使用Chrome浏览器效果最佳，继续浏览，你可能不会看到最佳的展示效果，

确定继续浏览么?

复制成功，请在其他浏览器进行阅读

滇重楼地上部分化学成分研究

- ORCID：
陶俊杰
- ORCID：
杨杰
- ORCID：
闻晓东

中国药科大学中药学院，天然药物活性组分与药效国家重点实验室，南京 211198

中图分类号： R931.6

最近更新：2020-09-17

DOI：10.11665/j.issn.1000-5048.20200410

摘要

利用硅胶柱色谱、MCI柱色谱和制备高效液相色谱等技术对滇重楼地上部分的化学成分进行研究，结果从滇重楼地上部分90%乙醇提取物的正丁醇萃取部分中分离得到6个甾体皂苷类化合物，根据理化性质和波谱数据鉴定为26-O-β-D-glucopyranosyl-kryptogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L- rhamnopyranosy-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside(1), dioseptemloside G(2), polyphylloside III(3), chonglouoside SL-19(4), protodioscin(5), chonglouoside SL-5(6)。其中化合物1为新化合物，化合物2为首次从重楼属植物中分离得到。对以上化合物进行促血小板聚集活性以及细胞毒性评价，结果发现：6个化合物均未表现出明显的促血小板聚集作用；化合物2和4对于人结肠癌细胞HT29具有较强的细胞毒性。

关键词

滇重楼; 甾体皂苷; 分离鉴定; 血小板聚集; 细胞毒性

重楼是百合科(Liliaceae) 重楼属(Paris) 植物的总称，共有26个种及14个变种，广泛分布于欧亚大陆的热带至温带地区。我国分布有其中的20个种及数个变种，主要集中在西南各省区。重楼属植物药用历史悠久，早在《神农本草经》中就有记载，主治疔疮痈肿、蛇虫咬伤、跌扑伤痛等症^[

1–4]，是著名中成药云南白药、宫血宁胶囊的重要药物成分。现代药理研究表明，重楼所含有的甾体皂苷具有显著的止血作用^{[参考文献 5-6}5-6]。滇重楼（Paris polyphylla var. yunnanensis）是重楼药材的重要基源植物，各版药典均有收录，但由于长期掠夺式的采挖，缺乏保护，滇重楼的野生资源日益枯竭。与此同时，滇重楼每年都可再生的地上部分一直被认为是非药用部位而被丢弃。为了扩大滇重楼植物的药用资源，本研究对滇重楼地上部分的甾体皂苷类成分进行了研究，为充分利用重楼属植物资源提供科学依据。

从滇重楼地上部分90%乙醇提取物中共分离得到6个甾体皂苷类化合物，利用MS、IR、UV、1D以及2D NMR等波谱技术对其结构进行鉴定，分别为26-O-β-D-glucopyranosyl-kryptogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)- [α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside(1), dioseptemloside G(2), polyphylloside III(3), chonglouoside SL-19(4), protodioscin(5), chonglouoside SL-5(6)。其中化合物1为新化合物，化合物2为首次从重楼属植物中分离得到。对以上6个化合物进行促血小板聚集作用以及细胞毒性评价，结果发现：6个化合物均未表现出明显的促血小板聚集作用；化合物2、4对于结肠癌细胞HT29具有较强的细胞毒性。

1 材料

1.1　仪器与试剂

Tensor 27光谱仪、Bruker Avance DRX-500/600核磁共振光谱仪(德国Bruker公司)；Agilent 1100 series高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Alltech 2000 ES 蒸发光散射检测器(美国Alltech公司)；R-100旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；LBY-NJ4型血小板聚集仪(北京泰利康信公司)；Multiskan FC酶标仪、Forma 311 CO₂细胞培养箱(美国赛默飞世尔公司)； D101-大孔吸附树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；MCI-GEL精细分离填料(日本三菱化学公司)；ODS柱色谱填料(日本YMC公司)；薄层色谱硅胶板GF₂₅₄及柱色谱硅胶(青岛海洋化工有限公司)。

1.2　药材

滇重楼药材于2017年8月采自云南腾冲地区，由中国药科大学中药分析系王强教授鉴定为百合科(Liliaceae) 重楼属Paris 植物滇重楼Paris. polyphylla var. yunnanensis的地上部分。药材标本保存于中国药科大学中药分析系。

1.3　动物与细胞株

SPF级KM小鼠，雄性，体重(25±5) g，由南京青龙山动物繁殖中心提供，合格证号：SCXK(苏) 2017-0001。人结肠癌细胞株HT29(上海中科院细胞库)。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 提取与分离

滇重楼药材10 kg，用90%乙醇回流提取4次，合并滤液，减压浓缩回收乙醇，浓缩至3 L，用水饱和正丁醇液萃取4次，合并正丁醇液，减压回收正丁醇至干，得滇重楼地上部分正丁醇萃取部位。取该部位100 g进行D-101大孔树脂柱色谱分离(乙醇-水)，得到乙醇30%、50%、70%及90% 4个洗脱部位。70%和90%两个部位合并后进行硅胶柱色谱分离(二氯甲烷-甲醇20∶1→1∶1)，洗脱液根据薄层色谱(TLC)检测结果合并、浓缩，共得到9个洗脱部位: 1–9。取部位9(CM 3∶1)再进行硅胶柱色谱分离(二氯甲烷-甲醇，10∶1→1∶1)，共得到5个洗脱部位: 9-1–9-5，取部位9-4(CM 3∶1)进行MCI柱色谱分离(甲醇-水20%→100%)，收集甲醇30%、50%、70% 3个洗脱部位，3个部位再进一步经反相硅胶柱色谱反复分离(丙酮/甲醇-水)，最后经过制备HPLC纯化(乙腈-水)，其中30%部位得到化合物1(27 mg)、3(13 mg)、4(28 mg)，50%部位得到化合物5(42 mg)，70%部位得到化合物2(17 mg)、6(9 mg)。化合物1~6的结构式见图1。

Figure 1 Chemical structures of compounds 1–6

3 结构鉴定

化合物1 白色无定形粉末，HR-ESI-MS m/z 1 191.579 8[M-H]^－(Calcd. for C₅₇H₉₁O₂₆,1 191.573 3)，确定化合物1的分子式为C₅₇H₉₂O₂₆，不饱和度为12。[α] -254.1°(c 0.30, MeOH); UV(MeOH) λ_max 255(lg ε 3.22) nm; IR(KBr, ν): 3 420, 1 734, 1 040 cm^-1。¹³C NMR(C₅D₅N,150 MHz)共显示出57个碳原子信号，其中包括5组六碳糖单元信号和一组27个碳信号的苷元部分。结合¹H NMR(600 MHz, C₅D₅N)以及HSQC图谱分析发现，化合物1的苷元部分具有4个甲基结构[δ_H 0.71(3H, s), δ_C 13.7; δ_H 1.07(3H, d, J = 6.0 Hz), δ_C 16.5; δ_H 1.02(3H, d, J = 6.5 Hz), δ_C 18.3以及δ_H 1.07(3H, s), δ_C 20.2]，10个亚甲基结构，2个羰基碳原子 [δ_C 214.6; 219.2] 以及一对双键碳原子[δ_C 122.3, δ_H 5.32(1H, m), δ_C 141.7]。对比已知化合物anguivioside XV^[

7]苷元部分的波谱数据，确定化合物1的苷元为kryptogenin(3α, 26-dihydroxycholest-5-ene16, 22-dione)。在1D NMR以及HSQC谱中，可以观察到5个糖分子的端基碳信号及其对应的质子 [δ_H 4.92(1H, d, J = 6.2 Hz), δ_C 101.0; δ_H 6.39(1H, br.s), δ_C 102.9; δ_H 5.83(1H, br.s), δ_C 103.0; δ_H 6.28(1H, br.s), δ_C 103.9; δ_H 4.86(1H, d, J = 7.9 Hz), δ_C105.4]，以及位于高场区的3个糖链甲基碳及其对应的质子 [δ_H 1.60(1H, d, J = 5.8 Hz), δ_C 19.4; δ_H 1.60(1H, d, J = 5.6 Hz), δ_C 19.6以及δ_H 1.78(1H, d, J = 6.0 Hz), δ_C 19.2]，通过与已知化合物anguivioside XV糖链部分比较，推测化合物1的糖链由3分子L-鼠李糖及2分子D-葡萄糖构成，由葡萄糖分子端基氢的偶合常数确定葡萄糖分子端基碳的构型为β型，鼠李糖端基碳构型由其C-5的化学位移确定为α型^{[参考文献 8
百度学术}8]。HMBC谱中观察到 δ_H 6.28(Rha Ⅲ-H-1)与δ_C 81.0(Rha Ⅱ-C-4)、δ_H 5.83(Rha Ⅱ-H-1) 与 δ_C 78.3(Glc Ⅰ-C-4)、δ_H 6.39(Rha Ⅰ-H-1) 与 δ_C 78.9(Glc Ⅰ-C-2)、δ_H 4.92(Glc Ⅰ-H-1)与 δ_C 79.0(C-3)存在相关信号，说明Rha Ⅲ 连接在Rha Ⅱ 的4位，Rha Ⅱ 连接在Glc Ⅰ 的4位，Rha Ⅰ连接在Glc Ⅰ的2位，Glc Ⅰ连接在苷元的3位上；另外，δ_H 4.86(Glc Ⅱ-H-1)与δ_C 75.9(C-26)相关，表明Glc Ⅱ连接在苷元的26位碳原子上。

其他HMBC、HSQC以及¹H-¹H COSY谱图(图2)进一步证实了对化合物1的结构推测。综合上述分析，将化合物1的结构鉴定为26-O-β-D-glucopyranosyl-kryptogenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1-4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1-4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1-2)]-β-D-glucopyranoside。化合物1的 ¹H NMR和¹³C NMR波谱数据全归属见表1。

Figure 2 Key HMBC, ¹H-¹H COSY correlations of compound 1

Table 1 ¹H NMR(600 MHz, C₅D₅N) and ¹³C NMR(150 MHz, C₅D₅N) spectral data of compound 1(J in Hz)

No.	¹H NMR	¹³C NMR	No.	¹H NMR	¹³C NMR
1	0.99 m 1.72 m	38.0	4'	4.39 m	78.3
2	1.88 m 2.09 m	30.9	5'	3.65 m	77.6
3	3.90 m	79.0	6'	4.20 m 4.05 m	62.1
4	2.71 m 2.81 m	39.7	2'-O-a-L-Rha
5	-	141.7	1″	6.39 br.s	102.9
6	5.32 m	122.3	2″	4.87 m	72.4
7	1.51 m 1.75 m	32.7	3″	4.65 m	73.1
8	1.42 m	31.8	4″	4.35 m	74.5
9	1.00 m	50.8	5″	4.97 m	69.2
10	-	37.8	6″	1.60 d(5.8)	19.4
11	1.40 m 1.48 m	21.5	4″-O-a-L-Rha
12	1.37 m 1.88 m	39.5	1‴	5.83 br.s	103.0
13	-	42.5	2‴	4.51 m	73.5
14	1.39 m	51.9	3‴	4.56m	73.5
15	1.75 m 2.09 m	38.3	4‴	4.45 m	81.0
16	-	219.2	5‴	4.97 m	69.2
17	2.75 m	67.2	6‴	1.60 d(5.6)	19.6
18	0.71 s	13.7	4‴-O-a-L-Rha
19	1.07 s	20.2	1⁗	6.28 br.s	103.9
20	2.71 m 2.81 m	44.6	2⁗	4.92 m	72.5
21	1.07 d(6.0)	16.5	3⁗	4.55m	73.2
22	-	214.6	4⁗	4.30 m	73.9
23	2.81 m 2.95 m	40.9	5⁗	4.36 m	70.3
24	1.99 m 1.73 m	28.5	6⁗	1.78 d(6.0)	19.2
25	1.90 m	34.2	26-O-β-D-Glc
26	3.90 m 3.98 dd(9.2, 14.9)	75.9	1″‴	4.86 d(7.9)	105.4
27	1.02 d(6.5)	18.3	2″‴	3.60 m	74.7
3-O-β-D-Glc			3″‴	4.24 m	79.1
1'	4.92 d(6.2)	101.0	4″‴	4.21 m	71.1
2'	4.21 m	78.9	5″‴	3.97 m	79.0
3'	4.23 m	78.3	6″‴	4.55 m 4.38 m	63.5

化合物2 白色无定形粉末，ESI-MS(m/z) 907.4 [M+Na]⁺，分子式C₄₅H₇₂O₁₇。¹H NMR(C₅D₅N, 500 MHz) δ: 0.71(3H, d, J =5.5 Hz, CH₃-27), 0.90(3H, s, CH₃-18), 1.04(3H, s, CH₃-19), 1.18(3H, d, J = 7.0 Hz, CH₃-21), 1.65(3H, d, J = 6.0 Hz, CH₃-Rha I), 1.77(3H, d, J = 6.5 Hz, CH₃-Rha II), 4.99(1H, d, J = 7.2 Hz, Glc-H-1), 5.87(1H, br.s, Rha II-H-1), 6.40(1H,br.s, Rha I-H-l), 5.71(1H, br.s, H-6)；¹³C NMR(C₅D₅N, 125 MHz) δ: 37.78(C-1), 30.45(C-2), 78.37(C-3), 39.06(C-4), 141.92(C-5), 129.20(C-6), 73.03(C-7), 41.30(C-8), 49.11(C-9), 37.58(C-10), 21.70(C-11), 40.39(C-12), 41.46(C-13), 56.87(C-14), 35.69(C-15), 82.11(C-16), 63.03(C-17), 16.88(C-18), 19.32(C-19), 42.55(C-20), 15.58(C-21), 109.67(C-22), 32.25(C-23), 29.76(C-24), 31.11(C-25), 67.31(C-26), 17.79(C-27), Glc: 100.78(C-1′),78.37(C-2′), 78.37(C-3′), 79.11(C-4′), 77.40(C-5′), 61.78(C-6′), Rha I: 102.56(C-1″), 72.98(C-2″), 73.34(C-3″), 74.61(C-4″), 69.94(C-5″), 18.97(C-6″), Rha II: 103.39(C-1‴), 72.98(C-2‴),73.13(C-3‴),74.40(C-4‴),70.90(C-5‴),19.10(C-6‴)。以上数据与文献报道^[

9]的数据基本一致，故化合物2鉴定为dioseptemloside G。

化合物3 白色无定形粉末，ESI-MS(m/z) 1 069.4 [M+Na]⁺，分子式C₅₁H₈₂O₂₂。¹H NMR(C₅D₅N, 500 MHz) δ: 1.00(3H, s, CH₃-18), 1.11(3H, s, CH₃-19), 1.27(3H, d, J = 7.0 Hz, CH₃-21), 1.62(3H, d, J = 5.0 Hz, CH₃-Rha I), 1.62(3H, d, J = 5.5 Hz, CH₃-Rha II), 1.78(3H, d, J =6.0 Hz, CH₃-Rha III), 4.92(1H, br.s, Glc-H-1), 5.83(1H, s, Rha II-H-1), 6.28(1H, s, Rha III-H-1), 6.39(1H, s, Rha I-H-l)；¹³C NMR(C₅D₅N, 125 MHz) δ: 36.76(C-1), 29.36(C-2), 77.28(C-3), 38.19(C-4), 139.99(C-5), 121.02(C-6), 31.27(C-7), 31.55(C-8), 49.46(C-9), 36.35(C-10), 20.15(C-11), 31.55(C-12), 44.35(C-13), 52.23(C-14), 32.8(C-15), 89.24(C-16), 89.36(C-17), 16.34(C-18), 18.63(C-19), 44.07(C-20), 8.93(C-21), 109.40(C-22), 31.27(C-23), 22.78(C-24), 38.16(C-25), 63.12(C-26), 63.58(C-27), Glc: 99.49(C-1′), 79.56(C-2′), 76.14(C-3′), 77.28(C-4′), 76.91(C-5′), 60.42(C-6′),Rha I:101.35(C-1″),72.08(C-2″), 71.67(C-3″), 73.31(C-4″), 68.73(C-5″), 17.58(C-6″), Rha II: 101.42(C-1‴), 72.44(C-2‴), 72.01(C-3‴), 77.20(C-4‴), 67.53(C-5‴), 17.80(C-6‴), Rha III: 102.46(C-1⁗), 72.00(C-2⁗), 71.80(C-3⁗), 73.18(C-4⁗), 69.58(C-5⁗), 18.04(C-6⁗)。以上数据与文献报道^[

10]的数据基本一致，故化合物3鉴定为polyphylloside III。

化合物4 白色无定形粉末，ESI-MS(m/z) 1 053.2[M+Na]⁺，分子式C₅₁H₈₂O₂₁。¹H NMR(C₅D₅N, 500 MHz) δ: 0.73(3H, s, CH₃-18), 1.08(3H, d, J = 8.0 Hz, CH₃-21), 1.09(3H, s, CH₃-19), 1.14(3H,d, J = 7.0 Hz, CH₃-27), 1.62(3H, d, J = 3.0 Hz,CH₃-Rha I), 1.62(3H, d, J = 3.0 Hz, CH₃-Rha II), 1.79(3H, d, J =6.0 Hz, CH₃-Rha III), 4.97(1H, d, J = 6.0 Hz, Glc-H-1), 5.84(1H, s, Rha II-H-1), 6.29(1H, s, Rha III-H-1), 6.40(1H, s, Rha I-H-l)；¹³C NMR(C₅D₅N, 125 MHz) δ: 37.25(C-1), 30.16(C-2), 78.07(C-3), 38.97(C-4), 140.97(C-5), 121.48(C-6), 32.00(C-7), 31.04(C-8), 50.05(C-9), 37.10(C-10), 20.78(C-11), 38.72(C-12), 41.72(C-13), 51.18(C-14), 37.44(C-15), 217.69(C-16), 66.42(C-17), 12.88(C-18), 19.41(C-19), 43.79(C-20), 15.64(C-21), 213.28(C-22), 40.41(C-23), 27.69(C-24), 36.22(C-25), 67.48(C-26), 17.28(C-27), Glc: 100.40(C-1′), 78.05(C-2′), 77.91(C-3′), 77.76(C-4′), 77.04(C-5′), 61.32(C-6′), Rha I: 102.21(C-1″), 72.52(C-2″), 72.88(C-3″),74.17(C-4″),69.57(C-5″),18.44(C-6″),Rha II:102.28(C-1‴),72.88(C-2‴),73.30(C-3‴),80.42(C-4‴),68.39(C-5‴),18.67(C-6‴),Rha III: 103.32(C-1⁗),72.66(C-2⁗),72.94(C-3⁗),74.03(C-4⁗),70.43(C-5⁗),18.90(C-6⁗)。以上数据与文献报道的数据^[

11]基本一致，故化合物4鉴定为chonglouoside SL-19。

化合物5 白色无定形粉末，ESI-MS(m/z) 1 071.5 [M+Na]⁺，分子式C₅₁H₈₄O₂₂。¹H NMR(C₅D₅N, 500 MHz) δ: 0.88(3H, s, CH₃-18), 1.01(3H,d,J = 7.0 Hz,CH₃-27),1.07(3H,s,CH₃-19), 1.35(3H, d, J = 7.0 Hz, CH₃-21), 1.65(3H, d, J = 6.0. Hz, CH₃-Rha I),1.78(3H, d,J =6.0 Hz, CH₃-Rha II), 4.83(1H, d, J = 8.0 Hz, Glc I-H-1), 4.93(1H, d, J = 7.0 Hz, Glc II-H-1), 5.88(1H, s, Rha II-H-1), 6.42(1H, s, Rha I-H-l), 5.32(1H, br.s, H-6)；¹³C NMR(C₅D₅N, 125 MHz) δ: 38.00(C-1), 30.66(C-2), 78.26(C-3), 39.48(C-4), 141.27(C-5), 122.31(C-6), 32.83(C-7), 32.17(C-8), 50.85(C-9), 37.62(C-10), 21.59(C-11), 40.42(C-12), 41.27(C-13), 57.08(C-14),32.95(C-15),81.58(C-16),64.34(C-17),16.92(C-18),19.88(C-19),41.47(C-20),16.94(C-21),111.14(C-22),37.62(C-23),28.84(C-24),34.77(C-25),75.69(C-26),17.95(C-27), Glc I: 100.79(C-1′),78.61(C-2′),77.41(C-3′), 79.10(C-4′),78.26(C-5′),61.78(C-6′),Rha I:102.49(C-1″),73.01(C-2″),73.03(C-3″),74.62(C-4″),69.99(C-5″),18.97(C-6″),Rha II:103.39(C-1‴),73.01(C-2‴),73.21(C-3‴),74.40(C-4‴),70.90(C-5‴),19.11(C-6‴),Glc II:105.43(C-1⁗),75.74(C-2⁗),78.96(C-3⁗),72.20(C-4⁗),78.44(C-5⁗),63.32(C-6⁗)。以上数据与文献报道的数据^[

12]基本一致，故化合物5鉴定为protodioscin。

化合物6 白色无定形粉末，ESI-MS(m/z) 1 051.4[M+Na]⁺，分子式C₅₁H₈₀O₂₁。¹H NMR(C₅D₅N, 500 MHz) δ: 0.69(3H, d, J = 5.0 Hz, CH₃-27), 0.86(3H, s, CH₃-18), 1.13(3H, s, CH₃-19), 1.15(3H, d, J = 5.5 Hz, CH₃-21), 1.63(3H, d, J = 4.0 Hz, CH₃-Rha II), 1.63(3H, d, J = 4.0 Hz, CH₃-Rha I), 1.78(3H, d, J = 4.5 Hz, CH₃-Rha III), 4.92(1H, br.s, Glc-H-1), 5.78(1H, br.s, H-6), 5.87(1H, s, Rha II-H-1), 6.32(1H, s, Rha III-H-1), 6.46(1H, s, Rha I-H-l)；¹³C NMR(C₅D₅N, 125 MHz) δ: 36.91(C-1), 30.22(C-2), 77.60(C-3), 39.31(C-4), 165.66(C-5), 126.75(C-6), 201.48(C-7), 45.48(C-8), 50.28(C-9), 39.18(C-10), 21.57(C-11), 39.18(C-12), 41.65(C-13), 50.46(C-14), 34.84(C-15), 81.81(C-16), 62.36(C-17), 16.93(C-18), 17.53(C-19), 42.40(C-20), 15.61(C-21), 109.76(C-22), 32.29(C-23), 29.70(C-24), 31.06(C-25), 67.26(C-26), 17.77(C-27), Glc: 101.05(C-1′), 78.14(C-2′), 78.04(C-3′), 78.06(C-4′), 77.49(C-5′), 61.70(C-6′), Rha I: 102.52(C-1″), 72.95(C-2″), 73.28(C-3″), 74.58(C-4″), 70.02(C-5″), 19.12(C-6″), Rha II: 102.72(C-1‴), 73.34(C-2‴),73.78(C-3‴), 80.88(C-4‴), 68.82(C-5‴), 19.37(C-6‴), Rha III: 103.82(C-1⁗), 73.14(C-2⁗), 73.34(C-3⁗), 74.49(C-4⁗), 70.92(C-5⁗), 18.92(C-6⁗)。以上数据与文献报道的数据^[

13]基本一致，故化合物6鉴定为chonglouoside SL-5。

4 生物活性检测

4.1　促血小板聚集活性检测

血小板聚集的浊度测量参考Sun等^[

14]的方法及仪器操作手册。用3.8%柠檬酸钠溶液抗凝，下腔静脉穿刺取小鼠血液。血液采集后用水平离心机500 r/min转速离心5 min，待自然停止后取出，获得富血小板血浆(PRP)，小心吸取上层富含血小板血浆后，将剩余的血液3 000 r/min转速离心 10 min，待自然停止后取出，获得血小板缺乏血浆(PPP)，离心温度维持在22 ℃。对PRP中的血小板进行计数后用生理盐水进行调整，将血小板浓度稀释到每升2 × 10¹¹个。血小板聚集试验在制备PRP后3 h内完成。

在测定样品方杯中加入1个小磁棒和PRP 300 μL，置恒温孔中预热5 min，待仪器扣除背景且示数稳定后，用微量进样器吸取待测样品5 μL加入杯底，记录血小板聚集引起的光密度变化。聚合的程度是根据透光率的最大增加百分比来估计的，血小板缺乏血浆表示100%的透光率。以生理盐水为空白对照，以重楼皂苷Ⅶ为阳性对照。

4.2　细胞毒性检测

取单层培养的HT29细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养基配成每毫升5×10⁴个细胞悬液后接种于96孔板(每孔100 μL)，于37 ℃、5% CO₂及饱和湿度的条件下静置24 h，待细胞贴壁后分别加入不同浓度(1，5，10，25，50，100 μmol/L) 的化合物1~6及阳性药顺铂，并设空白组，同样培养条件下培养48 h后，每孔加入MTT(5 mg/L) 20 μL作用3 h, 加入DMSO溶解形成的蓝紫色结晶，并于492 nm波长测定各孔细胞吸收度，并计算IC₅₀。实验重复3次。

4.3　生物活性测定结果

采用血小板聚集仪对已经分离鉴定的6个化合物进行促血小板聚集活性评价。研究结果表明，与空白对照组血小板最大聚集率（33.06%）相比，在20 mmol/L浓度下，化合物1(31.93%)、2(33.34%)、 3(30.28%)、 4(31.26%)、5(34.19%)、6(36.16%)均未显示出明显的促进血小板聚集的作用；在相同浓度下，阳性对照重楼皂苷Ⅶ血小板最大聚集率为63%。

采用MTT比色法对已分离鉴定的6个化合物进行细胞毒性评价。研究结果表明，化合物2 [IC₅₀（6.215 ± 1.016）μmol/L]、化合物4 [IC₅₀（17.750 ± 1.304）μmol/L]对于人结肠癌HT29细胞具有较强的细胞毒性，且化合物2的细胞毒性强于阳性药顺铂[IC₅₀（11.145 ± 1.109）μmol/L]。其他4个化合物的IC₅₀超过100 μmol/L，因此认为对该细胞株没有明显的细胞毒性。

5 结果与讨论

本研究对滇重楼（Paris. polyphylla var. yunnanensis）地上部分的化学成分进行了初步研究，分离并鉴定了6个化合物，其中包括1个新化合物。同时发现分离得到的化合物2和4对HT29细胞具有较强的细胞毒性，具有进一步研究的价值。本研究结果丰富了滇重楼的化学库，为其药用价值的开发利用提供了研究基础。但本研究对滇重楼地上部分的成分分离还不够全面，药理活性研究不够深入，亟待后续的进一步研究。

参考文献

Huang Y, Cui LJ, Wang Q, et al. Separation and identification of active constituents of Paris vietnamensis [J]. Acta Pharm Sin(药学学报), 2006, 41(4):361-364. [百度学术]

Yang YG, Zhang J, Zhang JY, et al. Research progress in chemical constituents in plants of Paris L. and their pharmacological effects [J]. Chin Trad Herbal Drugs(中草药), 2016, 47(18):3301-3323. [百度学术]

Wang YH, Niu HM, Li H, et al. Medicinal values and their chemical bases of Paris [J]. China J Chin Mater Med(中国中药杂志), 2015, 40(5):834-839. [百度学术]

He Ms, Li X. Progress of pharmacological research on Paridis [J]. World Chin Med(世界中医药), 2015, 40(5):579-582. [百度学术]

Wang Q, Xu GJ, Cheng YB. Study on antibacterial and hemostatic activities of Rhizoma Paridis [J]. J China Pharm Univ(中国药科大学学报), 1989, 20(4):251-253. [百度学术]

Chen CX, Zhang YT, Zhou J. Steroid saponins of aerial parts of paris polyphylla var. yunnanensis [J]. Acta Bot Yunnan(云南植物研究), 1990, 12(3):323-329. [百度学术]

Takehiko H, Tsuyoshi I, Toshihiro N, et al. New steroidal glycosides from the fruits of Solanum anguivi [J]. J Nat Prod, 2002, 65:1918-1920. [百度学术]

Kong LY. Spectrum analysis of complex natural products(复杂天然产物波谱解析) [M]. Beijing: China Medical Science and Technology Press, 2012:656. [百度学术]

Liu XT, Xiao W, Wang ZZ, et al. Cholestane and spirostane glycosides from the rhizomes of Dioscorea septemloba [J]. Phytochemistry, 2008, 69:1411-1418. [百度学术]

Chen CX, Zhou J, Hiromichi N, et al. Two minor steroidal saponins from the aerial parts of paris polyphylla var.yunnanensis [J]. Acta Bot Yunnan(云南植物研究), 1995, 17(2):215-220. [百度学术]

Qin XJ, Yu MY, Liu HY, et al. Steroidal saponins from stems and leaves of Paris polyphylla var.yunnanensis [J]. Phytochemistry, 2016, 121:20-29. [百度学术]

Tan DW, Kang LP, Ma BP, et al. Study on Steroidal Saponins of Dioscorea septemloba Thunb [J]. J Chin Med Mater(中药材), 2006, 29(11):1176-1179. [百度学术]

Qin XJ, Sun DJ, Liu HY, et al. Steroidal saponins with antimicrobial activity from stems and leaves of Paris polyphylla var. Yunnanensis [J]. Steroids, 2012, 77:1242-1248. [百度学术]

Sun CL, Ni W, Liu HY, et al. Steroidal saponins with induced platelet aggregation activity from the aerial parts of Paris verticillata [J]. Steroids, 2014, 92: 90-95. [百度学术]

滇重楼地上部分化学成分研究

摘要

关键词

1 材 料

1.1 仪器与试剂

1.2 药 材

1.3 动物与细胞株