心脑血管疾病是威胁人民身体健康的主要疾病，阿司匹林作为抗血小板聚集的一线治疗药物，临床上被广泛地推荐用于冠心病、心绞痛和脑卒中的预防和治疗，阿司匹林用于上述疾病的预防常用的剂量为75~100 mg/d ^[1]。红花黄色素（safflower yellow injection，SYI）是由红花中提取的活性成分，主要功效是活血化瘀、通脉止痛，临床被广泛用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、脑血栓等心脑血管疾病。临床上，SYI和阿司匹林是用于防止心脑血管疾病的常见药物^[2]，临床联合使用的频率高^[3]。因此从药物相互作用角度阐述阿司匹林和SYI联合使用后对阿司匹林的抗凝活性和安全性的影响具有重要的临床价值。

药物相互作用包括药效学相互作用和药动学相互作用，不合理的联合使用可引起严重的药物不良反应，为临床合理用药提供参考，目前SYI和阿司匹林是否存在药物相互作用还没有报道；本研究从药动学相互作用和长期使用后阿司匹林的抗凝作用及肝肾毒性，探讨阿司匹林与SYI的药物相互作用特征，评价阿司匹林与SYI联合使用对阿司匹林水解产物水杨酸的药动学影响，以及对阿司匹林抗凝作用的影响。

1.   材　料

1.1   药品与试剂

阿司匹林对照品（纯度大于99%，批号J07J11Q107646）、对照品水杨酸（纯度大于99%，上海源叶生物科技有限公司）；SYI氯化钠注射液（50 mL/瓶，山西德元堂药业有限公司）；苯甲酸对照品（纯度大于98%，天津登峰化学试剂厂）；血栓烷B2（thromboxane B2，TXB2）、6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂为市售分析纯。

1.2   仪　器

LC-2010A 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Centrifuge 台式微量冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；BSA124S 电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）； IX53倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）；M plex多功能酶标仪（德国耶拿公司）；贝克曼 AU680 型全自动生化分析仪（美国贝克曼AU-680公司）。

1.3   动　物

SPF级雄性SD大鼠，12周龄，体重180~200 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，实验动物合格证号SCXK（京）2019-0010。大鼠饲养由江苏医药职业学院实验动物中心负责，动物饲养的环境温度为18~29 ℃，相对湿度为40%~70%。本研究所有动物实验均通过江苏医药职业学院动物伦理委员会的批准（批准号SYLL-2023-010）。

2.   方　法

2.1   色谱条件

岛津LC-2010AHT，安捷伦Eclipse PLUS C₁₈色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）：0.2%磷酸-水（B），梯度洗脱：0~12 min，85%~65%B；12~17 min，65%~0%B；17~22 min，0%~85%B。流速为1.0 mL/min；检测波长设置为228 nm，柱温设置35 ℃，进样量10 μL。

2.2   溶液制备

分别精密称取水杨酸对照品5.1 mg、乙酰水杨酸对照品5.6 mg，置50 mL量瓶中，加0.1%磷酸甲醇溶解并稀释至刻度线，摇匀，取适量稀释配制成溶液质量浓度为100 μg/mL贮备液。另外精密称取内标对照品苯甲酸12.6 mg，置100 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容，制得126 μg/mL内标溶液。上述溶液均置于4 ℃冰箱中保存备用。

2.3   给药方案、血浆及样品的采集处理

将24只SD大鼠随机分为4组分别为：阿司匹林组（短期和长期）和阿司匹林-SYI联合使用组（短期和长期），每组6只。

2.3.1   短期评价

测定血浆样品中水杨酸的含量：阿司匹林组大鼠灌胃阿司匹林溶液1次（10.0 mg/kg）；联合使用组大鼠灌胃阿司匹林溶液（10.0 mg/kg）1 h后立即尾静脉给予SYI（10.0 mg/kg）。阿司匹林和SYI的用药剂量相当于标准体重60 kg的患者每日服用100 mg 的阿司匹林^[4]或静脉滴注40 mL 的SYI^[5] ；两组在阿司匹林给药后0.08，0.25，0.5，1，1.5，2，4，6，8，10，12，24 h从大鼠眼眶静脉丛采血0.3 mL，置于离心管中，3000 r/min（4 ℃）离心时间10min，分离血浆，然后将血浆置于−20 ℃冰箱中冻存，待测，取血过程中允许大鼠自由摄取生理盐水，用于补充大鼠的循环血量^[6]。

2.3.2   长期评价

检测血浆样品中TXB2和6-keto-PGF1α水平、肝肾功能以及心脏病理。阿司匹林组大鼠灌胃阿司匹林溶液每日1次（10.00 mg/kg）；联合使用组大鼠灌胃阿司匹林溶液每日1次（10.00 mg/kg），尾静脉给予SYI（10.00 mg/kg）每日1次（10.00 mg/kg），第14 天给药结束后，所有大鼠禁食24 h。第15天用10%水合氯醛溶液将所有大鼠麻醉（0.3 mL/100 g），进行颈总动脉取血并处死大鼠后取出心脏进行病理学检查。血液样品置于装有枸橼酸钠溶液（3.8%）的离心管中，离心（3000 r/min 8 min）后取上清液得血浆样品。采用TXB2和6-keto-PGF1α试剂盒测定血浆TXB2和6-keto-PGF1α水平，具体方法和过程按照试剂盒说明书操作，采用全自动生化仪测定肝肾功能。心脏组织病理学检测采样用4％多聚甲醛固定24 h，用石蜡包埋、制片、HE染色，100倍光学显微镜下观察心脏组织形态学改变，同时进行HE 染色半定量分析，0~1分：无出血点；1~2分：出血点面积小于25％；2~3分：出血点面积为25％~50％；3 分：出血点面积大于50％。

2.4   血浆样品预处理

精密吸取血浆样品100 μL于1.5 mL离心管中，加入含有内标（126 μg/mL苯甲酸溶液，20 μL）的 0.1%磷酸甲醇800 μL沉淀蛋白，涡旋2 min，10000 r/min 离心10 min，取上清液进样，进样量10 μL。

2.5   分析方法验证

按照2020年版《中华人民共和国药典》（四部）通则“生物样品定量分析方法验证指导原则”的要求对方法的专属性、线性、精密度、准确度、提取回收率、稳定性等进行考察。结果显示，水杨酸和内标苯甲酸分离完全，峰形良好，保留时间分别为10.7和9.7 min；提示空白血浆样品中的内源性成分、内标对水杨酸的测定没有产生干扰（图1）。以待测成分质量浓度（x）为横坐标、待测成分与内标峰面积比值（y）为纵坐标进行线性回归，求得水杨酸直线回归方程y=0.1439x−0.0103 (r=0.9980)，水杨酸检测浓度的线性范围为3.25~260 μg/mL，定量下限为3.25 μg/mL。精密度与准确度试验结果显示，水杨酸定量下限浓度（3.25 μg/mL）和低、中、高浓度（6.5、65、130 μg/mL）质控样品的批内、批间精密度RSD 均不高于14.36%，准确度RE为−4.63%~2.68%；水杨酸低、高浓度质控样品在室温下放置24 h、−20 ℃放置20 d、反复冻融（−20 ℃至室温）3次后，测得稳定性RE为−8.08%~4.01%；水杨酸定量下限和低、中、高浓度质控样品的平均提取回收率为93.13%~99.10%（RSD<6.48%）。

Figure  1.  High performance liquid chromatography

A: Blank rat plasma; B: Blank plasma + IS + salicylic acid standard; C: Plasma of rats from aspirin + safflower yellow injection(SYI) group after 30 min administration; D: Plasma of rats in aspirin group 30 min after administration

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2.6   数据处理

实验数据均用$ \bar{x} $±s表示。数据统计分析采用GraphPad Prism8.0软件，利用 Nonparametric Mann-Whitney Test方法进行组间差分析，P<0.05表示有显著性差异。

3.   结　果

3.1   阿司匹林与SYI联合使用对阿司匹林药物代动力学的影响

基于HPLC建立的分析方法能快速分离并定量测定血浆样品中的水杨酸。将空白血浆+水杨酸+IS以及给药后30 min的血浆样品，分别按照“2.2”项下方法处理后进样分析。结果显示，阿司匹林在吸收入血后，会迅速被胃黏膜、血浆、红细胞及肝中的酯酶水解为水杨酸；阿司匹林与SYI联用后对其代谢产物水杨酸的代谢动力学特征无显著影响（图2）。与阿司匹林组相比，水杨酸在联合使用组24小时药-时曲线下面积（AUC_{0-24 h}）以及最大血药浓度（c_max）均无显著变化（P >0.05，表1）。

Figure  2.  Average blood concentration and time curve of salicylic acid in rats after one dose of aspirin group and combined administration(aspirin+SYI) group$ （\bar{x} $±s, n=6）

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Table  1.  Comparison of main pharmacokinetic parameters of salicylic acid after single administration between aspirin group and combined administration group ($ \bar{x} $±s, n=6)

Parameter	Aspirin	Aspirin+SYI
tmax/h	1.333±0.258	0.833±0.665
cmax/（μg/mL）	38.844±3.346	40.785±3.588
t1/2/h	4.343±1.033	4.906±0.987
AUC0-t/（μg/mL·h）	281.708±16.902	275.347±27.425
AUC0-∞/（μg/mL·h）	342.184±42.513	341.501±49.193

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3.2   阿司匹林与SYI联合使用对阿司匹林抗血小板作用的影响

结果显示，SYI联合使用组的血浆TXB2与阿司匹林组相比下降明显（P<0.01，图3-A）。但是，阿司匹林组与联合使用组的血浆6-keto-PGF1α水平几乎无明显差异（图3-B），提示阿司匹林与SYI联用并不会拮抗阿司匹林的抗血小板作用，反而增强了整体的抗血小板作用。

Figure  3.  Effect of aspirin and combined administration group on antiplatelet action ($ \bar{x} $±s, n=6)

A: Plasma TXB2；B：Plasma 6-keto-PGF1α ***P < 0.001 vs aspirin group. NS: No significance

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3.3   阿司匹林与SYI联合使用对肝肾功能的影响

给药后第15天颈总动脉取血后离心取血清上层，用全自动生化分析仪检测大鼠的天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotranferase，AST）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（serum creatinine，Scr）水平，两组血清AST、ALT、BUN和Scr水平比较，差异均无统计学意义（P>0.05）（图4）。由此可知，阿司匹林联合SYI组对肝肾功能无损伤。

Figure  4.  Liver and kidney function of rats in long-term aspirin group and combined administration group ($ \bar{x} $±s, n=6)

A: Aspartate aminotransferase (AST); B: Alanine aminotransferase (ALT); C: Blood urea nitrogen (BUN); D: Serum creatinine (Scr)NS:No significance

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3.4   阿司匹林与SYI联合使用对心脏病理的影响

给药后第15天处死动物取心脏组织进行HE染色，观察比较阿司匹林组和阿司匹林联合SYI组心脏病理变化，结果显示阿司匹林联合SYI组未发现有明显的出血点，两组未见明显差异（图5）。可见，阿司匹林联合红花黄色组对心脏出血无显著影响。

Figure  5.  Cardiac cardiac histopathological changes of rats in long-term aspirin group and combined administration group ($ \bar{x} $±s, n=6) (HE, ×100)

A: Aspirin；B: Aspirin+SYI

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4.   讨　论

药动学研究是评价药物之间相互影响的重要依据，本实验结果表明阿司匹林与SYI联用对大鼠血浆主要成分水杨酸的药动学无显著影响。阿司匹林发挥抗凝作用的机制为通过抑制血管内皮细胞中的环氧化酶（cyclo-oxygenase，COX）活化而减少了血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）的生成^[7]。COX主要包括COX1和COX2种亚型。阿司匹林的抗凝作用是作用于COX1活性部位乙酰化发挥抗血小板功能，但是对COX2几乎没有抑制作用一旦有炎症刺激时，COX2表达可急剧增加，引起TXA2大量合成，可导致阿司匹林抵抗的产生。阿司匹林对COX1乙酰化的关键步骤：（1）阿司匹林与COX1的铁离子-血红素阳离子位点（Fe²⁺-heme cationic site）可逆性结合，考虑到类似结构的化合物也可能与该位点结合，因此同时存在阿司匹林和类似物时存在竞争性拮抗的可能^[8]；其次是阿司匹林占据上述结合位点后，立刻对临近位点的丝氨酸残基530产生乙酰化作用，这种作用缓慢而不可逆，进一步产生抑制COX1的活化作用。而阿司匹林水解产物水杨酸由于缺少乙酰基团，对COX不能产生乙酰化作用，提示水杨酸对血小板COX1没有抑制活化作用。但是由于水杨酸与阿司匹林结构类似，因此也具有与阿司匹林相当的铁离子-血红素阳离子位点的亲和力，可导致水杨酸与阿司匹林产生竞争性的拮抗作用，水杨酸的存在会影响阿司匹林与上述位点的结合，这种情况下竞争性拮抗进而削弱了阿司匹林对临近的丝氨酸残基530位点的催化作用^[9]，进而出现水杨酸对血小板COX1也有轻微的抑制作用的现象^[9]，González-Correa等^[10]研究报道阿司匹林抑制血液中TXA2的生成和血小板聚集的能力分别是水杨酸的74和2136倍。因此，尽管阿司匹林可以发挥抗血小板作用，但是当其水解为水杨酸后，抗血小板聚集的作用几乎没有了，而且存在水杨酸浓度依赖性地拮抗阿司匹林的抗血小板作用的现象^[10-11]。这种情况可导致阿司匹林的抗凝作用下降，继发性增加了心肌梗死等心血管疾病的风险^[11−13]。虽然阿司匹林与SYI联用一次后未发现水杨酸血药浓度增加，但是上述两种药长期使用是否会影响阿司匹林水解产物水杨酸血药浓度增加竞争性降低阿司匹林的抗血小板作用有待进一步探讨。本研究表明，阿司匹林与SYI联用并不会拮抗阿司匹林的抗血小板作用，反而增强了整体的抗血小板作用，但是SYI中成分复杂如羟基红花黄色素是否是联合使用产生增强抗血小板的作用还需进一步研究^[14]。

本实验通过长期联用阿司匹林与SYI后，通过测定血浆中稳定存在的TXB2和6-keto-PGF1α水平来探讨阿司匹林与SYI联用对阿司匹林抗血小板的作用。前列腺素合酶是一个同时具有环加氧酶活性和过氧化酶活性的双功能酶。花生四烯酸通过环加氧酶转化成前列腺素G2（prostaglandin G2，PGG2），在过氧化酶作用下，PGG2又被还原成前列腺素H2（prostaglandin H2, PGH2），PGH2具有双重调控作用，一方面可以在血栓合酶作用下生成TXA2，另一方面也可以在前列环素合酶作用下生成前列环素Ⅰ（prostaglandin I2, PGI2）。TXA2和PGI2是发挥调控血小板功能的重要因子，TXA2具有收缩血管的同时还可诱导血管内血小板聚集；PGI2具有抗血小板聚集和扩张血管作用，血小板聚集和解聚的过程同时受TXA2和PGI2的双向调控；虽然TXA2和PGI2通常作为评价抗血小板作用药物的关键指标，但TXA2的生物半衰期很短，快速转化成更为稳定的TXB2；PGI2的水解产物6-keto-PGF1α能够稳定存在血液循环中^[15]。本研究通过测定TXB2和6-keto-PGF1α水平来评估阿司匹林与SYI联用后对阿司匹林抗血小板作用的影响。本研究发现阿司匹林与SYI联用后TXB2出现显著性差异，但是6-keto-PGF1α水平并没有改变提示两药联合使用并没有拮抗阿司匹林的抗血小板作用，增强了抗凝的作用，肝肾功能检测结果显示两组均没有差异提示两药联合使用不会增加肝肾毒性；另外，心脏HE染色显示未发现有出血部位，其具体的作用机制还需进一步探讨。

本研究比较了阿司匹林与SYI联用的大鼠血浆药动学参数，并且初步评价了长期用药的安全性，发现了阿司匹林与SYI联用对阿司匹林水解产物水杨酸药动学没有影响，长期联合使用后未发现肝肾功能异常，心脏病理也显示未发现有异常出血点，为阿司匹林与SYI临床联合用药提供了参考。