Analysis of xenobiotics in colon and immune tissues of ulcerative colitis mice after administration of Sini San by LC-MS
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摘要:
免疫反应失调是目前公认的溃疡性结肠炎（UC）重要病理因素之一。本文在确证四逆散能显著改善葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的UC小鼠结肠炎症的基础上，采用高效液相色谱-离子阱飞行时间质谱（HPLC-IT-TOF-MS）技术系统研究了UC小鼠结肠及肠系膜淋巴结、脾脏、胸腺等免疫组织中的四逆散药源性成分。研究结果表明，除结肠外，四逆散中部分成分及其代谢物可分布于免疫组织，关联分析四逆散组成药味质量标准中指标性成分的含量限度，发现相对低丰度、弱响应成分如柴胡皂苷a、芍药苷、甘草酸等成分的质量具有向结肠和淋巴器官高效传递的特征，集中暴露在上述器官，极有可能是四逆散抗UC的药效物质来源。本研究的发现为后续确证成分组合物的药效并开展其改善UC 的分子机制研究奠定了基础，也为四逆散临床合理应用提供科学依据，有望促进其中成药的二次开发。
Abstract:Dysregulation of immune response is currently recognized as one of the important pathological factors in ulcerative colitis (UC). Based on the confirmation that the Sini San (SNS) can significantly improve the colon inflammation induced by dextran sulfate sodium sulfate (DSS) in mice, the present work systematically studied the xenobiotics in the colon and mesenteric lymph nodes, spleen, and thymus of UC mice after administration of SNS by high-performance liquid chromatography-ion trap time-of-flight mass spectrometry (HPLC-IT-TOF-MS). The results showed that, in addition to the colon, some components and their metabolites in SNS could be distributed in immune tissues, and it was found that the quality of relatively low-abundance and weakly responsive components such as saikosaponin a, paeoniflorin, and glycyrrhizic acid had the characteristics of efficient transmission to the colon and lymphoid organs. These components were very likely to be the source of pharmacodynamic substances of SNS. The findings of this study lay a foundation for the study of the efficacy and molecular mechanism of the components against ulcerative colitis, and also provide a scientific basis for the rational clinical application of SNS, which is expected to promote the secondary development of its preparations.
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Keywords:
- Sini San /
- ulcerative colitis /
- colon /
- immune tissues /
- drug-derived components
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溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）是一种发生在结直肠的慢性炎症性肠病，肠道免疫系统的功能失调是UC发病的重要潜在因素之一[1]。UC在中医学中并没有与之相对应的病名，但根据其临床特点，与中医古籍中记载的“赤沃”“久痢”“肠澼”“泄泻”“便血”等疾病表现相似。四逆散（Sini San，SNS）由柴胡（Bupleuri Radix，BR）、白芍（Paeoniae Radix Alba，PRA）、甘草（Glycyrrhizae Radix et Rhizoma，GRR）、枳壳（Aurantii Fructus，AF）四味药材组成，能通过调和肝脾，透邪解郁，有效地缓解“腹中痛”“泻痢下重”等症状。痛泻要方合四逆散已被世界中医药学会联合会消化系统疾病专业委员会列为治疗UC肝郁脾虚证的强推荐方剂[2]。
研究中药在疾病状态下的靶部位暴露成分与临床更相关，对于揭示中药药效物质也更具意义和价值。本研究在证实四逆散能显著改善葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的UC小鼠结肠炎症的基础上，采用高效液相色谱-离子阱飞行时间质谱（HPLC-IT-TOF-MS）技术系统研究了UC小鼠结肠及肠系膜淋巴结、脾脏、胸腺等免疫组织中的四逆散药源性成分，为进一步聚焦和揭示其药效物质基础和作用机制奠定基础。
1. 材 料
1.1 药品与试剂
四逆散中成药（国药准字Z20063142，9 g/袋，江西青峰药业有限公司）。实验所使用的对照品购自成都乐美天医药科技有限公司。葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS，相对分子质量40 kD，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。甲醇、乙腈（色谱级，德国Merck公司）；甲酸（色谱级，美国Sigma公司）；超纯水，由Milli-Q 超纯水系统制得。其他试剂均为市售标准试剂。
1.2 仪 器
LC-20AB高效液相色谱仪，IT-TOF-MS（日本岛津公司）。
1.3 动 物
8周龄的SPF级雄性C57BL/6J小鼠(20~25 g)购自浙江维通利华实验动物技术有限公司[生产许可证号：SCXK(浙)2019-0001]，给予标准饲料和超纯水，在12 h光照/12 h黑暗、温度25 ℃、湿度为(50±5)%的条件下适应性饲养1周后进行实验。动物实验获得中国药科大学动物伦理委员会许可。
2. 方 法
2.1 动物造模与取材
造模前，将小鼠按照体重随机分组分笼：对照组（Ctrl）和四逆散对照组（SNS）每组8只，模型组（DSS）、四逆散治疗组（DSS+SNS）和5-氨基水杨酸（5-ASA）治疗组（DSS+5-ASA）每组10只。DSS组、DSS+SNS组、DSS+5-ASA组小鼠自由饮用3% DSS造模剂复制溃疡性结肠炎模型，Ctrl组和SNS组自由饮用蒸馏水。从第1天开始分别给小鼠灌胃蒸馏水、SNS（每日6 g/kg）或5-ASA（每日100 mg/kg），每天分2次灌胃，连续给药10 d。给药剂量依据临床用药量和预试验结果确定。每日记录小鼠饮水量和进食量。在造模终点（第10天），将小鼠用异氟醚麻醉后，剖开腹腔，摘取盲肠至直肠段，精确测量长度，用预冷的生理盐水冲洗干净；摘取肝、脾、肠系膜淋巴结和胸腺后洗净称重；然后剪大于5 mm的结肠肠段和肝组织投入4%多聚甲醛中进行固定。将所有剩下的组织迅速投入液氮中，后转移至−80 ℃超低温冰箱备后续分析。
2.2 药效学评价
采用疾病活动指数（disease activity index, DAI）、结肠长度、病理切片、炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）表达、紧密连接蛋白（occludin）表达、氧化应激[还原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)]等多个指标全面评价四逆散缓解UC作用。
2.3 色谱条件
色谱柱Waters® XBridge C18 (2.1 mm×150 mm，3.5 μm)；柱温40 ℃；流动相A相0.1%甲酸水、B相0.1%甲酸乙腈，流速0.3 mL/min。洗脱程序：0~30 min，10%~38% B；30~50 min，38%~46% B；50~60 min，46%~100% B；60~65 min，100% B；65~70 min，10% B。进样量：5 μL。
2.4 质谱条件
电喷雾离子源（ESI），界面电压（interface voltage），正离子模式下+4.5 kV，负离子模式下−3.5 kV；喷雾气流速1.5 L/min；曲线脱溶剂管（curve desolvation line, CDL）加热部件温度200 ℃；干燥气气压100 kPa；检测电压1.85 kV；离子累积时间15 ms；MS1和MS2质量扫描范围（m/z）：100~
1200 。2.5 对照品溶液的配制
分别取对照品约1 mg，精密称定，用甲醇溶解并稀释制成质量浓度为1.0 mg/mL的对照品储备液，于−20 ℃保存。实验前用甲醇逐级稀释成相应浓度的对照品工作液。
2.6 供试品溶液的配制
分别取模型组和给药组小鼠的结肠、脾、肠系膜淋巴结以及胸腺组织约100 mg，剪碎并混合均匀，加入预冷的水-甲醇（20∶80）1.0 mL匀浆，氮吹浓缩至150 μL，离心10 min，吸取上清液作为供试品溶液。各组小鼠每种类型的组织样本平行制备5份供试品溶液。
2.7 数据处理
采用IBM SPSS Statistics 26软件进行统计分析，各组数据之间的比较采取单因素方差分析（One-Way analysis of variance）分析结合Tukey事后比较的检验方式；采用Graphpad Prism等软件作图，结果以$\bar{x} $±s表示；采用Image J软件进行免疫印迹条带的灰度分析。
采用LCMS solution工作站（Ver3），岛津 Profiling Solution（Ver 1.1） 及Composition Formulate Predictor 软件进行质谱数据处理。
3. 结 果
3.1 四逆散显著改善DSS诱导的UC小鼠结肠炎症
DSS诱导的炎症性肠病类似UC，该方法造模简便、特异性高、重复性好，持续时间较长，广泛应用于UC相关研究。本研究采用该方法复制急性结肠炎小鼠模型，采用临床常用的5-ASA为阳性对照，评估四逆散的治疗效果，同时单独设立四逆散对照组，评估其安全性。
实验结果（图1）表明，四逆散可显著改善DSS诱导的UC小鼠体重减轻和肠黏膜屏障破坏，降低疾病活跃指数 (DAI) 评分和溃疡指数，增加结肠长度，显著降低结肠组织IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA表达，显著增加GSH含量，提高SOD活力，并抑制MDA升高，且四逆散对 DSS 诱导的实验性结肠炎的保护作用优于5-ASA。
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Figure 1. Sini San (SNS) alleviates the symptoms and colonic inflammation in dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitisA: Daily changes in body weight; B: Disease activity index (DAI); C: Lengths of colons; D: Representative images of hematoxylin and eosin (HE)-stained colon tissue (upper: 40× magnification; lower: 200× magnification); E−G: mRNA expression of inflammatory cytokines (IL-6, IL-1β, TNF-α) were detected by RT-PCR; H: Expression of tight junction protein occludin was detected by Western blot; I−K: Important indexes of oxidative stress (SOD, GSH, MDA) in the colon were detected by kits ($\bar{x} \pm s $,n=8−10 unless otherwise specified) *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs control group，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001 vs DSS group3.2 UC小鼠结肠及免疫组织中四逆散药源性成分的LC-MS分析
3.2.1 定性分析策略
为了探究四逆散改善UC的潜在药效物质，基于UPLC-ESI-IT/TOF-MS技术，首先利用非目标代谢组学数据分析方法识别UC小鼠结肠及免疫组织中四逆散原型成分及其代谢产物，比较空白溶剂、模型组和给药组各组织样本的提取离子流图进一步确证所识别的药源性成分；然后在Manual模式下采集上述成分的二级质谱信息，基于课题组前期建立的四逆散体内外成分数据库，结合药源性成分的色谱保留时间、精确相对分子质量、特征碎片离子、特征中性丢失等信息，对其进行定性分析。部分成分经与对照品比对进行确认。图2以柚皮素-4′-O-葡萄糖醛酸苷的定性分析为例展示了黄酮苷元Ⅱ相结合物的定性解析过程。
3.2.2 UC小鼠结肠中的四逆散药源性成分
基于“3.2.1”项定性分析策略，在UC小鼠结肠中共定性分析出37种四逆散药源性成分（具体信息如补充材料中表1所示）。这些原型成分及其代谢物主要源自甘草、枳壳（图3），包括甘草次酸-O-葡萄糖醛酸苷（C43）、甘草香豆素（C39）、羽扇豆异黄酮 (C42)、皂皮酸( C44) 、甘草次酸(C46)、柚皮苷（C17）、新橙皮苷（C18），柚皮素（C25）、橙皮素（C26）；源自柴胡和白芍的化学成分相对较少，源自柴胡的原型成分包括6''-O-乙酰柴胡皂苷E（C29）和柴胡皂苷a（C36），无代谢物检出；源自白芍的成分包括芍药内酯苷（C4）、芍药苷亚硫酸酯（C5）、芍药苷（C6）、没食子酰芍药苷（C13）和芍药二酮（C38），无代谢物检出。
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Figure 3. Extraction ion chromatograms and structures of Bupleuri Radix (BR,A), Paeoniae Radix Alba (PRA,B), Glycyrrhizae Radix et Rhizoma(GRR, C), and Aurantii Fructus(AF,D) -derived components in colon3.2.3 UC小鼠免疫组织中的四逆散药源性成分
脾脏、肠系膜淋巴结和胸腺中检出的药源性成分数量分别为3、4和4（图4）。实验结果表明，四逆散中来源于甘草的甘草酸及其代谢产物在所检测的3种免疫组织中暴露程度最高，其中，在肠系膜淋巴结中检出羟基甘草次酸-O-葡萄糖醛酸苷（C33）、甘草酸（C35）、甘草次酸-O-葡萄糖醛酸苷（C43）；在脾脏中检出甘草次酸（C46）和甘草苷-4'-O-硫酸结合物（C2）；在胸腺中检出还原型甘草酸（C45）。此外，在肠系膜淋巴结、脾脏和胸腺中分别检测到柚皮素-4′-O-葡萄糖醛酸苷（C14）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（C1）和甲基橙皮苷（C19），提示上述成分可能是枳壳在体内发挥免疫调节作用的潜在药效物质。胸腺中还检测到来源于白芍的两种化学成分，即7,2'-二羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷-7-O-葡萄糖苷（C7）和2-O-甲基邻苯三酚-1-O-葡萄糖醛酸苷（C31）。
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Figure 4. Extraction ion chromatograms and structures of the SNS-derived components in spleen (A), mesenteric lymph nodes (B)， and thymus (C)4. 讨 论
四逆散出自张仲景所著《伤寒论》,痛泻要方合四逆散已被世界中医药学会联合会消化系统疾病专业委员会列为治疗UC肝郁脾虚证的强推荐方剂[2]。现代药理研究证实四逆散能显著改善实验性结肠炎模型小鼠的肠道炎症[3−5]。本研究也发现四逆散可显著改善UC小鼠的多项病理指标，且疗效优于轻中度UC一线治疗用药5-ASA。
虽然UC的病因尚不清楚，但免疫反应失调是目前公认的重要病理因素之一[1]。UC患者肠道黏膜发生异常免疫反应激活，接受APC抗原呈递活化增殖的肠系膜淋巴结、脾脏中CD4+T细胞可经淋巴液进入血液循环，进而影响机体多个组织器官；胸腺是人体免疫特别是细胞免疫的重要器官，是T细胞分化成熟的场所，在溃疡性结肠炎的发病机制中起重要作用[6]。由此可见，肠系膜淋巴结、脾脏和胸腺均是免疫反应的主要参与者。基于此，本研究重点关注UC小鼠结肠及上述免疫组织中四逆散药源性成分。
四逆散中成药由柴胡、白芍、枳壳和甘草四味药材等量配比制得。《中华人民共和国药典》（2020年版）一部上述四味药材的质量标准中，规定按干燥品计算，柴胡中含柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的总量不得少于0.30%；白芍中含芍药苷不得少于1.6%；枳壳中含柚皮苷不得少于4.0%，新橙皮苷不得少于3.0%；甘草中含甘草苷不得少于0.50%，甘草酸不得少于2.0%。由于四逆散中各药材化学成分在含量、结构、样品前处理提取效率和在ESI离子源中离子化效率方面均存在差异，因此，如果考虑这些成分在药材-四逆散-结肠组织暴露水平的质量传递效率，则柴胡皂苷a（C36）和芍药苷（C6）在四逆散改善UC小鼠结肠炎症中的作用更值得进一步关注和研究。四逆散药源性成分在免疫组织中的分布也非常有特点。其中，甘草酸及其代谢产物在免疫组织中普遍暴露，源自枳壳的柚皮素-4′-O-葡萄糖醛酸苷（C14）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（C1）和甲基橙皮苷（C19）分别暴露在肠系膜淋巴结、脾脏和胸腺中。
经文献调研，发现本研究中聚焦的UC小鼠结肠及免疫组织中四逆散药源性成分可发挥多种免疫调节作用。Chen等[7]报道，柴胡皂苷a可减弱C57BL/6 小鼠甲型流感病毒 H1N1 PR8 模型中的病毒复制，并显著抑制感染小鼠支气管肺泡灌洗液 （BAL）中的中性粒细胞和单核细胞的募集，以及IFN-γ、TNF-α和IL-6的产生。Zhang等[8]发现芍药苷促进了口腔扁平苔藓病变来源的间充质干细胞（OLP-MSCs）的增殖、迁移和多向分化。OLP-MSCs经芍药苷预处理后，对外周血单个核细胞的抑制作用增强，且能降低共培养体系中Th1细胞因子水平并增加Th2细胞因子水平，过继转移后还改变了接受皮肤同种异体移植的小鼠血清中的 Th1/Th2 平衡，延长了皮肤移植物的存活时间并改善了炎症浸润。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs)家族可通过降解基底膜及紧密连接等成分而破坏血-脑脊液屏障，近年来研究发现MMP-9参与多种中枢神经系统免疫性疾病的疾病进程，并与疾病的严重程度与预后等相关。Zhu等[9]研究发现芍药苷显著抑制BV2 细胞和糖尿病小鼠MMP-9 活化和炎症反应。甘草酸 （GL） 和甘草次酸 （GA）是甘草的关键成分，抗炎和免疫调节是其重要的药理活性。GL 和 GA 的抗炎机制是通过IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和IL-17等细胞因子实现的。它们还调节抗炎机制，如细胞间黏附分子1 和P-选择素，酶如诱导型一氧化氮合酶 （iNOS），以及转录因子，如NF-κB、信号转导和转录激活因子（STAT）-3和STAT-6。GA能够抑制Toll样受体以及高迁移率族蛋白1（HMGB1）[10]。柚皮素的免疫调节作用也受到广泛关注，Li等[11]报道柚皮素能有效抑制脂多糖诱导的树突状细胞的成熟，口服柚皮素可改善关节炎的严重程度，降低Ⅱ型抗胶原（CII）IgG的水平并限制T细胞的增殖，显著抑制CII 再刺激后脾脏中 Th1 和 Th17 细胞比例。
方剂的疗效通常取决于其中多种活性物质的协同作用，“君臣佐使”的配伍原则恰恰体现了这种协同作用的整体观念，抗急性早幼粒细胞白血病中药复方黄黛片的研究作为典型例证[12]，在分子水平上阐明了中药复方协同增效的作用机制及中医药传统理论的科学内涵。然而，方剂药效物质基础不明确是阐明其作用机制的瓶颈问题。近年来研究四逆散改善UC药效物质及作用机制的相关文献中[3−5]，化学成分的体外定性或定量表征虽与作用机制研究并行，但并未关联研究以揭示与作用机制密切相关的药效物质。本研究结果充分说明四逆散改善UC药效是多成分协同作用的结果。因此，有理由认为在结肠炎症部位和淋巴器官中集中暴露的成分群极有可能是四逆散抗UC的药效物质来源。基于本部分研究发现，后续将通过与原方的比较研究，确证成分组合物的药效并开展其改善UC 的分子机制研究，为四逆散临床合理应用提供科学依据，促进其中成药的二次开发。
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Figure 1. Sini San (SNS) alleviates the symptoms and colonic inflammation in dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis
A: Daily changes in body weight; B: Disease activity index (DAI); C: Lengths of colons; D: Representative images of hematoxylin and eosin (HE)-stained colon tissue (upper: 40× magnification; lower: 200× magnification); E−G: mRNA expression of inflammatory cytokines (IL-6, IL-1β, TNF-α) were detected by RT-PCR; H: Expression of tight junction protein occludin was detected by Western blot; I−K: Important indexes of oxidative stress (SOD, GSH, MDA) in the colon were detected by kits ($\bar{x} \pm s $,n=8−10 unless otherwise specified) *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 vs control group，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001 vs DSS group
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Figure 3. Extraction ion chromatograms and structures of Bupleuri Radix (BR,A), Paeoniae Radix Alba (PRA,B), Glycyrrhizae Radix et Rhizoma(GRR, C), and Aurantii Fructus(AF,D) -derived components in colon
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