PDZ结合激酶(PDZ-binding kinase，PBK)，也称为T淋巴因子激活的杀伤细胞来源蛋白激酶(T-lymphokine-activated killer-cell-originated protein kinase，TOPK)，是一种癌症/睾丸抗原^[1]，除了在睾丸生殖细胞和一些胎儿组织外，在正常组织中几乎无法检测到PBK表达，而在血液癌、乳腺癌、黑色素瘤、宫颈癌、肺癌、结直肠癌和肝癌等多种肿瘤组织中观察到PBK的异常过表达或激活^[2]。PBK作为一种双特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞周期调节和有丝分裂进程中发挥至关重要的作用^[3]。PBK在多种原发性肿瘤中的过表达与肿瘤发生、转移、侵袭性增强和耐药性有关^[4]。多种肿瘤组织中PBK的表达与患者的不良预后之间存在显著关系，PBK可以作为肿瘤预后不良的潜在标志物和预测因子^[5]。越来越多的证据表明，PBK与肿瘤发生发展密切相关，并且在大多数肿瘤组织中特异性过表达，是癌症免疫治疗的潜在有效靶点。

目前针对PBK分子设计的药物主要为小分子抑制剂，仍处于临床前阶段^[6]。HI-TOPK-032和OTS964是两种报道较多的靶向PBK的小分子抑制剂，然而它们的作用机制很可能涉及间接靶向多种激酶，并且溶解度和毒性方面存在极大问题，这限制了其临床应用^[7−8]。与小分子抑制剂相比，肿瘤疫苗能够主动激活免疫反应，具有肿瘤靶向性、激活免疫特异性的优势，并能产生长期的抗肿瘤免疫记忆，具有治疗转移性肿瘤和预防肿瘤复发的潜力^[9]。治疗性肿瘤疫苗的优势还包括最小的非特异性影响、广泛的治疗窗口、低毒性，同时其给药剂量小且给药次数少利于提高患者的依从性，在癌症治疗中具有良好的临床应用前景^[10]。由于PBK是自体抗原，免疫自我耐受机制会消除对其具有高亲和性的特异性免疫细胞，肿瘤疫苗则必须通过刺激低亲和力的反应性T细胞来打破耐受^[11]。因此，克服对肿瘤相关抗原的耐受性仍然是基于肿瘤疫苗的免疫疗法的障碍。

因此，本研究利用实验室前期筛选获得的硝基化T细胞表位Nitrath，设计了PBK蛋白疫苗，命名为PBK-Nitrath，并对其抗肿瘤活性进行了研究。结果证实，PBK-Nitrath可以显著抑制H22肝癌肿瘤生长，提高外周血与脾脏中CD8^＋CD107a^＋ T细胞的比例，同时可促进肿瘤中细胞毒性T淋巴细胞的浸润，提示PBK-Nitrath是有潜力的肿瘤疫苗候选分子。

1.   材　料

1.1   试　剂

IFN-γ ELISpot检测试剂盒(德国AID公司)；CpG1018(北京擎科生物科技有限公司)；RPMI 1640培养基、DMEM高糖培养基、EasyPure RNA Kit试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；红细胞裂解液、PE-Cy7标记的抗小鼠CD8a抗体；FITC标记的抗小鼠CD45抗体、FITC标记的抗小鼠CD3抗体、PE标记的抗小鼠CD8a抗体、PerCP/Cyanine5.5标记的抗小鼠CD3抗体、Alexa Fluor® 700标记的抗小鼠CD107a抗体(美国BioLegend公司)；APC标记的抗小鼠CD107a抗体、7-AAD活性染色溶液、CFSE细胞增殖试剂盒(美国赛默飞公司)；HiScript Ⅲ RT Super-Mix for qPCR试剂、染料法定量PCR检测试剂盒(南京诺唯赞生物科技公司)；其他试剂均为市售分析纯。

1.2   仪　器

Nanodrop 2000分光光度计、高速冷冻离心机(美国Thermo公司)；水平离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)；Countstar全自动细胞计数仪(上海泽权仪器设备有限公司)；AKTA Pure 25M蛋白纯化系统(美国Cytiva公司)；Accuri C6流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3   动　物

SPF级BALB/c雌性小鼠，6周龄，购于杭州子源实验动物科技有限公司，合格证号20231220Abzz0105000739。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

1.4   细胞株

小鼠肝癌细胞株H22为生物药物成药性研究重点实验室保存。

1.5   菌种和质粒

E.coli BL21(DE3)、pET28a(+)Vector均为生物药物成药性研究重点实验室保存。

2.   方　法

2.1   PBK-Nitrath蛋白的设计构建

根据UniProt蛋白在线数据库（www.uniprot.org）获得鼠源PBK蛋白序列>sp|Q9JJ78|1-330，将PBK原型蛋白命名为PBK。通过柔性连接肽LRMK将PBK与硝基化T表位进行连接，命名为PBK-Nitrath。

根据大肠埃希菌密码子偏好性，对PBK-Nitrath的DNA序列进行优化，将优化后的序列通过同源重组合成到pET28a(+)表达载体上。将测序正确的PBK-Nitrath质粒转化至含pAC-4tRNA-pNO2PheRS质粒的BL21(DE3)感受态中，将菌液均匀涂布在含有卡那霉素和氯霉素抗性的固体琼脂LB平板表面上。37℃倒置过夜培养后，用接种环无菌条件下挑取阳性单克隆，扩大培养，保存菌种。

2.2   PBK-Nitrath蛋白的表达纯化

取甘油菌200 μL，接种于LB培养基(含100 μg/mL 卡那霉素、17 μg/mL 氯霉素) 20 mL中，37 ℃过夜培养。取过夜活化的菌液10 mL转接于M9培养基(含100 μg/mL 卡那霉素、17 μg/mL 氯霉素) 1 L中，37 ℃，220 r/min培养7.5 h后，加终浓度为1 mmol/L的对硝基苯丙氨酸，培养0.5 h后，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，37 ℃，220 r/min培养18 h后，8000 r/min，30 min收集菌体。超声破碎菌体，离心取沉淀，对包涵体进行清洗以除去杂蛋白和核酸等杂质。用8 mol/L尿素对包涵体进行变性，4 ℃过夜搅拌，变性液过Ni亲和色谱柱，用20 mmol/L咪唑缓冲液洗脱杂蛋白，200 mmol/L咪唑缓冲液洗脱目的蛋白，然后按体积比1∶20加入复性缓冲液，用磷酸盐缓冲液透析，超滤浓缩，BCA法测蛋白浓度。

2.3   IFN-γ ELISpot法检测PBK-Nitrath的免疫原性

将6周龄雌性BALB/c小鼠分成将小鼠分为3组，分别为对照组(佐剂CpG1018 20 μg)、PBK组(PBK蛋白50 μg + 佐剂CpG1018 20 μg)、PBK-Nitrath组(PBK-Nitrath蛋白50 μg + 佐剂CpG1018 20 μg)，每组6只。皮下免疫小鼠，每周免疫1次，共免疫3周。最后一次免疫1周后，处死小鼠。此外，分离主要器官肝脏与肾脏，用4%多聚甲醛固定，并切片进行HE染色，以评估组织损伤或异常。

在75%乙醇中浸泡5 min后，无菌条件下取出脾脏。并用PBS对脾脏进行清洗和研磨，过70 μm筛网；用PBS对细胞和筛网进行冲洗，转移至离心管中，离心，1200 r/min，5 min；再加入红细胞裂解液4 mL重悬细胞，37 ℃静置5 min；补加PBS至10 mL，1200 r/min离心5 min；再重复用PBS洗涤细胞两次；用RPMI 1640完全培养基对细胞进行重悬，进行细胞计数。

准备IFN-γ ELISpot试剂板，加入灭菌PBS清洗4次。然后加入RPMI 1640完全培养基，室温静置孵育30 min。倒弃培养基，随后在各孔中加入对应的刺激物，其中刺激用蛋白每孔10 μg，阳性刺激物每孔10 μg。接着加入小鼠脾脏淋巴细胞悬液，每孔5×10⁵个细胞,设置阳性对照和阴性对照。37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h。PBS洗涤5次。加入稀释的IFN-γ检测抗体(R4-6A2-biotin)，室温孵育2 h。PBS洗涤5次，加入稀释的酶标亲和素抗体，室温孵育2 h。PBS洗涤5次，加入过滤后的显色液，避光显色20 min。用去离子水洗涤正反面及底座3~5遍，终止显色。将板条避光密封保存，酶联免疫斑点分析仪读取数据。

2.4   细胞毒性T淋巴细胞杀伤效应检测

将200 μL，5×10⁴个H22细胞提前铺于48孔板。37 ℃、5% CO₂培养4 h。收集过夜刺激孵育的脾脏淋巴细胞到离心管中，1200 r/min离心5 min。加入PBS 10 mL，1200 r/min离心5 min。加入适量的PBS重悬细胞，添加CFSE，使其终浓度为2 μmol/L，立即混合并在室温下避光孵育7 min。通过添加4倍体积的预冷的RPMI 1640完全培养基停止标记，并在冰上孵育10 min，1200 r/min离心5 min。用预冷的RPMI 1640完全培养基洗涤细胞2次，1200 r/min离心5 min。加入完全培养基重悬计数，按照50∶1效靶比进行铺板，2.5×10⁶个脾脏淋巴细胞，5×10⁴个H22细胞。孵育24 h。收集培养基，再加入PBS洗涤，收集上清液，1769 r/min离心5 min。用70 μm滤膜过滤，每孔在上样前5 min加入7-AAD 5 μL，流式细胞仪检测。

2.5   基于H22肝癌皮下移植瘤的PBK-Nitrath疫苗抗肿瘤活性评价

BALB/c小鼠腹腔移植2×10⁶个H22细胞，腹腔培养10 d后，抽取腹水，分离H22细胞，每只BALB/c小鼠于右后肢靠背部位皮下注射2×10⁵个H22细胞。当肿瘤体积达到10~40 mm³时，选择造模成功且肿瘤形态规则的小鼠，以肿瘤体积大小为标准进行随机区间分组，确保组间小鼠肿瘤体积和体重大小没有显著性差异。将小鼠分为3组，分别为对照组(佐剂CpG1018 20 μg)、PBK组(PBK蛋白50 μg + 佐剂CpG1018 20 μg)、PBK-Nitrath组(PBK-Nitrath蛋白50 μg + 佐剂CpG1018 20 μg)，每组8只。分组当天(第0 天)进行皮下免疫，随后在第7、14 天进行两次免疫，共免疫3次。一周测量肿瘤体积和体重2次。皮下肿瘤体积计算方法为：体积 = (长×宽²) / 2。

2.6   流式细胞术分析PBK-Nitrath对外周血T细胞亚群的影响

摘除小鼠眼球取外周血约100 μL至抗凝管中并弹匀。加入1×红细胞裂解液2 mL，室温避光孵育12 min，加入PBS 3 mL终止裂解，4 ℃，1769 r/min离心5 min弃上清液。再重复用PBS洗涤细胞两次，加入含1% BSA的PBS 1 mL重悬细胞。CD8⁺CD107a⁺ T淋巴细胞染色根据流式抗体说明书操作。

2.7   流式细胞术分析PBK-Nitrath对脾脏T细胞亚群的影响

无菌条件下取出脾脏，并用PBS对脾脏进行清洗和研磨，过70 μm筛网；用PBS对细胞和筛网进行冲洗，转移至离心管中，1200 r/min离心5 min；再加入红细胞裂解液4 mL重悬细胞，37 ℃静置5 min；补加PBS至10 mL，1200 r/min离心5 min；再重复用PBS洗涤细胞两次；用RPMI 1640完全培养基对细胞进行重悬，进行细胞计数。CD8⁺CD107a⁺ T淋巴细胞染色根据流式抗体说明书操作。

2.8   流式细胞术分析PBK-Nitrath对肿瘤浸润淋巴细胞的影响

取实体肿瘤组织新鲜标本，用手术剪去除坏死及脂肪组织，选取肿瘤细胞集中和细胞活力较好的部位。将组织切成直径1~2 mm的碎块，随后将肿瘤组织转移至装有消化酶的离心管中。37 ℃水浴消化40 min，每隔10 分钟颠倒混匀。将细胞悬液经70 μm滤网过滤，PBS冲洗，收集滤液，1769r/min离心7 min。加入PBS重悬细胞。设置实验组、单染组和空染组，每个样本取2×10⁶个细胞，加入PBS 1 mL重悬细胞，1769 r/min离心5 min。加入含1% BSA的PBS 1mL重悬细胞。CD3⁺CD8⁺ T淋巴细胞、CD8⁺CD107a⁺ T淋巴细胞染色根据流式抗体说明书操作。

2.9   肿瘤组织RNA分离提取和qRT-PCR

每个小鼠肿瘤样本称取20 mg，放入液氮预冷的研钵中研磨成粉，随后使用RNA提取试剂盒提取肿瘤组织RNA。使用Nanodrop 2000检测RNA的浓度和纯度。使用HiScript Ⅲ RT Super-Mix for qPCR试剂将每个样本的总RNA 1 μg反转录为cDNA，使用染料法定量PCR检测试剂盒通过qRT-PCR检测基因表达差异。实验步骤按照试剂盒操作说明书进行。

2.10   统计学分析

采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计学分析，各项结果以$ \bar{x} $±s表示。采用One-Way ANOVA方差分析对3组及以上样本进行显著性比较，P < 0.5被认为具有统计学意义。

3.   结　果

3.1   PBK-Nitrath蛋白疫苗的表达纯化

大肠埃希菌发酵后诱导表达PBK-Nitrath蛋白，取IPTG诱导前后全菌进行电泳，相比于诱导前的菌体，IPTG诱导后PBK-Nitrath在39.9 kD附近出现了条带(图1-A)，与目的蛋白的相对分子质量大小相符。对PBK-Nitrath利用His标签进行Ni柱分离纯化，经6×His标签抗体的Western blot检测，纯化产物与目的蛋白PBK-Nitrath的相对分子质量大小一致(图1-B)。经SDS-PAGE检测，通过image J软件分析，PBK-Nitrath蛋白的纯度大于95%(图1-C)。同时制备了原型蛋白PBK作为对照。

Figure  1.  Expression and identification of PBK-Nitrath

A: SDS-PAGE analysis of PBK-Nitrath expression（M: Marker;1: Before induction;2: After induction）; B: Western blot of the purified PBK-Nitrath protein（M: Marker;1: PBK-Nitrath）; C: SDS-PAGE of the purified PBK-Nitrath protein（M: Marker;1: PBK-Nitrath）

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3.2   PBK-Nitrath的免疫原性检测

按照“2.3”项对雌性BALB/c小鼠进行分组、免疫。分离免疫后各组小鼠的脾脏淋巴细胞，采用ELISpot法检测脾脏中的T细胞分泌IFN-γ的水平。结果如图2-A所示，相较于对照组(生理盐水+佐剂，下同)，PBK-Nitrath组在疫苗免疫后脾脏中的T细胞的IFN-γ分泌水平显著提高(P < 0.0001)，并显著高于PBK组(P < 0.01)，这表明PBK-Nitrath能够有效诱导PBK抗原特异性T细胞的激活。

Figure  2.  Immunogenicity of PBK-Nitrath vaccine($ \bar{x} $ ± s, n = 6)

A: IFN-γ secretion levels in spleen lymphocytes；B: In vitro killing toxicity of splenic lymphocytes；C: Tissue slices of liver and kidney of mice after immunization (100×, HE); D: Changes in body weight of mice during immunization**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001

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肿瘤疫苗发挥作用的关键在于诱导机体产生对于肿瘤的细胞免疫，为了验证这一点，在体外进行细胞毒性T淋巴细胞杀伤效应检测，评估免疫激活后的T细胞对H22肝癌细胞的杀伤能力。分离免疫过后的BALB/c小鼠的脾脏淋巴细胞作为效应细胞，选择肿瘤细胞株H22为靶细胞，以50∶1的比例共孵育后，采用CFSE/7AAD染色，使用流式细胞术进行分析。结果如图2-B所示，PBK-Nitrath疫苗诱导的细胞毒性T淋巴细胞具有很高的体外杀伤活性，为(16.35 ± 3.207)%，显著高于对照组(P < 0.001)和PBK组(P < 0.01)。

对经过3次疫苗免疫后的各组小鼠肝肾进行HE染色，结果如图2-C显示，PBK-Nitrath免疫的小鼠肝肾细胞形态正常，未见明显异常。免疫过程中称量小鼠体重，结果如图2-D所示，PBK-Nitrath免疫小鼠未导致小鼠体重明显减轻，与对照组之间无显著性差异。

3.3   基于H22肝癌皮下移植瘤的PBK-Nitrath疫苗抗肿瘤活性评价

按照“2.5”项对BALB/c小鼠进行分组、免疫。在第19 天，对照组小鼠肿瘤即将超过2000 mm³，遂将小鼠处死进行后续的检测。如图3-A所示，到第19 天处死时，对照组的肿瘤体积达到了(1982 ± 488.3) mm³，而PBK-Nitrath组的肿瘤体积仅为(1003 ± 382.1) mm³，表明PBK-Nitrath疫苗能显著抑制H22皮下移植瘤的生长（P < 0.001）。肿瘤组织的称重结果见图3-B，从图中可知，实验终点时，PBK-Nitrath组的肿瘤重量为(0.56 ± 0.34) g，显著低于对照组(P < 0.01)，也远低于PBK组(P < 0.05)，表明PBK-Nitrath可以显著抑制肿瘤生长。

Figure  3.  Antitumor activity of PBK-Nitrath ($ \bar{x} $ ± s, n =8)

A: Tumor volume growth curve；B: Tumor weight；C: Tumor tissue *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001

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3.4   小鼠肝癌模型中外周血和脾脏CD8⁺ T淋巴细胞分化情况

通过流式细胞术对小鼠外周血和脾脏中CD8⁺CD107a⁺ T细胞的比例进行测定。结果如图4-A所示，相较于对照组，原型蛋白PBK组外周血中CD8⁺CD107a⁺ T细胞的比例并未出现明显差异，而免疫PBK-Nitrath疫苗后增加了外周血中CD8⁺CD107a⁺ T细胞的比例(P < 0.05)，达到(0.3035 ± 0.1713)%。对于脾脏中的CD8⁺ T细胞(图4-B)，与对照组相比，PBK-Nitrath疫苗给药后提高了小鼠脾脏中CD8⁺CD107a⁺ T细胞的比例(P < 0.0001)，达到(0.7450 ± 0.1538)%，同时与PBK组相比也产生差异(P < 0.001)。这些结果表明，PBK-Nitrath疫苗可以提高外周血和脾脏中CD8⁺CD107a⁺ 双阳性T细胞的比例。

Figure  4.  Frequency of CD8⁺CD107a⁺ T cells in the peripheral blood and spleen of mice with hepatic carcinoma($ \bar{x} $ ± s, n =8)

A: Peripheral blood；B: Spleen *P < 0.05, ***P< 0.001, ****P < 0.0001

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3.5   肿瘤浸润淋巴细胞检测

通过流式细胞术检测肿瘤组织中CD8^＋ T细胞、CD8^＋CD107a^＋ T细胞的浸润情况。结果如图5-A所示，与对照组相比，PBK-Nitrath疫苗接种显著提高了CD8^＋ T细胞的肿瘤浸润水平(P < 0.05)。更为重要的是，PBK-Nitrath组肿瘤微环境中CD8^＋CD107a^＋ T细胞的比例显著高于对照组(P < 0.0001)与PBK组(P < 0.001)，达到(6.815 ± 2.214)% (图5-B)，提示PBK-Nitrath疫苗接种有效增强了naïve CD8^＋ T细胞向细胞毒性T淋巴细胞的扩增和分化，从而增加了肿瘤微环境中细胞毒性T淋巴细胞的浸润，增强其特异性杀伤肿瘤细胞的能力。

Figure  5.  Detection of tumor-infiltrating lymphocytes in mouse tumor tissues($ \bar{x} $ ± s, n =8)

A: Proportion of CD8^＋ to CD3^＋ T cells；B: Proportion of CD107a^＋ to CD8^＋ T cells；C: Detection of mRNA transcript levels of Granzyme B in tumor tissues by qRT-PCR；D: Detection of mRNA transcript levels of IFN-γ in tumor tissues by qRT-PCR *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001

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细胞毒性T淋巴细胞介导的直接杀伤需要细胞间接触，通常由细胞溶解酶如颗粒酶B的释放引起，并能够分泌IFN-γ等细胞因子，增强其细胞毒作用从而间接杀伤靶细胞，这些效应蛋白的表达与分泌水平可以评价细胞毒性T淋巴细胞的效应功能。肿瘤组织中颗粒酶B (图5-C)和细胞因子IFN-γ (图5-D)的转录水平检测结果显示，相较于对照组，PBK-Nitrath组肿瘤组织中颗粒酶B (P < 0.001)和IFN-γ (P < 0.0001)的mRNA转录水平显著提高，表明PBK-Nitrath疫苗的接种可以增强肿瘤微环境中细胞毒性T淋巴细胞对肿瘤细胞的潜在杀伤能力。

4.   讨　论

目前靶向PBK的肿瘤疗法主要是以小分子抑制剂为代表的靶向治疗，但小分子靶向药物存在着半衰期短、特异性不强、耐药性甚至毒性等问题^[12]。而治疗性肿瘤疫苗具有明显优势：主动激活免疫系统，肿瘤特异性强，不良反应少；具有免疫记忆性，防止复发与转移；给药次数少，患者依从性好等^[13]。但由于PBK属于自身抗原，存在自身免疫耐受，较低的免疫原性限制了疫苗开发。本研究将课题组前期筛选得到的硝基化T细胞表位应用于靶向癌症/睾丸抗原PBK的疫苗设计中，并使用CpG1018作为佐剂。因PBK的细胞定位在细胞质及细胞核中，抗体介导的体液免疫并不能起到杀伤肿瘤的效果，因此主要考察了疫苗对细胞毒性T淋巴细胞的激活和杀伤肿瘤的能力。免疫原性实验结果与实验室前期的研究结果一致，该硝基化T细胞表位可以辅助自身抗原PBK打破免疫耐受，显著提高了其免疫原性。PBK-Nitrath疫苗有效诱导PBK抗原特异性T细胞的激活，使之分泌更高水平的IFN-γ，同时PBK-Nitrath诱导产生的细胞毒性T淋巴细胞具有很高的体外杀伤活性。抑瘤实验结果表明，PBK-Nitrath疫苗能诱导BALB/c小鼠产生针对PBK的细胞免疫应答，显著抑制了H22皮下移植瘤的生长，表现出良好的抗肿瘤活性。

研究显示，免疫细胞如CD8⁺ T细胞的富集与癌症患者的生存期延长和免疫治疗疗效的提高有关^[14]。肿瘤微环境中细胞毒性T淋巴细胞的数量是癌症的关键预后标志物，细胞毒性T淋巴细胞浸润多的肿瘤更容易对免疫治疗产生反应^[15]。肿瘤中缺乏T细胞可导致对免疫治疗的耐药性^[16]。因此，目前免疫疗法的重点是增强肿瘤内细胞毒性T淋巴细胞的活性，促进淋巴组织内细胞毒性T淋巴细胞的启动，并建立持久有效的抗肿瘤免疫^[17]。本研究结果表明，PBK-Nitrath疫苗可以有效增加肿瘤组织中CD8⁺ T细胞的浸润，并在外周血、脾脏与肿瘤组织中都观察到CD8⁺ T细胞活化与细胞毒性脱颗粒的标志物CD107a的增加。这表明PBK-Nitrath疫苗的免疫促进了外周免疫器官与肿瘤微环境中CD8⁺ T细胞的进一步活化，使细胞毒性T淋巴细胞在肿瘤中的浸润增加和细胞毒作用增强。这提示PBK-Nitrath可以在机体免疫系统中建立有效的T细胞抗肿瘤反应，其可能改变肿瘤抑制免疫微环境，需要后续进一步探究。

综上所述，本研究设计的PBK-Nitrath疫苗不仅能诱导抗原特异性T细胞的激活，同时增加了肿瘤中细胞毒性T淋巴细胞的浸润，从而有效抑制肿瘤生长，提示PBK-Nitrath是有潜力的肿瘤疫苗候选分子。