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基于网络药理学探讨银杏叶提取物通过激活PPARγ治疗动脉粥样硬化的机制

王子元, 陶惠, 肖映雪, 殷志琦

王子元,陶惠,肖映雪,等. 基于网络药理学探讨银杏叶提取物通过激活PPARγ治疗动脉粥样硬化的机制[J]. 中国药科大学学报,2025,56(2):225 − 235. DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.2024032301
引用本文: 王子元,陶惠,肖映雪,等. 基于网络药理学探讨银杏叶提取物通过激活PPARγ治疗动脉粥样硬化的机制[J]. 中国药科大学学报,2025,56(2):225 − 235. DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.2024032301
WANG Ziyuan, TAO Hui, XIAO Yingxue, et al. Network pharmacology-based study of the mechanism of Ginkgo biloba extract (GBE) in the treatment of atherosclerosis by activating PPARγ[J]. J China Pharm Univ, 2025, 56(2): 225 − 235. DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.2024032301
Citation: WANG Ziyuan, TAO Hui, XIAO Yingxue, et al. Network pharmacology-based study of the mechanism of Ginkgo biloba extract (GBE) in the treatment of atherosclerosis by activating PPARγ[J]. J China Pharm Univ, 2025, 56(2): 225 − 235. DOI: 10.11665/j.issn.1000-5048.2024032301

基于网络药理学探讨银杏叶提取物通过激活PPARγ治疗动脉粥样硬化的机制

详细信息
    通讯作者:

    殷志琦: Tel:13813879136 E-mail:cpu-yzq@cpu.edu.cn

  • 中图分类号: R965

Network pharmacology-based study of the mechanism of Ginkgo biloba extract (GBE) in the treatment of atherosclerosis by activating PPARγ

  • 摘要:

    探讨银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract,GBE)对高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化疾病(atherosclerosis,AS)的影响和作用机制。ApoE-/-小鼠灌胃给予低、高剂量GBE [50、150 mg/(kg·d)],9周后检测小鼠血脂水平,主动脉斑块脂质沉积情况、坏死核心面积和血管炎症水平。利用TCMSP、Swiss Target Prediction、Genecards等公共数据库预测GBE治疗AS的潜在靶点,通过GO和KEGG富集分析寻找其药效发挥的可能机制。在细胞水平上,氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, oxLDL)处理THP-1形成泡沫细胞进行实验,使用油红O染色检测脂质蓄积情况,Dil-oxLDL检测泡沫细胞生成,使用RT-qPCR检测胆固醇摄取和外排受体的mRNA变化情况。最后,使用Western blot、免疫荧光等检测GBE对核心靶点过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferators-activated receptors-γ,PPARγ)表达情况的影响。结果显示,GBE可以减少小鼠主动脉脂质沉积和坏死核心面积,降低血清脂质和炎症水平。在体外减少巨噬细胞胆固醇摄取、增加胆固醇外排。本研究表明,GBE可以通过增强PPARγ的表达减少泡沫细胞的生成,抑制主动脉胆固醇蓄积和斑块的形成,缓解AS。

    Abstract:

    To investigate the effect of Ginkgo biloba extract (GBE) on lipids accumulation and the progression of atherosclerosis(AS), ApoE-/- mice fed with HFD were injected i.g. with two different doses of GBE (GBE-L 50 mg/(kg·d) or GBE-H 150 mg/(kg·d)) for 9 weeks. The core targets and potential mechanisms of GBE therapy for AS were investigated using network pharmacological target prediction. Subsequently, oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL)-induced THP-1 was used to investigate the effect of GBE on foam cell formation through oil red staining and Dil-oxLDL fluorescent staining. The mRNA alterations in cholesterol uptake and efflux receptors were detected by real-time quantitative PCR. Finally, the impact of GBE on the expression of PPARγ as the core target was assessed through Western blot and immunofluorescence. It was found that GBE improved serum lipid profile, reduced necrotic cores and lipid deposition in aortic root plaques, and decreased the level of inflammatory factors in serum of ApoE-/- mice. Moreover, GBE treatment reduced the level of intracellular lipid accumulation and inhibited cholesterol uptake and efflux to alleviate foam cell formation. GBE activated PPARγ to enhance ABCA1/ABCG1-induced cholesterol efflux in THP-1. These results suggest that GBE can suppress lipid accumulation and alleviate foam cell formation by activating PPARγ pathway.

  • 动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种脂质斑块在中、大动脉壁上积聚,导致血流减少或阻塞的疾病,是多种心血管疾病的发病基础[1]。AS早期,在血流动力学的作用下血管内皮发生损伤引起血液中的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)进入内膜下空间形成氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein, oxLDL),oxLDL刺激血管内皮引起单核细胞招募进入内膜下空间并诱导其分化为巨噬细胞,随后巨噬细胞吞噬积聚的oxLDL最终形成泡沫细胞[2]。泡沫细胞的形成是AS的重要标志,其形成的主要原因是胆固醇酯在胞内过度蓄积。胆固醇外排是将泡沫细胞中蓄积的胆固醇酯水解为游离胆固醇后,通过水扩散或膜转运体介导的方式将游离胆固醇外排到胞外的过程[3]。外排的胆固醇会通过胆固醇逆向转运(reverse cholesterol transport, RCT)至肝脏完成降解。因此,增强胆固醇外排被认为是缓解胆固醇酯过度蓄积,抑制泡沫细胞生成的重要手段[4]

    前人研究发现,在泡沫细胞生成前后,细胞内胆固醇外排速率的改变是膜转运体介导的胆固醇外排能力下降导致的,因此,增强膜转运体介导的胆固醇外排,恢复胆固醇的胞内稳态是减少泡沫细胞生成的可行策略[5]。ATP结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)与 ATP 结合盒亚家族G成员1 (ATP-binding cassette subfamily G member 1, ABCG1)同属于ABC转运蛋白超家族,该转运蛋白家族可以利用ATP作为能量来源跨细胞膜运输各种底物,以保护生物体免受外源物(例如oxLDL)的侵害。研究表明,通过在THP-1和MPMs诱导生成泡沫细胞中对ABCG1和ABCA1介导的胆固醇流出量进行检测,结果显示ABCG1和ABCA1介导的胆固醇流出量约占膜转运体介导总胆固醇流出量的70%[6]。已有研究发现,ABCG1会将胆固醇酯外排至高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL),而ABCA1可以增强HDL合成,进而加速RCT过程从而促进ABCG1介导的胆固醇外排。动物水平实验表明,在ApoE-/-小鼠中敲除ABCA1,则在小鼠血液中几乎检测不到HDL,而在ApoE-/-小鼠中敲除ABCG1会引起多个器官的脂质蓄积,但对LDL-C、HDL等血脂水平没有显著影响[7]。与仅敲除ABCA1或ABCG1相比,在ApoE-/-小鼠中同时敲除ABCA1和ABCG1,主动脉病变发展速度明显加快,主动脉斑块面积显著上升[8]。这些研究结果说明,ABCA1和ABCG1在胆固醇外排中发挥着重要的协同作用,增强ABCA1和ABCG1的表达是缓解泡沫细胞生成的有效策略[6]

    银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract, GBE)作为一种预防和治疗心血管疾病的药物受到广泛关注。研究报道,GBE具有多种黄酮类和萜类成分如银杏内酯A、银杏内酯B、槲皮素等[9],具有抗炎、抗氧化和改善肠道菌群结构等多重药理作用,有助于改善AS[10]。前人研究发现,GBE可以抑制oxLDL诱导的内皮细胞分泌黏附因子,减少AS的内皮炎症,同时GBE可以通过抑制血管内皮生长因子减少巨噬细胞来源的泡沫细胞生成[11]。在平滑肌细胞来源的泡沫细胞中,GBE能减少胆固醇摄取,增强胆固醇外排[12]。然而,GBE是否能通过调节脂质稳态缓解巨噬细胞来源泡沫细胞生成,目前尚不清楚。

    因此,本研究首先利用高脂饮食诱导ApoE-/-小鼠建立AS动物模型考察GBE对小鼠主动脉斑块面积和血脂水平的影响;其次使用多种公共数据库联合分析GBE改善AS的潜在机制;最后采用oxLDL诱导THP-1细胞建立体外泡沫细胞模型探讨GBE治疗AS是否与增强PPARγ表达,促进胆固醇外排,减少泡沫细胞生成有关。本研究通过网络药理学技术联合体内体外药效验证和机制探索,寻找GBE发挥抗AS作用的可能机制,为GBE的临床适应证的拓展提供理论依据。

    银杏叶提取物(GBE, 万邦德制药集团有限公司);阿托伐他汀钙片(美国辉瑞制药有限公司);TP26302050型高脂饲料(南通特洛菲有限公司, 脂肪42%, 蛋白质15%, 碳水化合物42.5%,胆固醇含量0.5%);TP 26332型对照饲料(南通特洛菲有限公司, 脂肪10%, 蛋白质14%, 碳水化合物76%,胆固醇含量0%);小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);白介素-1β (IL-1β)、白介素-6 (IL-6)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α) ELISA检测试剂盒(杭州联科生物科技有限公司);佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA,美国MCE公司);氧化低密度脂蛋白(oxLDL)、荧光氧化低密度脂蛋白(Dil-oxLDL)(广州奕元生物科技有限公司);CCK-8检测试剂盒(杭州孚德生物科技有限公司);PCR逆转录扩增试剂盒(江苏愚公生命生物科技有限公司);PPARγ抗体(亲科生物科技有限公司)。

    超速控温离心机(美国Beckman Coulter公司);多功能酶标仪(美国BioTek公司);倒置荧光显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司);逆转录仪、Western blot系统(美国Bio-Rad公司);实时定量荧光PCR仪(美国Life Technologies公司);多功能成像仪(美国Sappire公司);生物安全柜(新加坡Esco公司)。

    人急性白血病单核细胞(THP-1,购自ATCC);ApoE-/-小鼠(雄性,20只,8周龄)和C57BL/6J小鼠(雄性,5只,8周龄)购自南京集萃药康生物科技有限公司。所有动物试验程序经江苏省中医药科学院动物研究伦理委员会批准,许可号: AEWC-20220401-200。

    将C57BL/6J小鼠与ApoE-/-小鼠以普通饲料适应性喂养1周后,5只C57BL/6J小鼠继续以TP 26332型对照饲料喂养;20只ApoE-/-小鼠按体重随机分为4组(模型组,银杏叶提取物低剂量组GBE-L组,银杏叶提取物高剂量组GBE-H组,阿托伐他汀组ATO组),每组给予TP 26302050高脂饲料喂养。模型组灌胃0.5% CMC-Na溶液;GBE-L组与GBE-H组每日分别灌胃50、150 mg/kg GBE(溶于0.5% CMC-Na溶液);阿托伐他汀组每日灌胃10 mg/kg ATO(溶于0.5% CMC-Na溶液),连续给药9周。实验终点时,对小鼠采取腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.1 mL/10 g)的麻醉剂,待翻正反射消失后,采集小鼠的血液,收集心脏与主动脉并用4%多聚甲醛固定。

    使用添加10% FBS的RPMI-1640培养基培养THP-1细胞,培养环境为37 ℃,5% CO2。根据实验需求接种在对应的细胞培养板中,并加入100 ng/mL PMA,诱导分化24 h后,进行后续实验。

    对诱导成功的THP-1来源巨噬细胞按照以下分组进行给药:正常对照组,模型组(80 μg/mL oxLDL),银杏叶提取物低剂量组(GBE-L组,80 μg/mL oxLDL+20 μg/mL GBE),银杏叶提取物高剂量组(GBE-H组,80 μg/mL oxLDL+60 μg/mL GBE),阿托伐他汀组(ATO组,80 μg/mL oxLDL+1 μmol/L ATO)。给药24 h后,进行后续试验检测。

    按照试剂盒说明书所述检测“2.1”项血清样本进行血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)的水平。

    按照ELISA试剂盒说明书所述检测“2.1”项血清样本中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

    取固定的心脏组织使用梯度脱水法对样本进行脱水包埋,并切成5 μm厚度的切片,将切片放入二甲苯中脱蜡处理15 min后,放入无水乙醇中孵育10 min,完全洗脱二甲苯,按照95%、85%、70%乙醇梯度分别洗脱5 min,放入纯水中浸泡。按照H&E染色试剂盒所述,进行H&E染色。染色结束后,使用中性树胶封片并风干,放在显微镜下观察并拍照。

    取心脏主动脉切片,按照Masson三色染色试剂盒所述,进行Masson染色。染色结束后,使用中性树胶封片并风干,放在显微镜下观察并拍照。

    取固定的心脏组织,使用15%~30%梯度蔗糖溶液脱水后,加入OCT包埋剂并放入盛有液氮的容器中,液氮气化沸腾20 s后取出心脏,使用冰冻切片机切成8 μm的切片。待切片恢复室温后,加入油红O工作液染色10 min。染色完成后放入60%异丙醇透化10 s,再放入纯水中浸染20 s,最后使用苏木素染液对细胞核进行染色。染色结束后,滴加甘油-明胶封片,放于显微镜下观察并拍照。

    取处于对数生长期的THP-1细胞,以70%的密度接种于96孔板中,每组设置3个复孔,并按照0、10、20、30、40、50、60、80、100、150 μg/mL的GBE质量浓度梯度处理细胞24 h,处理结束后向每孔加入CCK-8溶液10 μL ,放入细胞培养箱中孵育1.5 h,孵育结束后将96孔板置酶标仪中,检测波长450 nm,检测吸光度,计算相对细胞活力。

    按照油红O染色试剂盒所述,取油红O母液1.5 mL,加入双蒸水1 mL进行混合,得到油红O工作液,室温静置10 min后进行油红O染色。染色完成后,在吸水纸上弃去染料,每孔加入60%异丙醇200 μL透化5~10 s,加入蒸馏水清洗30 s,吸水纸吸去蒸馏水,重新加入蒸馏水放到显微镜下拍照观察。

    将完成给药处理的细胞样本,使用Trizol-氯仿-异丙醇法提取RNA,测定浓度后,按照逆转录试剂盒所述配制反应体系,即每孔中加入RNA 1000 ng,逆转录预混液4 μL, dsDNase 1 μL,最后加入无核酶水至20 μL。充分混匀后放入逆转录仪中,进行逆转录实验。反应结束后,进行qPCR扩增实验。

    按照Taq SYBR Green mix 10 μL,正向引物0.4 μL,反向引物0.4 μL,cDNA 2 μL,无核酶水7.2 μL配制反应体,按照试剂盒所述方法所示进行qPCR仪程序设置。反应结束后导出CT,使用$2^{\text{-}\Delta\Delta{\mathrm{Ct}}} $方法计算各基因表达情况。各基因引物序列见表1所示。

    Table  1.  Primer sequences used for quantitative real-time PCR
    GeneSpeciesForwardReverse
    SR-A1HumanAAAGAAGAACAAGCGCACGTGGGAGCACCAGGTGGACCAGTTTG
    CD36HumanTCCTATTGGCCAAGCTATTGCGCACGGGGATTCCTTTAAGGTCG
    ABCA1HumanCGTTTCCGGGAAGTGTCCTAGCTAGAGATGACAAGGAGGATGGA
    ABCG1HumanGGGAAGTTGATAAAGGATGTGATTCGGGCTATGTATGG
    GAPDHHumanGGAGCGAGATCCCTCCAAAATGGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
    PPARγHumanGGAAGACCACTCGCATTCCTTGTAATCAGCAACCATTGGGTCA
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    使用中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP数据库 (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索银杏叶中有效成分 (以OB≥30%、DL≥0.18为条件进行筛选)。使用Swiss Target Prediction对所筛选成分作用靶点进行预测(http://www.swisstargetprediction.ch/),以probability≥0.1为条件将得到的所有靶点进行整合去重,使用Uniprot数据库 (https://beta.uniprot.org/)将所得靶点蛋白名称转换为相对应基因名。

    使用DisGeNET网站(https://www.disgenet.org/, Score≥中位数0.02)、GeneCards数据库 (https://www.genecards.org,score ≥中位数1.44)、OMIM数据库 (https://omim.org,选择approved symbol)筛选疾病靶点,并进行整合去重。

    使用Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)对疾病和活性成分的作用靶点进行Venny图绘制,所得交集即为活性成分与疾病共同靶点。使用String数据库 (https://cn.string-db.org)对共同靶点进行蛋白互作分析,并将结果导出至Cytoscape 3.9.0软件中,使用Analyze Network绘制GBE治疗AS的核心靶点筛选,并使用CytoNCA绘制蛋白互作图。

    将“药物活性成分-靶基因” 共同作用靶点导入David数据库(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)中,进行KEGG和GO富集分析,并将结果按照P大小排列后,每组选取P最小的10个进行图像可视化处理,以气泡图和柱状图绘制KEGG和GO富集分析图。

    将完成给药处理的细胞样本,使用RIPA裂解法提取蛋白并使用BCA法进行蛋白浓度定量,放入沸水浴加热煮沸5 min,使蛋白质充分变性。使用10% SDS-PAGE蛋白凝胶电泳对蛋白分离孵育对应一抗后进行检测。

    取心脏主动脉切片,进行免疫荧光实验。按照抗原修复、封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAPI染色的步骤进行免疫荧光实验,最后将细胞爬片放置于载玻片上用甘油进行封片后放于荧光显微镜下观察并拍照。

    数据采用GraphPad Prism 10.0软件进行单因素方差分析并进行制图。数据以$ \bar{x}\pm s $表示,P < 0.05与P < 0.01表示差异具有统计学意义。

    为探讨GBE能否改善小鼠AS进展,使用HFD喂养ApoE-/-小鼠,灌胃给药GBE-L [50 mg/(kg·d)]和GBE-H [150 mg/(kg·d)] 9周。结果表明,与对照组相比,模型组小鼠主动脉出现明显主动脉斑块和脂质蓄积,灌胃给予GBE可以显著缓解小鼠主动脉中斑块面积和脂质蓄积水平(图1-A)。血脂异常是诱发AS的重要风险因素[13]。因此,检测了小鼠血清内的脂质水平。结果显示,与模型组相比,GBE-L组和GBE-H组的小鼠TC、TG、LDL-C水平显著下降,HDL-C水平显著上升(图1-B)。进一步的油红O、H&E和Masson染色结果显示,与对照组相比,模型组内脂质蓄积面积明显增加,坏死核心的数量和面积亦显著上升。给予GBE治疗后,小鼠主动脉根部坏死核心的面积和脂质沉积水平均显著降低(图1-C)。这些结果说明,GBE能减少ApoE-/-小鼠主动脉脂质蓄积,有效延缓AS病变的发展。

    Figure  1.  Ginkgo biloba extract (GBE) attenuates atherosclerosis in ApoE-/- mice
    A: Gross oil red O staining of aortas from C57BL/6J or ApoE-/- mice fed with WD or HFD for 9 weeks; B: Serum total cholesterol(TC), total triglycerides(TG), low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C) and high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C) level ($ \bar{x} \pm s $, n = 5); C: Representative images of oil red O, H&E, Masson staining of aortic root sections ($ \bar{x} \pm s $, n = 3).ATO: Atorvastatin #P <0.05, ##P<0.01 vs control group; *P <0.05, **P<0.01 vs model group

    炎症的产生是诱发AS的另一个重要的独立风险因素[14],因此使用ELISA试剂盒检测了ApoE-/-小鼠血清炎症水平。结果发现,与模型组相比, GBE-L组和GBE-H组小鼠血清炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α(图2)。这些结果说明,GBE可以减缓ApoE-/-小鼠血清炎症。

    Figure  2.  Effect of GBE on the expression level of serum inflammation (IL-1β, IL-6, TNF-α) in ApoE-/- mice ($ \bar{x} \pm s $, n = 5)
    #P <0.05, ##P<0.01 vs control group; *P <0.05, **P<0.01 vs model group

    为探究GBE改善AS的可能靶点,使用TCMSP数据库以OB≥30% DL≥0.18的条件,对GBE成分进行筛选,共筛选到27个有效成分(图3-A)。使用Swiss Target Prediction数据库对27个成分的靶点进行预测选取probability ≥0.1并去重后得到621个化合物可能的靶点。使用GeneCards数据库(score ≥中位数1.44)、OMIM数据库(选择approved symbol)和DisGeNET数据库(score ≥中位数0.02)对AS靶点进行筛选,得到疾病靶点1660个。使用Venny图将共同靶点取交集后共得到276个疾病-化合物共有靶点(图3-B)。使用Cytoscape 3.9.0对共有靶点进行分析,以寻找核心靶点。结果显示,Betweenness值为243,Closeness unDir值为0.001963963,Degree unDir值为50.38686131,找到核心靶点55个、1198个连接。其中IL-6、TNF、ALB、AKT1、IL-1β、PPARγ是银杏叶提取物抑制AS的关键靶点(图3-C)。

    Figure  3.  Pharmacological screening of GBE-AS network
    A: List of active ingredients for pharmacological screening of GBE-AS networks; B: Venny figure; C: PPI protein interaction

    为探究GBE治疗AS可能机制,使用DAVID数据库对3.3中获得的276个药物与疾病共有靶点进行GO功能富集分析。结果显示,276个靶点共获得1 842个条目,其中BP条目1143个,CC条目112个,MF条目226个。生物过程集中于胆固醇稳态、炎症反应和胆固醇代谢相关中;细胞成分集中于细胞外空间、胞外域和等离子膜中;分子功能主要集中于: 酶结合、RNA转录因子活性和蛋白质结合中(图4-A)。同时,将276个药物与疾病共有靶点进行KEGG分析。结果显示,KEGG共富集180个条目,去P值排名前20绘制气泡图(图4-B),主要通路有脂质与AS、剪切应力与AS、PPAR通路和胆固醇代谢等。富集分析结果表明,GBE可能可以通过维持胆固醇稳态和缓解炎症改善AS,机制可能与PPAR通路有关。

    Figure  4.  Pharmacological analysis of the GBE-AS network
    A:GO enrichment analysis;B:KEGG enrichment analysis

    泡沫细胞的形成AS进展的重要标志,抑制泡沫细胞的形成是缓解AS的有效策略。GO和KEGG富集分析发现,GBE与胆固醇稳态息息相关,而泡沫细胞的生成是胆固醇摄取过度而外排不足引起胆固醇稳态被破坏导致的。首先向THP-1细胞中加入100 ng/mL PMA,诱导分化24 h形成巨噬细胞后,使用不同浓度的GBE刺激THP-1源巨噬细胞,结果发现150 μg/mL以下浓度对细胞活力并未见显著影响(图5-A),后胞实验使用20 和60 μg/mL作为细胞给药的低、高剂量。对THP-1源巨噬细胞进行油红O染色结果表明,GBE处理泡沫细胞24 h后可以显著降低胞内脂质蓄积,抑制oxLDL诱导的泡沫细胞的生成。这一结果与胞内胆固醇酯、甘油三酯水平检测结果相一致(图5-B,图5-C)。为了进一步确认GBE对泡沫细胞生成的影响,使用Dil (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)荧光标记的oxLDL与药物共同孵育6 h。结果显示,Dil-oxLDL孵育后Model组荧光强度较高,表明有大量泡沫细胞生成,与模型组相比,GBE可以显著降低细胞的荧光强度,减少泡沫细胞的生成(图5-D)。以上结果说明,GBE可以减少泡沫细胞的生成,缓解胞内脂质蓄积。

    Figure  5.  GBE attenuates lipid accumulation and the formation of foam cells in THP-1
    A: Viability of THP-1 after treating with different concentrations of GBE was detected by the CCK-8 assay; B: THP-1 cells were stained with oil red O after exposing with oxLDL after treating by GBE (20 and 60 μg/mL) or ATO (1 μmol/L) for 24 h ($ \bar{x} \pm s $,n = 3); C: Comparison of THP-1 cells TC and TG ($ \bar{x} \pm s $,n = 5); D: Fluorescent images for macrophage lipid uptake in THP-1. THP-1 was stained with Dil-oxLDL (30 μg/mL) after treating by GBE (20 and 60 μg/mL) or ATO (1 μmol/L) for 6 h, respectively ($ \bar{x} \pm s $, n = 3) #P <0.05, ##P<0.01 vs control group; *P <0.05, **P<0.01 vs model group

    在泡沫细胞形成过程中,胆固醇摄取和排出的不平衡是泡沫细胞内脂质蓄积的主要原因。因此,通过RT-qPCR检测了THP-1细胞胆固醇摄取和外排的受体膜蛋白的表达。结果表明GBE可以显著减少SR-A1 mRNA水平,升高ABCA1ABCG1的mRNA水平,而对CD36的mRNA水平没有显著影响(图6-A)。

    Figure  6.  GBE improves cholesterol uptake and efflux in foam cells by enhancing PPARγ expression ($ \bar{x} \pm s $, n = 3)
    A: Relative mRNA expression of macrophage cholesterol uptake (CD36, SRA1) and efflux (ABCA1, ABCG1) in THP-1; B-C: Relative mRNA and protein expression of PPARγ in THP-1; D: Relative protein expression of PPARγ by immunofluorescent in THP-1SR-A1: Macrophage scavenger receptor class A1;CD36: Cluster of differentiation 36;ABCA1: ATP-binding cassette transporter A1;ABCG1: ATP binding cassette subfamily G member 1;PPARγ: Peroxisome proliferator activated receptor gamma#P <0.05, ##P<0.01 vs control group; *P <0.05, **P<0.01 vs model group

    KEGG富集分析发现,GBE的可能作用机制与PPAR通路相关,而Cytoscape筛选的核心靶点中,PPARγ是排名较前的核心靶点,同时PPARγ的上调被认为可以显著增强胆固醇外排,减少泡沫细胞的生成[15]。因此检测了GBE对PPARγ影响。结果显示,GBE可以显著升高PPARγ的mRNA和蛋白水平(图6-B和图6-C),同时免疫荧光发现,GBE可以显著增强PPARγ的表达(图6-D)。

    以上结果说明,GBE可能可以通过增强PPARγ加速胆固醇外排抑制泡沫细胞的生成。

    泡沫细胞的形成是AS的特征性病理标志,抑制泡沫细胞形成可有效缓解AS[16]。本研究结果表明,GBE可降低ApoE-/-小鼠体内血脂水平和血清炎症因子分泌,减少主动脉斑块形成;机制探究发现,GBE可以通过增强PPARγ的表达,促进ABCA1/ABCG1的表达,增加胆固醇流出,减少泡沫细胞的生成。

    血脂异常是AS的重要危险因素,血脂通常包括TC、TG、LDL-C和HDL-C。LDL-C是与AS发病机制最相关的一种脂蛋白,在内皮损伤部位,LDL-C进入内皮下空间形成oxLDL是驱动AS发生发展的关键。临床研究发现,血浆LDL-C浓度与ASCVD事件发生风险呈对数线性正相关,将LDL-C水平控制在1.8 mmol/L 以下,AS斑块进展可以得到实质性减缓,LDL-C水平控制在1.4 mmol/L 以下,心血管死亡风险降低22%[17-18]。另一种脂蛋白HDL-C可以将过多的胆固醇运输到肝脏并降解,减轻血管的脂质蓄积,起到血管保护作用,临床研究表明HDL-C浓度与心血管疾病风险呈负相关[19]。本实验研究发现,GBE可以改善血脂水平,特别是降低LDL-C水平,升高HDL-C水平。

    目前,由于AS的发病机制复杂,预防或治疗AS的治疗药物仍然有限。近年来,研究人员发现,增加胆固醇外排是一个具有良好潜力的治疗方向[4]。ABCG1和ABCA1是AS斑块中胆固醇外排和RCT的关键受体。体外实验发现,ABCG1和ABCG1介导的胆固醇外排占巨噬细胞来源的泡沫细胞总胆固醇外排的70%[6]。ABCA1促进胆固醇外排至载脂蛋白ApoA-I,而ABCG1促进胆固醇外排至HDL。研究发现,ABCA1在人体中发生基因突变引起功能丧失会导致早期严重AS即丹吉尔病,患者表现为HDL水平极低且多脏器中有大量脂质斑块生成[20]。同时,巨噬细胞中ABCG1和ABCA1的特异性缺失可加速ApoE-/-小鼠AS进程,缺乏ABCG1和ABCA1的ApoE-/-小鼠在心肌、肝、肺、胸腺、脾等多个组织中积累了炎性泡沫细胞[21]。本实验研究结果表明,GBE可以显著上调ABCA1、ABCG1的表达,增加胆固醇外排。

    过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)家族是核受体超家族的一员,脂质异常中发挥着重要的作用。许多研究表明在泡沫细胞中,PPARγ的激活可以上调肝X受体α进而增加ABCA1的表达。同时,在泡沫细胞中敲除PPARγ会同时引起ABCA1、ABCG1的表达降低,减少胆固醇外排[22]。PPARγ被认为是一种营养敏感信号传感器,敲除PPARγ会引起脂肪酸、脂代谢紊乱和胰岛素抵抗,进一步加速AS的进展[15]。通过KEGG对GBE可能的作用通路进行富集,PPARs通路是富集程度较高的通路信号之一,令人欣喜的是,GO功能富集显示,GBE在胆固醇稳态、脂代谢和胆固醇外流中发挥着重要的作用。本实验结果也说明,GBE在可以通过上调PPARγ增加胆固醇外流,减少泡沫细胞的生成。

    炎症作为另一个独立危险因素,其重要性逐渐受到人们的广泛关注[23]。前人研究发现,在给予PCSK9单抗控制血脂后,心血管事件在2年内复发概率高达9.3%。在传统降脂类药物治疗后这种持续的心血管风险被称为“剩余风险”。临床研究已经表明这种增加的风险主要是由于炎症[24]。在临床试验中,IL-1β抑制剂卡纳单抗[25]和低剂量秋水仙碱[26]通过抑制促炎信号的传导,在不降低血脂水平的情况下,可以显著降低主要不良心血管事件和紧急血运重建概率[27]。然而,目前抗炎类药物仍存在着诸多不足,例如,秋水仙碱会引起较为普遍的胃肠道反应,长期服用会引起肌肉、周围神经病变等不良反应[28]。而卡纳单抗抑制IL-1β表达的同时会损害机体免疫反应,产生免疫抑制作用,与安慰剂组相比, 卡纳单抗治疗组致死性感染相关事件发生率有所增高[29]。因此,寻找新的抗炎药物缓解血管炎症是未来治疗AS的重要方向。GBE是银杏叶经过乙醇提取干燥后得到的提取物,2020版本《中华人民共和国药典》规定其有效黄酮苷类成分应≥24%、萜类内酯成分应≥6%,总银杏酸小于0.0005%,临床广泛用于治疗急慢性脑机能不全和眼、耳部血流或神经障碍[30]。体内毒理学实验发现,在大鼠体内给药4000 mg/kg GBE 30 d未见明显毒副作用,GBE的LD50高达13429 mg/kg,具有高效低毒的特性[12]。同时,在多种疾病中GBE展现出良好的抗炎活性,例如,GBE可以通过抑制心肌细胞NF-κB通路,减少IL-1β、TNF-α等炎症因子的分泌,缓解心肌缺血再灌注的损伤[31]。在AS中,GBE可以通过减少VCAM-1、ICAM-1的分泌,减少主动脉的血管炎症[32-33]。本实验研究结果表明,给药GBE可以显著缓解AS小鼠的血管炎症。因此,将GBE作为新的抗炎类药物开发,具有良好的治疗潜力。

    综上,GBE可以显著改善ApoE-/-小鼠的AS,这一作用可能是通过上调PPARγ 增加ABCA1/ABCG1介导的胆固醇外排导致的,为GBE的临床适应证的拓展提供理论依据。

  • Figure  1.   Ginkgo biloba extract (GBE) attenuates atherosclerosis in ApoE-/- mice

    A: Gross oil red O staining of aortas from C57BL/6J or ApoE-/- mice fed with WD or HFD for 9 weeks; B: Serum total cholesterol(TC), total triglycerides(TG), low-density lipoprotein cholesterol(LDL-C) and high-density lipoprotein cholesterol(HDL-C) level ($ \bar{x} \pm s $, n = 5); C: Representative images of oil red O, H&E, Masson staining of aortic root sections ($ \bar{x} \pm s $, n = 3).ATO: Atorvastatin #P <0.05, ##P<0.01 vs control group; *P <0.05, **P<0.01 vs model group

    Figure  2.   Effect of GBE on the expression level of serum inflammation (IL-1β, IL-6, TNF-α) in ApoE-/- mice ($ \bar{x} \pm s $, n = 5)

    #P <0.05, ##P<0.01 vs control group; *P <0.05, **P<0.01 vs model group

    Figure  3.   Pharmacological screening of GBE-AS network

    A: List of active ingredients for pharmacological screening of GBE-AS networks; B: Venny figure; C: PPI protein interaction

    Figure  4.   Pharmacological analysis of the GBE-AS network

    A:GO enrichment analysis;B:KEGG enrichment analysis

    Figure  5.   GBE attenuates lipid accumulation and the formation of foam cells in THP-1

    A: Viability of THP-1 after treating with different concentrations of GBE was detected by the CCK-8 assay; B: THP-1 cells were stained with oil red O after exposing with oxLDL after treating by GBE (20 and 60 μg/mL) or ATO (1 μmol/L) for 24 h ($ \bar{x} \pm s $,n = 3); C: Comparison of THP-1 cells TC and TG ($ \bar{x} \pm s $,n = 5); D: Fluorescent images for macrophage lipid uptake in THP-1. THP-1 was stained with Dil-oxLDL (30 μg/mL) after treating by GBE (20 and 60 μg/mL) or ATO (1 μmol/L) for 6 h, respectively ($ \bar{x} \pm s $, n = 3) #P <0.05, ##P<0.01 vs control group; *P <0.05, **P<0.01 vs model group

    Figure  6.   GBE improves cholesterol uptake and efflux in foam cells by enhancing PPARγ expression ($ \bar{x} \pm s $, n = 3)

    A: Relative mRNA expression of macrophage cholesterol uptake (CD36, SRA1) and efflux (ABCA1, ABCG1) in THP-1; B-C: Relative mRNA and protein expression of PPARγ in THP-1; D: Relative protein expression of PPARγ by immunofluorescent in THP-1SR-A1: Macrophage scavenger receptor class A1;CD36: Cluster of differentiation 36;ABCA1: ATP-binding cassette transporter A1;ABCG1: ATP binding cassette subfamily G member 1;PPARγ: Peroxisome proliferator activated receptor gamma#P <0.05, ##P<0.01 vs control group; *P <0.05, **P<0.01 vs model group

    Table  1   Primer sequences used for quantitative real-time PCR

    GeneSpeciesForwardReverse
    SR-A1HumanAAAGAAGAACAAGCGCACGTGGGAGCACCAGGTGGACCAGTTTG
    CD36HumanTCCTATTGGCCAAGCTATTGCGCACGGGGATTCCTTTAAGGTCG
    ABCA1HumanCGTTTCCGGGAAGTGTCCTAGCTAGAGATGACAAGGAGGATGGA
    ABCG1HumanGGGAAGTTGATAAAGGATGTGATTCGGGCTATGTATGG
    GAPDHHumanGGAGCGAGATCCCTCCAAAATGGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
    PPARγHumanGGAAGACCACTCGCATTCCTTGTAATCAGCAACCATTGGGTCA
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  • 收稿日期:  2024-03-22
  • 刊出日期:  2025-04-24

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