Establishment and validation of the determination method for the related substances in carbetocin injection
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摘要:
建立一种HPLC分析方法用于卡贝缩宫素注射液中有关物质的测定。采用Waters Xbridge C18色谱柱(150 mm×3 mm,3.5 μm),0.30 mg/mL乙酸铵-19%乙腈水溶液为流动相A,流动相A-乙腈(1∶1)为流动相B,检测波长为220 nm,在60 ℃的柱温下,以0.8 mL/min的流速进行梯度洗脱。对该方法的系统适用性、专属性、线性及范围、准确度等进行了验证,结果表明卡贝缩宫素注射液的9个杂质在各自浓度范围内与峰面积呈现良好的线性关系(R2>0.999),该方法的精密度良好(RSD<5%)。本法适用于同时检测卡贝缩宫素注射液中药物及其9个杂质,可为该制剂的质量控制提供理论依据。
Abstract:An HPLC analytical method was developed to determine the related substances in carbetocin injection. The method was performed on a Waters Xbridge C18 column (150 mm×3 mm, 3.5 μm) with 0.30 mg/mL ammonium acetate-19% acetonitrile aqueous solution as mobile phase A and mobile phase A-acetonitrile (1∶1) as mobile phase B. The detection wavelength was 220 nm. Gradient elution was performed at the flow rate of 0.8 mL/min and the column temperature of 60℃. The method was validated for system applicability, specificity, linearity and range, accuracy, with the results that the 9 impurities of carbetocin injection showed good linearity (R²>0.999) with peak area in their respective concentration range, and that the method had good precision (RSD<5%). This method is suitable for the simultaneous determination of carbetocin and its 9 impurities in carbetocin injection and can provide a theoretical basis for the quality control of the carbetocin injection.
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透明质酸(hyaluronic acid, HA)是由N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetyl-glucosamine, GlcNAc)和D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid, GlcUA)通过β-1,4糖苷键交替连接而成的高分子线性糖胺聚糖。HA在生理条件下荷高负电,具高极性、可高度水合等聚电解质特性[1]。当HA的主链基团或分子量增长至一定数值,HA因分子内和分子间形成的大量氢键而呈现线团状。因此,HA具有黏弹性和剪切稀化等流变学特征[2]。除了具有良好的理化性质,HA还具有生物相容和可降解性、分化簇44(cluster of differentiation 44, CD44)靶向性、炎症调节等独特的生物学特性。因此,HA是医药研发领域的重要原材料。
然而,HA的分子内和分子间氢键易受体液稀释、蛋白、盐等复杂成分的影响。因此,未化学改性的HA经注射后难以形成稳定的凝胶[3]。此外,人类基因组含有6种透明质酸酶(hyaluronidase, HAase)。HAase通过切割GlcNAc和GlcUA之间的β-1,4糖苷键降解HA[4]。大多数组织中的主要HAase为透明质酸氨基葡糖苷酶1(hyaluronoglucosaminidase 1, HYAL-1)和透明质酸氨基葡糖苷酶2(hyaluronoglucosaminidase 2, HYAL-2)。虽然,已有文献表明HAase对HA的特异性降解作用可被用于构建基于HA骨架的、病灶靶向的尺寸可变型或触发释药型药物传递系统[5]。但是,由于血清含有大量HYAL-1,静脉注射的HA可被HYAL-1快速清除。可见HA的医药应用受限于机体的生理复杂性。
化学改性可调控HA的理化性质、增强其功能性,从而拓展其医药应用范围。但化学改性在改变HA理化性质的同时,亦可能影响其生物学特性。本综述结合HA生物学性质的产生机制、以及其衍生化方法和表征手段总结并讨论化学改性对HA生物学性质的影响,为合理的HA化学改性研究提供参考。
1. HA的生物学特性
与在高尔基体内合成的其他蛋白聚糖和糖胺聚糖不同,HA是由真核生物质膜内表面上的透明质酸合成酶(hyaluronan synthase, HAS)催化合成[6]。HAS以尿苷二磷酸-葡糖醛酸和尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖为原料,在细胞质内膜连续合成HA,并通过跨膜通道将新生HA挤出至胞外基质[7]。HAS1和HAS2具中等活性,负责合成高分子量透明质酸(high molecular weight hyaluronic acid, HMWHA); HAS3蛋白则具有最高活性,负责合成低分子量透明质酸(low molecular weight hyaluronic acid, LMWHA)。HMWHA和LMWHA的分子量分别大于100 kD及介于10~100 kD;而小于25个双糖单元的HA则被称为透明质酸寡糖(hyaluronan oligosaccharides, oHA)[7]。不同分子量的HA表现出截然不同的生物学特性。
1.1 受体靶向性
CD44是由单一基因编码、不同亚型表达的受体蛋白。不同亚型CD44的N端均具有两个透明质酸结合结构域(hyaluronic acid binding domain, HABD)[8]:Link结构域和BX7B基序(B代表赖氨酸或精氨酸,X7代表任意非酸性氨基酸)[9]。HA的羧基与HABD的至少两个丙氨酸残基(Ala102,Ala103)相互作用,伯羟基则与HABD的至少一个酪氨酸残基(Tyr109)相互作用[10−11]。因此,“HA-CD44”特异性结合力随HA分子量的增大而增强。CD44识别HA所介导的胞吞作用也高度依赖HA的分子量,分子量小的HA更容易被细胞内化[12−13]。虽然CD44介导HA内吞的具体机制尚未被完全解析,但是现有研究已证明脂筏参与了该内吞过程:HA结合CD44并激活脂筏相关功能,从而驱动能量依赖性的细胞膜穴样内陷[14]。HA分子量造成的内化效率差异可能与膜内陷的难易程度相关[15]。
不同分子量的HA靶向结合CD44后,可以通过不同信号通路对肿瘤起到不同的药理作用。HMWHA和oHA可抑制肿瘤生长和转移,LMWHA则加速肿瘤恶化。具体而言,HMWHA与细胞膜表面的CD44结合并导致CD44聚集,从而激活肿瘤抑制性Hippo通路以调节细胞增殖和凋亡。相反,LMWHA结合CD44并竞争性抑制“HMWHA-CD44”介导的部分缺陷1b蛋白(partitioning-defective 1b, PAR1b)募集,造成HMWHA对Hippo信号通路的激活作用被抑制。oHA则结合CD44并抑制PI3K/Akt细胞存活通路,减少磷酸化Akt对B细胞淋巴瘤-2相关死亡促进因子(B-cell lymphoma-2-associated death promoter, BAD)、叉头转录因子(forkhead transcription factor, FKHR)等的抑制作用,有效诱导肿瘤细胞凋亡[16]。
HA还可主动靶向透明质酸介导的运动受体(receptor for hyaluronan mediated motility, RHAMM)、Toll样受体2(Toll-like receptors 2, TLR2)、TLR4、淋巴管内皮透明质酸受体1(lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1, LYVE-1)、透明质酸内吞受体(hyaluronan receptor for endocytosis, HARE)和Layilin蛋白(LAYN)[9],参与多项细胞信号的传导。LYVE-1和HARE通过Link结构域结合HA[17−18]。缺乏Link结构域的RHAMM、TLR2和TLR4则通过两个规范BX7B基序与HA结合[19−21]。LAYN不仅不含Link结构域,而且含有两个可阻碍其结合HA的非规范BX7B基序。然而,LAYN仍能特异性结合HA,只是具体的结合机制尚不明晰[22−23]。
本文仅总结并讨论HA的化学改性对机制相对清晰且应用相对广泛的“HA-CD44”靶向性的影响。
1.2 炎症调节特性
HMWHA限制炎症细胞的趋化、吞噬作用以及炎症介质和裂解酶的自由运动,具抗炎特性,可促进伤口愈合[24];而LMWHA促进单核细胞转变为巨噬细胞,提高胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1, IGF-1)和白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)的分泌水平,起促炎作用。基于HMWHA良好的黏弹性和炎症抑制能力,临床已使用关节腔注射型Hyalgan®(500~730 kD)治疗骨关节炎[25−26]。但需指出的是,HA基于分子量发生促炎、抗炎性质转变的机制尚不明确。
1.3 酶解特性
HYAL-1常见于血清、组织基质和溶酶体,可降解各种分子量的HA。HYAL-1的最适pH为3~4.5。因此,HYAL-1在溶酶体内活性最强,在pH大于4.5时其酶活力为最大效力的50%~80%。HYAL-2主要锚定于质膜表面富含CD44的脂筏区域。HYAL-2仅在低pH条件下具有酶活力,其最适pH为4[4]。HMWHA结合脂筏区域的CD44并激活Na+-H+交换蛋白,从而形成胞外局部酸性环境。随后,HYAL-2被激活并降解HMWHA至20 kD左右的分子片段。HA片段被CD44介导内吞,并于溶酶体内被HYAL-1降解为四糖。四糖最终被β-葡萄糖醛酸酶和β-N-乙酰葡萄糖胺酶降解为单糖[13,15]。
2. 不同修饰位点的化学改性和结构确证方法
HA富含羟基、羧基、酰胺基等官能团,可通过酰胺化、酯化、开环、交联等原理进行化学改性,从而制备功能化HA衍生物以扩大其应用范围[27]。HA不同修饰位点的化学改性结构式见图1。
2.1 羧基位点
酰胺化和酯化是最常见的HA羧基化学改性方式。例如,将疏水性抗肿瘤药紫杉醇(paclitaxel, PTX)的羟基与HA羧基偶联,形成两亲性高分子以提高PTX的水溶性和靶向性[28];酰肼类等双端氨基化合物可用作交联剂,基于酰胺反应促使HA形成分子内或分子间交联。Seprafilm®可吸收防粘连薄膜(隔膜)是由HA羧基和羧甲基纤维素发生酯化交联而成;Monovisc®则是由HA羧基和6-位伯羟基发生分子内酯化交联而形成的水凝胶,用于关节腔注射以缓解关节炎疼痛。此外,HA还能以四丁基铵盐的形式与烷基卤化物、甲苯磺酸酯等物质通过烷基化反应生成酯键[29]。
2.2 羟基位点
HA的6-位羟基通常与羧基类、烷基琥珀酸酐或甲基丙烯酸酐等酸酐类、酰氯等物质发生酯化反应。同时,HA的分子内交联反应同样可在6-位羟基上进行。例如,交联剂二乙烯基砜(divinyl sulfone, DVS)在室温下可与HA的6-位羟基快速反应以形成HA凝胶,且交联度可由HA的分子量和浓度、反应pH、HA/DVS质量比来控制[27]。Juvéderm® ULTRA是以1,4-丁二醇二缩水甘油醚(1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE)高度交联HA而形成的均质凝胶,适用于面部真皮组织中层至深层注射,以纠正中度鼻唇沟皱纹;Juvéderm® VOLIFT和Juvéderm® VOLUMA则利用BDDE交联长链和短链HA,适用于面部深层注射,因其平衡弹性和内聚力的范围更大而塑形效果更佳。
2.3 酰胺基位点
乙酰氨基经脱乙酰化可被还原为游离氨基,从而实现HA的相关衍生化。但基于硫酸肼的HA脱乙酰化反应通常需在55 ℃下进行,可使分子链严重断裂。因此,该法不属于HA的常见化学改性方式[29]。
2.4 链端开环醛基位点
HA主链糖环和末端糖环亦可经开环反应产生醛基。醛基常与伯胺类化合物生成亚胺键,亚胺键可被进一步还原为胺[30]。该法常用于构建交联凝胶。然而,开环反应可显著改变HA的骨架结构,使其主链刚性减弱而更易降解。
2.5 结构确证
红外和紫外吸收光谱法、波谱法是初步确证HA是否成功改性的主要手段。例如,HA的羧基被酰胺化后,红外光谱
1560 cm−1处可见更强的酰胺Ⅱ键特征峰[31]。1H NMR则最常用于表征HA的特征氢峰(羧基氢或6-位伯羟基氢)以确认修饰位点的结构变化。此外,高分辨率13C NMR可用于区分HA的碳原子级数(伯、仲、叔和季),从而明确解析相应碳位的原子取代情况和结构的精细变化。但是,蛋白质、多糖等大分子的结构解析常受限于严重的谱峰重叠。二维核磁共振谱可将重叠的一维谱峰展开呈现于二维平面,从而显著提高峰归属辨析的准确率[32]。分子量检测法亦在高分子结构确证中起重要的辅助作用。研究人员通常利用体积排阻色谱法分离不同分子量的HA衍生物,再以多角度激光散射仪为检测器准确测定其绝对重均分子量及分布。散射仪的散射光强度和角度变化均与HA衍生物的分子量相关。
3. 化学改性对HA生物学性质的影响
HA分子量的多分散性和改性位点的不可控性促使HA衍生物的精确结构表征和构效关系研究难度剧增[9,33]。同时,研究人员对相关领域关注不足。因此,HA衍生物构效关系的科学研究体系尚未形成。本文从受体靶向性、生物可降解性、促炎或抗炎特性、免疫原性四方面总结并讨论现有研究中的化学改性对HA生物学性质的影响和相应的研究手段。
3.1 CD44靶向性
HA的羧基及伯羟基在CD44和HABD的靶向结合过程中起关键作用。同时,已有研究指出HA至少需6个连续双糖单元才能与HABD结合[34]。因此,羧基及伯羟基位点的过度修饰可显著削弱CD44对HA的特异性识别能力[9−10]。
目前最常用于表征HA衍生物CD44靶向性的策略是荧光标记技术。例如,使用FITC标记的HA衍生物和CD44蛋白共孵育,荧光定量“HA-CD44”结合物以量化HA衍生物与受体的靶向结合力[10];或将荧光探针标记的HA衍生物与过表达CD44受体的细胞共孵育,以荧光显微镜、流式细胞仪等定性或定量胞内荧光强度,从而间接评价其对CD44的靶向性。此外,分子对接研究和结合能计算法可用于HA衍生物与天然HA的CD44靶向性质差异的深入分析。有研究者采用SwissDock和AutoDock对接软件模拟CD44对HA的识别作用[35],通过比较对接能量值分析HA化学改性对结合能的影响。
Oh等[36]将己二酸二酰肼(adipic dihydrazide, ADH)与HA羧基进行偶联,合成修饰率分别为14%、22%、45%、70%的HA-ADH偶联物。结果表明,当羧基的取代度超过25%,HA衍生物的CD44主动靶向作用显著减弱。Kwon等[11]则将降冰片烯(norbornenes, Nor)或甲基丙烯酸酯(methacrylates, Me)以酰胺键或酯键形式修饰于HA的羧基或6-位伯羟基,相关位点的取代度约为10%、20%、40%。结果表明,无论是何种修饰方式和位点,CD44与HA的结合效率都随疏水基团增多而下降;且在羧基位点修饰Nor的衍生物组的结合效率下降最为显著。此外,相比于同取代度的6-位伯羟基Nor衍生化HA,6-位伯羟基Me衍生化HA因Me的疏水性更强而具有更为紧密的疏水核心,表面暴露更多羧基,从而具有更强的CD44靶向结合能力。
3.2 生物可降解性
研究者常使用HAase生物降解实验定量分析HA衍生物的酶解抗性:即在生理条件下将HA衍生物与HAase共孵育,随后通过表征HA衍生物基本理化性质或特性参数的方式,对比评价HA衍生物的酶解抗性。目前最常用的表征手段为凝胶渗透色谱法和重量/黏度测量法,其通过测定HA衍生物在酶解前后的重均分子量大小和分布、重量、黏度等的变化来判断酶解程度[37]。
以HA为骨架的抗肿瘤药物递送系统可被肿瘤组织高表达的HYAL-1和HYAL-2降解,存在药物在胞外过早泄漏的风险。同时,胞内HYAL-1和胞膜HYAL-2对于HA的降解作用具CD44依赖性。因此,HA靶向CD44的关键结合位点(羧酸、6-位伯羟基)亦与HAase的降解活性紧密相关[10]。此外,HA化学改性所引入的基团可造成空间位阻,从而限制HAase结合HA。综上,HA羧基或6-位伯羟基的化学改性可能使HA衍生物获得HAase酶解抗性。Schanté等[38]将HA与不同大小的氨基酸通过酰胺化反应结合,获得各种HA-氨基酸衍生物(HA-amino acid derivatives, HA-aa)。与天然HA相比,HA-aa的HAase抗性显著增强;且小分子氨基酸(丙氨酸、精氨酸)改性的HA-aa相较于大分子氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)改性的HA-aa酶解抗性低,证明改性基团位阻是影响HA衍生物抗酶解性的重要因素。然而,HA的过度改性,如对羧基进行全化学修饰,可导致HA衍生物不能被HAase降解。因此,HA衍生物的设计与制备需平衡其功能性和基于生物代谢的安全性。
3.3 促炎或抗炎特性
酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)常用于HA衍生物的促炎或抗炎特性研究。该法首先收集巨噬细胞与HA衍生物共孵育后的培养基,而后利用ELISA测定培养基内促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)和抗炎细胞因子(IL-10、IL-4)的浓度。体内抗炎实验是通过对小动物注射完全弗氏佐剂建立慢性炎症模型,而后对模型给以HA衍生物,最后以ELISA检测炎症相关因子的同时观测炎症组织的病理变化,综合评价HA衍生物的促炎或抗炎特性[39]。
现阶段HA及其衍生物促炎或抗炎特性的研究尚未深入到分子机制层面,仍仅是聚焦于HA及其衍生物的炎症调节功效:如联用HA与其他抗炎或促炎物质,实现炎症调节作用的增效;或利用HMWHA修饰具有机体炎症刺激特性的载体或物质,以减弱其炎症刺激性。目前亦缺乏相关研究深入探讨和揭示HA改性对其促炎/抗炎特性的影响和相关分子机制。
3.4 免疫原性
化学改性是否会改变HA的免疫原性亦是研究者应当关注的关键问题。免疫原性评价试验通常涉及细胞免疫和体液免疫的激活检测。淋巴细胞的增殖与分化是机体激活细胞免疫的重要过程。在HA衍生物被重复注入小鼠体内之后,取小鼠脾细胞进行体外培养,再采用Alamar Blue法测定T细胞和B细胞的增殖活力、及流式细胞术检测T、B、NK细胞亚群及比例,以综合表征HA衍生物激活机体细胞免疫的效力。体液免疫激活效力的评价通常采用ELISA测定血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA的浓度[40]。
化学改性造成的HA自然构象变化可能影响其免疫原性,刺激机体产生免疫应答,诱发强烈炎症反应从而造成机体损伤;激活的机体免疫亦可加速人体对HA递送系统的清除,从而限制其药效发挥[41]。但已报道的相关研究一般仅利用生物相容性HA对具免疫原性的生物活性物质进行理化修饰,以提高其体内应用的安全性;尚缺乏相关研究探讨和揭示HA改性对其免疫原性的影响和相关机制。
4. 总结与展望
综上所述,化学改性虽可调控HA的理化性质、增强HA的功能性,但亦可影响其生物学特性。HA功能化的相关研究目前仍较少关注HA衍生物生物学性质的科学表征、及衍生化影响HA生物学性质的具体规律和机制,而相关研究结果将对HA衍生物在医药领域应用的安全性和有效性起关键指导作用。
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Table 1 Results of degradation study
Test Condition Assay of API/% Recovery/% Acid 10 mol/L HCl for 2 h at 40℃ 91.97 100.23 Base 5 mol/L NaOH for 5 min(r.t.) 93.23 99.61 Oxidation 10% H2O2 for 20 min(r.t.) 90.03 99.23 Light ( 5000 ±500) lx for 9 d at 25℃99.52 102.73 Heat 60℃ for 9 d 99.02 102.81 Table 2 Results of linearity test
Compd. Regression equation of linearity R2 Linear range/(μg/mL) Imp1 y= 46213 x+15.3420.9999 0.0338 –1.6921 Imp2 y= 44862 x–78.5240.9999 0.0145 –0.7229 Imp3 y= 46632 x–1.7240.9999 0.0172 –0.8613 Imp4 y= 44852 x–117.090.9999 0.0349 –1.7455 Imp5 y= 46795 x+84.1660.9999 0.0146 –0.7290 Imp6 y= 47865 x–150.30.9999 0.0143 –0.7158 Imp7 y= 44998 x–206.240.9997 0.0148 –0.7392 Imp8 y= 54607 x–108.380.9999 0.0150 –0.7503 Imp9 y= 39031 x+14.8740.9999 0.1014 –0.7603 -
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