幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种微需氧的革兰氏阴性菌，定植在人和动物的胃中，形成慢性感染，是人类最常见的寄生细菌之一。Hp可导致多种上消化道疾病，如慢性胃炎、消化性溃疡病、胃黏膜相关的淋巴样组织淋巴瘤（MALT）和胃癌^[1]。全世界每年有70多万人死于胃癌^[2]，因此世界卫生组织建议考虑根除Hp以降低胃癌的风险^[3]。

目前，抗生素治疗是主要的Hp治疗方案，但存在耐药性、不利的胃酸环境、不良反应等问题^[4]。因此，发现和开发新的抗Hp药物变得越来越重要。研究表明，特异性抗体能有效抑制多种消化道病原体感染，在控制或治疗Hp感染方面也具有重要应用潜力^[5]，小型化、人源化和功能化是当前基因工程抗体药物的三大主要发展趋势。小分子抗体主要包括Fab抗体、单链抗体（ScFv）、超变区多肽（MRU）、单域抗体等^[6]。这些小分子抗体相较于传统抗体，具备亲和力高、相对分子质量小、稳定性强、渗透性强、易于制备等优势^[7]。其中，单域抗体通常仅含有VH或VL一个功能结构域，目前被认为是保持了良好抗原识别和亲和力的最小抗体单位^[8]，可以用作直接应对Hp等病原体和疾病进行靶向治疗的有力工具。

近年来，计算机人工智能（AI）辅助分析在药物研发中应用广泛^[9]。与传统改造方法相比，通过计算机AI辅助改造抗体将极大地节省时间和经济成本，能在短时间内高效获得改良后的突变体，并且能够更直观地分析抗体-抗原之间的作用关系。本研究首先应用Pymol、I-TASSER和ClussPro2等AI软件比较分析不同小分子抗体与Hp脲酶亚单位B（UreB）的分子间作用力，优选亲和力最佳的研究对象，然后构建其基因工程表达系统，明确其表达效率及生物活性，进而应用Alpha Flod2、mCSM-AB、OSPREY、FoldX等AI技术，对影响抗原-抗体复合物稳定性的关键位点进行分析并指导设计进化突变策略，再次构建系列突变体基因工程表达系统，通过对表达产物的分析比较，最终获得活性显著提升的进化突变体基因工程表达菌株，从而为抗Hp单域抗体的开发奠定良好的基础。

1.   材　料

1.1   主要试剂

微需氧产气袋（日本三菱公司）；幽门螺杆菌培养添加剂、幽门螺杆菌固体培养基（青岛海博生物技术有限公司）；酚红指示剂、二硫苏糖醇（DTT）、苯酚红试剂、尿素（北京索莱宝科技有限公司）；BamHⅠ限制性内切酶及XhoⅠ限制性内切酶（美国Thermo Scientific公司）；PCR引物和基因合成以及序列测序均由金唯智生物科技有限公司（苏州）完成。

1.2   仪　器

琼脂糖凝胶水平电泳槽（上海伯乐生命医学有限公司）、高速冷冻离心机（德国Hettich公司）、琼脂糖水平电泳仪（北京六一仪器厂）、UV-3200紫外可见分光光度（上海美谱达仪器有限公司）、PCR仪（美国Bio-Rad Laboratories公司）。

1.3   菌种和载体

大肠埃希菌（Escherichia coli）DH5α菌株、Rosetta (DE3)菌株以及pET28a、pE-SUMO等质粒均由本实验室保存。

2.   方　法

2.1   Hp脲酶的提取

从Hp培养物（4 ℃，6000 r/min，10 min）中收集菌体，用0.05 mol/L PBS缓冲液洗涤菌体两遍后，用0.05 mol/L PBS缓冲液及蛋白酶抑制剂混悬菌体，超声破碎菌体后4 ℃，8000 r/min，20 min，收集上清液，并透析24 h。

2.2   抗Hp脲酶单域抗体的AI辅助筛选

本研究首先结合文献及数据库调研^[10−11]，并从中分析获得了3条抗Hp脲酶的小分子抗体，分别为SCFV（GenBank序列号LC373564.1）、Fab片段（GenBank序列号LC373561.1）、VL全人源化单域抗体（GenBank序列号LC375193.1），利用ClussPro2软件进行UreB-抗体的对接预测，通过Pymol软件进行分子间作用力分析，氢键筛选范围≤3Å。

2.3   表达载体的构建

抗Hp UreB单域抗体（UreBAb）的序列，由苏州金唯智生物科技有限公司合成pUC57-UreBAb克隆载体，将目的片段PCR扩增后与pET28a、pE-SUMO质粒分别使用BamHⅠ、XhoⅠ于25 ℃双酶切2 h，电泳后回收，使用T4 DNA连接酶25 ℃连接1 h，转化进DH5α感受态，挑取转化子进行验证，将正确的菌株送测。设计合成引物如表1所示。

Table  1.  Primers used in plasmids construction

Primer	Primer sequence(5′→3′)	Purpose
pET28a-UreBAb-F	CGCGGATCCACCGATATTCAGATGACG	Used to amplify the target gene UreBAb
pET28a-UreBAb-R	CCGCTCGAGATGATGATGATGATGATGCGC
K43T-F	CAGCAGAAACCGGGCACCGCGCCGAAACTGCTGATTTATG	Mutation for K43T and K43M
K43M-F	CAGCTATCTGAACTGGTATCAGCAGATGCCGGGCAAAGCGCC
K43L-F	CAGCTATCTGAACTGGTATCAGCAGCTGCCGGGCAAAGCGCC
K43-R	CAGCAGTTTCGGCGCCGTGCCCGGTTTCTGCTGATACC
E82W-R	ATAGGTCGCAAAATCCCACGGCTGCAGGCTACTAATGGTCA	Mutation for E82W
E82W-F	AGTAGCCTGCAGCCGTGGGATTTTGCGACCTATTATTGTCAGCAGT
I107P-F	CTTTGGCCAAGGCACCAAAGTGGAACCGAAACGCGCGGCGGCG	Mutation for I107P, I107W, and I107F
I107W-F	GGCACCAAAGTGGAATGGAAACGCGCGGCGG
I107F-F	GGCACCAAAGTGGAATTTAAACGCGCGGCGG
I107-R	CGCCGCCGCGCGTTTAAATTCCACTTTGGTGCC
R109N-F	AAAGTGGAAATTAAAAACGCGGCGGCGCATCA	Mutation for R109N and R109P
R109P-F	AAAGTGGAAATTAAACCGGCGGCGGCGCATCA
R109-R	ATGATGCGCCGCCGCGCGTTTAATTTCCACTTTGGTGCCTTGGCC
Note: Underlined bases are enzyme cleavage sites, while bolded ones are protective bases

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.4   UreBAb的外源表达、纯化

把pET28a-UreBAb、pE-SUMO-UreBAb成功鉴定的重组菌培养4 h后，加入IPTG（终浓度为1 mmol/L），于20 ℃，200 r/min条件下进行诱导培养20 h。离心收集菌体，超声破碎，低温离心收集上清液，弃沉淀。取上清液，用60 mol/L咪唑进行Ni-NTA亲和色谱纯化目标蛋白。将纯化后的蛋白15% SDS-PAGE分析，并使用Bradford对蛋白定量。

2.5   免疫扩散实验

将1%的脲酶与琼脂糖混匀，浇注成板并在凝固后用牛津杯在平板上打孔，孔中分别加入UreBAb、SUMO-UreBAb 100 μL，于37 ℃下静止反应24~36 h，此时脲酶会向孔的四周扩散并与琼脂中的UreBAb、SUMO-UreBAb结合，形成白色沉淀环。

2.6   重组UreBAb对Hp脲酶活性抑制率的测定

将Hp尿酶50 μL和抗体50 μL混合，在96孔微量滴定板中于4 ℃过夜。然后向上述混合物中加入酚红指示剂100 μL，并在23 ℃培养3 h以上，在550 nm处测量显色，并计算抑制率。

2.7   AI辅助抗体进化突变分析与设计

利用Alpha fold2对UreBAb结构进行同源建模^[12]，评估后进行模拟蛋白对接，从PDB数据库获取抗原Hp脲酶6EHW的pdb文件，除去离子等干扰因素后，使用ClussPro2进行模拟对接。对突变位点的分析，为了尽可能避免漏掉关键氨基酸位点，本研究同时选择Interprosurf和Pymol两种方法来分析确定突变位点。进而，对重组单域抗体进行突变评估，通过3种鉴定方法（i-mutant、FlodX和mCMS-AB）^[13]，将筛选出的位点突变成其他19种氨基酸。

2.8   数据分析

用 GraphPad Prism5软件进行数据统计学分析，对两组样本采用Student’s t-test比较差异显著性，P<0.05被认为具有统计学意义。

3.   结　果

3.1   抗Hp脲酶小分子抗体的筛选及与脲酶（UreB）对接的构效关系分析

首先，利用Pymol、I-TASSER及ClussPro2等软件，对UreB与SCFV、Fab片段抗体、VL全人源化单域抗体等不同小分子抗体之间的分子间作用力进行分析。结果显示VL全人源化单域抗体与UreB间的相互作用力显著强于SCFV和Fab，其结构与PDB数据库中的6EHW结构模型的匹配评分最高（图1），因此，后续重点选择此抗体进行研究，为方便表述，在下面的研究中把该抗体命名为UreBAb。

Figure  1.  Three-dimensional docking prediction analysis of antibody and UreB (Pymol)

A: Prediction of docking between Fab and UreB; B: Prediction of docking between SCFV and UreB; C: Prediction of docking between engineered VL and UreB

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.2   抗Hp脲酶UreBAb基因工程重组菌株的构建及其表达与纯化

如图2-A和图2-B所示，在成功扩增目的基因UreBAb后，进一步构建了pE-SUMO-UreBAb、pET28a-UreBAb重组质粒，并通过测序确认了序列的准确性。由图2-C和图2-D可知，经过ITPG于20 ℃，200 r/min诱导15 h后，转入pE-SUMO-UreBAb、pET28a-UreBAb的重组大肠埃希菌Rosetta（DE3）均可检测到目的蛋白的表达，亲和色谱纯化后通过Quick Start Bradford蛋白定量，结果显示SUMO-UreBAb、UreBAb的重组蛋白产率分别为0.41和0.34 mg/mL。

Figure  2.  Agarose gel electrophoresis analysis of recombinant expression plasmid of UreBAb

A: PCR verification of the transformant（M: DNA 2000bp marker; 1: pE-SUMO-UreBAb; 2:pET28a-UreBAb）; B: Schematic diagram of plasmid pE-SUMO-UreBAb and pET28a-UreBAb; C: Total protein of recomninant E. coli carrying pE-SUMO-UreBAb and pET28a-UreBAb (20 ℃, 15 h)（M: Protein Marker; 1: pET28a; 2: pE-SUMO; 3-4: Different concentrations of pE-SUMO-UreBAb; 5: pET28a-UreBAb）; D: Purified SUMO-UreBAb and UreBAb（M: Protein Marker； 1-2: Purification of SUMO-UreBAb at different concentrations; 3: Purified UreBAb）

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.3   重组单域抗体与脲酶的亲和力及抑制活性分析

如图3-A和图3-B所示，基因工程表达产物SUMO-UreBAb、UreBAb与脲酶孵育后，均有白色沉淀环形成，证明重组抗体可以和脲酶抗原具有良好的亲和力。此外，为进一步证明抗体SUMO-UreBAb、UreAb对脲酶的抑制活性，分析了其对脲酶分解尿素能力的影响。由于脲酶能分解尿素产生碱，会造成pH的变化，这种变化可通过酚红试剂的颜色变化进行观测，并可以测定550 nm处吸收度变化进行定量分析。由图3-C可得出，重组SUMO-UreBAb、UreBAb可以有效地中和脲酶，使之活性降低。

Figure  3.  Affinity and activity analysis of recombinant SUMO-UreBAb and UreBAb with urease($\bar{x}\pm s $，n=3)

A: Affinity of recombinant SUMO-UreBAb with urease（1: PBS; 2-3: SUMO-UreBAb）; B: Affinity of r UreBAb with urease（1: PBS; 2: UreBAb）; C: Analysis of the effect of recombinant SUMO-UreBAb and UreBAb on urease activity

下载: 全尺寸图片 幻灯片

为了进一步比较SUMO-UreBAb、UreBAb的活性特点，将纯化后的产物与脲酶按1∶1的量分别在4 ℃、16 ℃、23 ℃、30 ℃孵育过夜，后加入尿素、酚红等反应6~10 h。结果如图4所示，重组SUMO-UreBAb和UreBAb在23 ℃抑制效率最高，分别为74.07%和51.27%。

Figure  4.  Inhibition rate of SUMO-UreBAb and UreBAb against urease antigen at different temperatures($\bar{x}\pm s $，n=3)

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.4   单域抗体分子动力学分析及其进化设计

为了进一步提升单域抗体的活性，应用AI工具对其进行了同源建模及分子动力学分析。首先，运用ClusPro2对抗体-抗原复合物进行对接，分析了其三维结构（图5-A）。在这个结构中，脲酶被灰色标识，抗体则以蓝色呈现。其中，红色部分代表了预测的对接位点，这些位点是通过Pymol及Interprosurf精确预测出的距离不超过5Å的氨基酸残基。其次，如图5-B所示，韦恩图中蓝色代表mCSM-AB、黄色代表FoldX、绿色代表i-mutant，三者交叉部分表示通过3轮不同计算后所共有的进化突变关键位点情况。这9个AI预测推荐突变体分别为K43L、K43T、K43M、E82W、I107P、I107W、I107F、R109P、R109N。

Figure  5.  Rational mutation of UreBAb based on AI analysis

A:Structure of antigen-antibody docking complex (the red part is the predicted binding site); B: Prediction sites of mCSM-AB, FoldX, and i-mutant

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.5   单域抗体突变体表达菌株的构建、重组表达及其活性分析

为了验证AI预测突变体的活性，本研究进一步构建了上述9种不同的突变体，PCR及测序结果均显示构建成功（图6）。

Figure  6.  PCR and sequencing analysis for UreBAb mutations

A: PCR analysis of mutation clones; B: Sequencing confirmation of the UreBAb mutants

下载: 全尺寸图片 幻灯片

转化获得重组表达菌株并经诱导表达后，9种突变体重组蛋白质均得到了良好的表达（图7-A）。进一步分析显示，9种重组单域抗体突变体与抗原的结合及抑制活性均得到了提高，其中最为显著的是107位点的异亮氨酸突变为色氨酸的突变体I107W，与原始抗体UreBAb相比，其结合活性提高了24.95%，达到了66.57%。

Figure  7.  Recombinant expression and activity analysis of mutated UreBAbs ($\bar{x}\pm s $，n=3)

A: SDS-PAGE analysis of recombinant wild-type UreBAb and 9 mutant UreBAbs （M: Protein Marker; 1:Blank Control;2-3:WT; 4: K43M; 5: K43L; 6: E82W; 7: I107P; 8: R109P; 9: R109N; 10: K43T; 11: I107W; 12: I107F）; B: Antigen (urease) inhibition rate of UreBAb and 9 mutants at 37 °C *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs UreBAb

下载: 全尺寸图片 幻灯片

4.   讨　论

Hp会导致严重的健康问题，抗体治疗可以有效避免传统抗生素治疗带来的危害，本研究中的单域抗体能特异性针对Hp的脲酶，脲酶作为Hp的关键酶，是其生存不可或缺的部分。它可以把体液中的尿素分解并产生大量的氨，来缓冲胞质和胞外的pH^[14−15]。这样一方面可以中和胃酸以保护自己免受杀灭，同时也使胃黏液细胞减少分泌黏液，造成黏液层变薄^[16]。

本研究结合AI分析，优选了抗Hp单域抗体，并构建了系列基因工程表达菌株。尽管SUMO标签可能有助于提高蛋白的溶解度和稳定性，但单点突变通常是为了研究特定氨基酸残基对蛋白质功能的影响。因此在后续单点突变的过程中，使用的不带标签的Ab可以确保任何观察到的功能变化都是由突变引起的，并且可以简化纯化过程，减少生产成本，避免潜在后续研究中产生免疫原性问题等。根据抗原抗体复合物三维结构进行的AI分析结果显示，I107位点位于UreAb的活性口袋，位点107与抗原的位点541Y之间存在氢键作用，经过重组表达及活性分析，也证实107位点的异亮氨酸突变为色氨酸后单域抗体对Hp的抑制率的确得到了显著的提升。究其原因，可能是因为异亮氨酸到色氨酸的突变增强了氢键作用，且引起了疏水性和结构上的差异变化。异亮氨酸通常具有较高的亲疏水性，而色氨酸的大芳香环状结构可能与脲酶形成更紧密的结合。此外，蛋白质结构变化也可能影响了抗体的功能性区域，使其更有效地与脲酶互相作用。

此外，大肠埃希菌虽然是目前最为成熟的基因工程表达体系，但其安全性依然存在不足，所表达的重组单域抗体必须进行分离纯化后方可应用。而Hp作为一种经口而入的胃内寄生性病原体，如能实现单域抗体的口服递送及病灶原位拮抗，将具有重要的意义。未来的研究中，本课题组将在进一步优化大肠埃希菌表达工艺的同时，构建益生菌等更安全、更便捷的重组表达系统，以探索抗Hp单域抗体的口服递送。