.17 (1H, m), 4.12~4.04 (1H, m), 3.24~3.14 (1H, m), 2.32~2.21 (1H, m), 2.16~2.08 (1H, m), 1.98~1.89 (1H, m), 1.65~1.53 (1H, m)。 HRMS (ESI) m/z[M+H]+: Calcd for C29H24F6N7O4: 648.1794; Found: 648.1789。
(R)-N-(7-(1-(1-丙烯酰基哌啶-3-基)-4-氨基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-基)苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-4-基)-4-氟-2-(三氟甲基)苯甲酰胺 (I-12) 以化合物6l (0.60 g, 1.10 mmol)和丙烯酰氯 (0.10 g, 1.10 mmol) 为原料，操作过程同化合物 I-1的合成，得白色固体 0.16 g 白色固体，收率 24.3 %。mp 161.9~163.8 ℃。纯度: 98.30 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.55 (1H, s), 8.23 (1H, s), 7.79~7.74(2H, m), 7.68~7.63 (1H, m), 7.41 (1H, d, J = 8.7 Hz), 7.03 (1H, d, J = 8.6 Hz), 6.92~6.70 (1H, m), 6.17 (2H, s), 6.13~6.02 (1H, m), 5.76~5.59 (1H, m), 4.78~4.64 (1H, m), 4.62~4.52 (1H, m), 4.31~4.18 (1H, m), 4.15~4.07 (1H, m), 3.26~3.16 (1H, m), 2.34~2.20 (1H, m), 2.18~2.06 (1H, m), 2.00~1.88 (1H, m), 1.68~1.51 (1H, m)。 HRMS (ESI) m/z[M+H]+: Calcd for C28H24F4N7O4: 598.1286; Found: 598.1287。
2.3 酶抑制活性测试
BTK 和JAK3 酶抑制活性测试分别以星形孢菌素(staurosporine)和依鲁替尼(ibrutinib)为阳性对照。取激酶溶液10 μL加至384 孔检测板；1000 r/min，离心 30 s，振荡混匀后室温孵育 10 min。在激酶基础缓冲液中添加 FAM 标记的短肽、ATP、MgCl2，并配制成 2.5 倍终浓度的短肽溶液，取 10 μL 加至 384 孔测定板各孔。恒温 28 ℃ 下 JAK3 孵育 30 min，BTK 孵育 20 min。加入终止检测液25 μL停止激酶反应。用 Caliper EZ Reader 读取转化率，采用分析软件 GraphPad Prism 5 拟合量效曲线，从而得出各个化合物的IC50。
2.4 细胞增殖抑制活性测试
BaF3-JAK3细胞和Daudi细胞增殖抑制活性测试分别以托法替尼（tofacitinib）和紫杉醇为阳性对照。
通法如下：将细胞重悬，使用自动细胞计数器计数；根据播种密度每孔2×103个细胞，将细胞悬浮液稀释至所需密度；每个 96 孔铺 95 μL 细胞悬液，37 ℃培养。将化合物配成终浓度 1000 倍的母液；用培养基稀释化合物，配成终浓度 20 倍的化合物溶液，每孔加5 μL ，以加入同样体积的 DMSO 的孔作为阴性对照，培养 72 h。将96 孔细胞板平衡到室温；每孔加Cell Titer-Glo®试剂 40 μL ，振摇 2 min，静置 10 min；用 MD SpectraMax Paradigm 酶标仪检测化学发光信号，计算IC50。
2.5 体外抗炎活性评价
2.5.1 ELISA法检测细胞培养液中促炎因子IL-6的含量
取处于对数生长期的第3~5代RAW264.7细胞，制成单细胞悬液，用血球计数板进行计数。使24孔板中每孔培养基2 mL，细胞数为2.5×104个。种板后培养过夜（8~12 h），细胞完全贴壁。次日施药，设置空白对照组、模型组与给药组，每组设置3个复孔。给药组的化合物І-3终浓度为1, 2, 4, 8 μmol/L，模型组与给药各组均加入LPS共孵育24 h，LPS终浓度为1 μg/mL。取细胞培养液，4 000 r/min离心15 min，取上层清液，ELISA法检测化合物І-3对LPS诱导的RAW264.7细胞产生IL-6含量表达的影响。
2.5.2 qPCR法检测RAW264.7细胞IL-6 的mRNA表达水平
取处于对数生长期的第3~5代RAW264.7细胞，制成单细胞悬液，种于6孔板中，通过血球计数板计数控制每孔细胞数为2×105个。培养至细胞密度达到50%~60%时施药。设置空白对照组、模型组与给药组。给药组的化合物I-3终浓度为1, 2, 4, 8 μmol/L，孵育24 h后，模型组与给药组加入LPS（1 μg/mL）刺激细胞6 h，提取各组细胞RNA，检测化合物I-3对LPS诱导的RAW264.7细胞产生IL-6的mRNA表达水平的影响
2.6 体内抗炎活性测试
2.6.1 材料实验药品
依鲁替尼和化合物 I-3。ICR雄性小鼠：18 g~22 g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖中心提供，合格证号：SCXK (浙) 2019-0002。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。
2.6.2 方法
ICR雄性小鼠，体重18~22 g，在中国药科大学药学动物实验中心适应性饲养3 d，自由食水。按照随机数字法分组，模型组和各受试药组每组各8只。阳性药依鲁替尼给药剂量10 mg/kg，化合物I-3给药剂量分别为5、10和20 mg/kg。化合物用10%DMSO溶解，加入30%PEG涡旋至澄清，最后加入60%生理盐水，所有药物均现配现用，腹腔注射给药。给药30 min后在小鼠右耳前后两面均匀涂抹二甲苯25 μL，30 min后处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用打孔器分别在两耳同一位置打孔，称重。肿胀率（%）=（右耳重量 − 左耳重量）/左耳重量 × 100；肿胀抑制率（%）=（模型组肿胀率 − 受试组肿胀率）/模型组肿胀率 × 100。
3. 生物活性实验结果与讨论
为了研究目标化合物对BTK和JAK3的抑制活性，本研究测试了化合物I-1~I-12的酶抑制活性。实验结果见表1。
Table 1. Enzyme inhibition of І-1- І-12 against BTK and JAK3Compd. IC50/(nmol/L) Compd. IC50/(nmol/L) BTK JAK3 BTK JAK3 І-1 0.3 22.5 І-9 2.2 22.2 І-2 <0.1 99.2 І-10 （98.3%） （66.5%） І-3 1.6 16.2 І-11 （96.9%） （17.1%） І-4 0.2 25.8 І-12 （94.8%） （17.9%） І-5 1.5 69.6 XL-12 2.0 14.0 І-6 25.9 1131 Staurosporine NT 0.12 І-7 （93.8%） （50.6%） Ibrutinib 0.29 NT І-8 （99.0%） （42.0%） NT : no test; Figures in brackets are inhibition rate at 100 nmol/L 根据前期研究中[16]总结的构效关系以及该类分子在BTK和JAK3中的相互作用模式，末端苯环的改造有利于活性的提高。因此，为了进一步探索苯环上不同取代基对活性的影响，将XL-12结构中N,N-二甲氨基结构去单甲基化以及去双甲基化，设计并合成了化合物I-1~I-2。结果发现，去一个甲基化的化合物I-1保留了两个靶点的抑制活性，而氨基取代的化合物I-2对JAK3的抑制活性大幅下降。本研究模拟XL-12中的N,N-二甲氨基结构，将其替换为吡咯-1-基、哌啶-1-基、吗啉-1-基和吡咯-1-甲基，设计合成了化合物 I-3~I-6，其中吡咯取代的化合物 I-3 对 BTK和 JAK3 的抑制活性均稍有提高（BTK IC50 = 1.6 nmol/L；JAK3 IC50 = 16.2 nmol/L）；哌啶取代的化合物 I-4 基本保留了 JAK3 的抑制活性（IC50 = 25.8 nmol/L），但对 BTK 的抑制活性（IC50= 0.2 nmol/L）进一步提高；吗啉取代的化合物 I-5 保留了对 BTK 抑制活性（IC50 = 1.5 nmol/L），但对 JAK3 的抑制活性（IC50 = 69.6 nmol/L）下降。化合物I-6 对JAK3的抑制活性基本丧失，可能是由于苯环末端取代基的体积过大，导致化合物不能很好地与 JAK3 蛋白结合。
本研究探索了不同芳香环对化合物活性的影响，将苯环替换为吡啶环和异喹啉环，设计并合成了化合物I-7~I-9。酶抑制活性筛选显示，当用5-氟-吡啶-2-基 （I-7）和 6-甲氧基吡啶-3-基（I-8）取代时，化合物对 JAK3 的抑制活性均有不同程度的下降。而用异喹啉-1-基取代的化合物（I-9）则显示出较好的 JAK3 抑制活性。本研究进一步探索了当苯环进行双取代时对化合物活性的影响，设计并合成了化合物I-10~I-12。酶抑制活性筛选结果显示，苯环上存在两个取代基时，能够保持对 BTK 的抑制活性，但是却显著降低了对 JAK3 的抑制活性。
根据酶抑制活性测定结果显示，选择了对两个靶点抑制活性均较好的化合物I-1和I-3，测试了它们对Daudi细胞和BaF3-JAK3细胞的增殖抑制活性，实验结果如图所示。化合物I-3对Daudi细胞和BaF3-JAK3细胞都显示出了中等的增殖抑制活性（表2）。
Table 2. Effect of compound І-1 and І-3 against Daudi and BaF3-JAK3 cellCompd. IC50/（μmol/L） Daudi BaF3-JAK3 І-1 3.91 2.65 І-3 1.43 0.93 XL-12 0.69 0.37 Paclitaxel 0.0057 NT Tofacitinib NT 0.65 NT: no test 根据细胞水平的活性测定结果，本研究选取了化合物I-3，分别采用ELISA法和qPCR法检测了I-3对LPS刺激后的RAW264.7细胞释放的促炎因子IL-6的浓度以及mRNA表达水平的影响，实验结果（图7）显示，与空白对照组相比，LPS（1 μg/mL）刺激RAW264.7细胞24 h后，培养液中IL-6 的浓度以及mRNA表达水平极显著高于空白对照组（P<0.01），表明了细胞受到刺激后出现明显的炎症反应；与单独孵育LPS的模型组相比，I-3对LPS刺激的RAW264.7细胞释放炎症因子IL-6表现出显著的抑制作用，并能有效抑制IL-6的mRNA的表达，呈现一定的剂量依赖性。
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Figure 7. Compound І-3 inhibited the productions and mRNA levels of cytokines IL-6 in RAW264.7 cell treated with LPS（$\overline{x}$±s，n=3）A: Intracellular concentrations of IL-6; B: mRNA transcription levels of IL-6##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model group根据酶活性和细胞活性数据测定结果，本研究选择化合物I-3进行初步抗炎活性评价。用小鼠耳廓肿胀率及肿胀抑制率为指标对药物进行评价，实验结果见表3。
Table 3. Effect of compound І-3 on mouse ear swellingGroup Dose/(mg/kg) Swelling rate /% Swelling inibition rate/% Model - 145.98 - Ibrutinib 10 98.19 32.74 І-3 5 107.18 26.58 І-3 10 77.16* 47.15 І-3 20 72.51* 50.33 *P<0.05 vs model group 结果显示，化合物I-3对二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀表现出一定的抑制活性。与模型组相比，化合物I-3表现出明显的抗炎活性。中剂量（10 mg/kg）和高剂量（20 mg/kg）的肿胀率与模型组相比有显著性差异，且抗炎活性优于阳性药依鲁替尼（ibrutinib）。
4. 总结与展望
类风湿性关节炎发病机制复杂，其发生与发展与多种信号通路和细胞因子密切相关，单独抑制其中一条信号通路往往不能达到理想的治疗效果。BTK和JAK3都与RA的发生发展密切相关，而且两者都能调节下游STAT5的磷酸化，进而调节炎症因子的产生。因此，开发BTK/JAK3双靶点抑制剂有望发挥协同作用，增强对RA的疗效。
本研究以课题组前期研究获得的BTK/JAK3双靶点化合物XL-12为先导化合物，进一步探索其构效关系，共设计合成了12个目标化合物。通过体外酶抑制活性评价和细胞增殖抑制活性测定。选取化合物I-3进行抗炎活性评价。结果显示，化合物I-3能有效抑制RAW264.7细胞中IL-6的释放及表达。此外，化合物I-3在小鼠二甲苯致耳廓肿胀模型中显示出一定的抗炎活性，且优于阳性药Ibrutinib。本研究为进一步开发抑制活性强和抗炎活性较优的BTK/JAK3双靶点抑制剂提供了实验依据。
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Figure 4. Synthetic routes of compounds 5a–5l
Reagents and conditions: (i) COCl2, TEA, dichloromethane, 0 ℃– r.t., 2 h;(ii) Pd(dppf)Cl2, Na2CO3 (2 mol/L), dioxane-H2O (4:1), N2, 80 ℃, 3 h
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Figure 5. Synthetic routes of compounds І-1−І-2
Reagents and conditions: (iii) H2, 10% Pd/C, methanol-acetic acid(2:1), r.t., 20 h; (iv) HCl/EA, 20 °C, 1 h; (v) acryloyl chloride, TEA, anhydrous dichloromethane/DMF, 0 ℃ then r.t., 3 h
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Figure 6. Synthetic routes of compounds І-3−І-12
Reagents and conditions:(vi) HCl/ethyl acetate, 20 °C, 1 h; （vii) acryloyl chloride, TEA, anhydrous dichloromethane/DMF, 0 ℃ then r.t., 3 h
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Figure 7. Compound І-3 inhibited the productions and mRNA levels of cytokines IL-6 in RAW264.7 cell treated with LPS（$\overline{x}$±s，n=3）
A: Intracellular concentrations of IL-6; B: mRNA transcription levels of IL-6##P < 0.01 vs control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs model group
Table 1 Enzyme inhibition of І-1- І-12 against BTK and JAK3
Compd. IC50/(nmol/L) Compd. IC50/(nmol/L) BTK JAK3 BTK JAK3 І-1 0.3 22.5 І-9 2.2 22.2 І-2 <0.1 99.2 І-10 （98.3%） （66.5%） І-3 1.6 16.2 І-11 （96.9%） （17.1%） І-4 0.2 25.8 І-12 （94.8%） （17.9%） І-5 1.5 69.6 XL-12 2.0 14.0 І-6 25.9 1131 Staurosporine NT 0.12 І-7 （93.8%） （50.6%） Ibrutinib 0.29 NT І-8 （99.0%） （42.0%） NT : no test; Figures in brackets are inhibition rate at 100 nmol/L 
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Table 2 Effect of compound І-1 and І-3 against Daudi and BaF3-JAK3 cell
Compd. IC50/（μmol/L） Daudi BaF3-JAK3 І-1 3.91 2.65 І-3 1.43 0.93 XL-12 0.69 0.37 Paclitaxel 0.0057 NT Tofacitinib NT 0.65 NT: no test
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Table 3 Effect of compound І-3 on mouse ear swelling
Group Dose/(mg/kg) Swelling rate /% Swelling inibition rate/% Model - 145.98 - Ibrutinib 10 98.19 32.74 І-3 5 107.18 26.58 І-3 10 77.16* 47.15 І-3 20 72.51* 50.33 *P<0.05 vs model group
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期刊类型引用(1)
1. 凌珍，张洁，黄艳琴，张敏，韦理莎，罗佳媛，何林洪. 选择性JAK2&JAK3双重抑制剂的设计和合成. 化学试剂. 2025(04): 105-111 . 
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