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透明质酸修饰天冬酰胺酶自组装仿生纳米囊的稳定性及其体内药代动力学

- ORCID：
刘煜莹 ¹
- ORCID：
李瑶 ²
- ORCID：
杨强 ¹
- ORCID：
陈冉 ¹
- ORCID：
李开铃 ¹
- ORCID：
张景勍 ¹

1. 重庆医科大学重庆药物高校工程研究中心，重庆 400016； 2. 重庆市公共卫生医疗救治中心，重庆 400036

中图分类号： R945； R917

最近更新：2020-09-17

DOI：10.11665/j.issn.1000-5048.20200411

摘要

考察了透明质酸修饰的天冬酰胺酶(asparaginase, Asp)自组装仿生纳米囊（hyaluronic acid-modified asparaginase self-assembled bionic nanocapsules, ASNCs）的稳定性及药代动力学特性。使用分子自组装法制备ASNCs，考察其形态、粒径、Zeta电位和抗胰蛋白酶稳定性。大鼠静脉注射给予游离Asp和ASNCs后，取不同时间点下大鼠血浆样品测定Asp的活性。采用DAS药代动力学软件计算药代动力学参数。实验测定ASNCs的粒径为(99.17 ± 0.21) nm，电位为-(13.13 ± 0.60) mV。在胰蛋白酶溶液中，ASNCs表现出更优异的稳定性。ASNCs的活性-时间曲线下面积AUC_{0-48 h}与天冬酰胺酶相比约提高了2倍，平均滞留时间MRT_{0-48 h}约为Asp的1.7倍，生物利用度为Asp的195%。研究结果表明，透明质酸修饰的天冬酰胺酶自组装仿生纳米囊能提高天冬酰胺酶抗胰蛋白酶稳定性及生物利用度，延长了Asp在体内的循环时间。

关键词

天冬酰胺酶; 透明质酸; 纳米囊; 药代动力学; 自组装; 药物递送

天冬酰胺酶（asparaginase, Asp）是临床用于治疗淋巴细胞白血病的一线化疗药物^[

1]。Asp能将细胞内的门冬酰胺分解为门冬氨酸和氨，使肿瘤细胞因缺少生长所必要的门冬酰胺而引起蛋白质合成障碍，最终导致肿瘤细胞凋亡^{[参考文献 2
百度学术}2]。大量的临床研究显示，Asp能显著改善急性淋巴细胞白血病的预后，对提高急性淋巴细胞白血病的完全缓解率及长期无事件生存率等方面有显著贡献^{[参考文献 3
百度学术}3]。但是，Asp存在蛋白质类药物固有缺陷如活性低、半衰期短和易产生耐药性^{[参考文献 4
百度学术}4]，且有研究表明Asp在体内有一定的不良反应^{[参考文献 5
百度学术}5]，直接限制了其在临床上的广泛应用。

为了延长Asp在大鼠体内的滞留时间，研究人员采用葡聚糖/聚精氨酸层的CaCO₃纳米粒装载Asp^[

6]，田明达等^{[参考文献 7
百度学术}7]用壳聚糖和油酸钠修饰的超顺磁性四氧化三铁纳米粒子装载Asp，Ashrafi等^{[参考文献 8
百度学术}8]用一种新型脂肪酸与Asp进行生物接合，Chien等^{[参考文献 9
百度学术}9]对Asp进行PEG化修饰等，这些针对Asp剂型的改造在一定程度上阻断了蛋白酶对Asp分解以及温度对Asp活性的影响，但是仍未解决Asp免疫原性高、生物相容性低和体内循环时间短等不足。因此构建一个既能提高Asp体内稳定性，同时又能提高其生物相容性及生物利用度的递送系统十分必要。透明质酸具有靶向性，可以和肿瘤细胞中的CD44受体结合^{[参考文献 10
百度学术}10]。自组装纳米系统载药量大，制备简单^{[参考文献 11
百度学术}11]。

为了提高Asp体内活性和生物利用度，本研究首次制备了透明质酸（HA）修饰Asp自组装仿生纳米囊（hyaluronic acid-modified asparaginase self-assembled bionic nanocapsules, ASNCs）。首先将PEG2000与HA分子偶联形成两亲性的HA-g-PEG，该两亲性HA-g-PEG与羟丙基-β-环糊精能自组装形成仿生膜，同时将Asp固定在仿生膜中，然后再一起包封于脂质纳米囊中。本实验对ASNCs的体外抗胰蛋白酶水解稳定性和体内药代动力学行为进行了考察，以期为大分子药物的临床研究提供依据。

1 材料

1.1　试　剂

天冬酰胺酶（Asp，纯度：96%，批号：312PLASP1，以色列Prospec公司）；天冬酰胺、胆固醇（美国Sigma公司）；磷脂（纯度：100%，德国Lipoid公司）；羟丙基-β-环糊精（HPCD，纯度：98%，南京都莱生物技术有限公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、考马斯亮蓝G-250（国药集团化学试剂有限公司）；HA-g-PEG（实验室自制^[

12]）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2　仪　器

85-2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；pH计（上海精密科学仪器有限公司）；UV-7504 PC紫外分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）。

1.3　动　物

雄性SPF级SD大鼠，体重（200±20）g。由重庆医科大学实验动物中心提供，许可证号为SYXK（渝）2016-0001，所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方　法

2.1　ASNCs的制备及形态考察

按照处方量精确称取胆固醇和磷脂（物质的量比为1∶3）放置于圆底烧瓶中，加入二氯甲烷 15 mL使之溶解，于黑暗处放置30 min。将圆底烧瓶放置于旋转蒸发仪上，30 ℃减压旋蒸至形成均匀的薄膜，加入乙醚15 mL摇晃脱膜。将HA-g-PEG溶液（质量分数为1.0%）2 mL缓慢加入至HPCD饱和溶液（质量分数为6%）6 mL中形成的HA-g-PEG/HPCD溶液，精密称取处方量Asp 1 mg溶解于HA-g-PEG/HPCD溶液中，然后加入到上述圆底烧瓶中，使用水浴型超声仪超声，直至形成均匀带乳光的分散体系。将圆底烧瓶转移至旋蒸仪，30 ℃减压蒸发，至形成凝胶状塌陷为均匀液体，取出液体加入至10 mL量瓶用pH 7.3的Tris-HCl缓冲液定容，即得ASNCs。用pH 7.3的Tris-HCl缓冲液将ASNCs稀释10倍后，于透射电镜下观察ASNCs的外观形态，马尔文激光粒度仪测定ASNCs的粒径和电位。

2.2　活性测定

Asp的活性采用奈斯试剂法^[

13]进行测定。实验前，将底物天冬酰胺溶液预热2 min，在底物天冬酰胺溶液中加入Asp溶液0.1 mL，置于37 ℃水浴锅中反应10 min，即刻加入三氯醋酸溶液0.1 mL以终止反应，离心后取出上清液，取奈斯勒指示剂和适量蒸馏水加至上清液中，放置10 min后，于480 nm处测定吸收度。

2.3　抗胰蛋白酶水解稳定性

将Asp和ASNCs溶液分别与等量胰蛋白酶溶液混合，在37 ℃条件下孵育，于一系列时间点0，10，20，30，40，50，60 min时分别取出，按照“2.2”项下方法测定游离Asp和ASNCs中Asp的活性。

2.4　药代动力学考察

取12只雄性SD大鼠，随机分成2组，禁食24 h后，尾静脉分别注射游离Asp和ASNCs（给药剂量以Asp计为2 U/g）。在给药后0.08，0.17，0.25，0.50，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，10，12，24，48 h眼静脉取血。采血（约0.3 mL）注入肝素化的试管， 4 000 r/min离心10 min 后分离血浆样品，于-20 ℃保存待测定。DAS软件分析处理数据，比较Asp和ASNCs之间药代动力学行为和生物利用度的差异。

2.5　统计学处理方法

游离Asp和ASNCs稳定性数据通过SPSS软件进行双向单侧t检验,P<0.05认为差异有统计学意义。

3 结果

3.1　ASNCs的微观形态

如图1所示，透射电镜下观察到的ASNCs呈均匀分布的圆形或椭圆形。

Figure 1 Transmission electron microscopy image of hyaluronic acid-modified asparaginase self-assembled bionic nanocapsules（ASNCs）

3.2　粒径和Zeta电位

经测定，ASNCs粒径为（99.17 ± 0.21）nm，Zeta电位为-（13.13 ± 0.60）mV，表明ASNCs的粒径适中且性质稳定（n=3）。

3.3　抗胰蛋白酶水解稳定性

如图2所示,Asp和ASNCs在与胰蛋白酶接触后，活性均受到较大影响，但与ASNCs相比，游离Asp受胰蛋白酶水解影响更大。在胰蛋白酶存在的外环境中，游离Asp活性下降迅速，降至仅存50%活性所需时间约为15 min，而ASNCs活性降至50%所需时间大约为35 min，40 min时已无法检测到Asp活性，但此时ASNCs仍保持着34%的活性。这表明， ASNCs较游离Asp有更好地抗胰蛋白酶水解的能力，更高的稳定性。

Figure 2 Proteolytic stabilities of remaining activity of free asparaginase (Asp) and ASNCs $(\bar{x} \pm s, n = 3)$

注：

^***P<0.001 vs Asp group

3.4　ASNCs药代动力学行为

静脉注射游离Asp和ASNCs后，大鼠体内药物活性-时间曲线关系图见图3。在静脉注射后，游离Asp和ASNCs活性整体呈下降趋势，且ASNCs活性始终高于游离Asp。在12 h时，游离Asp活性几乎为零，而此时ASNCs活性为（1.46 ± 0.375）U/mL，ASNCs持续到48 h才完全失活。这些结果证实了ASNCs能延长Asp在体内的循环时间。

Figure 3 Activity-time curves of free Asp and ASNCs $(\bar{x} \pm s, n = 6)$

经过DAS软件计算得到，游离Asp和ASNCs主要的药代动力学参数见表1（非房室模型）和表2（房室模型）。分析非房室模型主要药代动力学参数可看出，ASNCs与游离Asp相比，AUC_{0-48 h}和AUC_0-∞分别增加了44.72.32和47.82 U·h/mL，表明静注后吸收增加；MRT_{0-48 h}和MRT_0-∞分别增加了2.32和2.71 h，同时ASNCs的CL降低为游离Asp的40%，表明ASNCs体内的滞留时间增加。并且ASNCs的c_max为Asp的1.3倍，说明ASNCs的活性更强。各项参数均表明ASNCs在体内的药代动力学行为优于Asp。

Table 1 Non-compartment model pharmacokinetic parameters of Asp and ASNCs (

\bar{x} \pm s

, n=3)

Parameter	Asp	ASNCs
AUC_{0-48 h}/(U·h/mL)	46.993 ± 6.634	91.71 ± 12.332
AUC_0-∞/(U·h/mL)	47.91 ± 7.207	95.729 ± 8.426
MRT_{0-48 h}/h	3.311 ± 0.437	5.629 ± 1.58
MRT_0-∞/h	3.521 ± 0.532	6.23 ± 0.834
t_max/h	0.248 ± 0.035	0.148 ± 0.045
c_max/(kU/L)	14.444 ± 1.824	18.345 ± 2.901
CL/(L·h^-1·kg^-1)	0.17 ± 0.023	0.084 ± 0.007
V/(L/kg)	0.461 ± 0.057	0.402 ± 0.084
Relative bioavailability/%	-	195.15

Table 2 Compartment model pharmacokinetic parameters of Asp and ASNCs (

\bar{x} \pm s

,n=6)

Parameter	Asp	ASNCs
AUC_{0-48 h}/(U·h/mL)	47.228 ± 8.724	100.85 ± 16.754
AUC_0-∞/(U·h/mL)	52.839 ± 15.097	104.021 ± 14.993
V/(L/kg)	0.308 ± 0.208	0.6 ± 0.118
CL/(L·h^-1·kg^-1)	0.159 ± 0.036	0.077 ± 0.015
t_1/2,β/h	2.945 ± 0.956	5.262 ± 0.931
α	9.988 ± 3.881	2.419 ± 2.217
β	0.252 ± 0.068	0.139 ± 0.027
Relative bioavailability/%	-	213.54

室模型参数见表2，分析其主要药代动力学参数可看出，游离Asp和ASNCs相比，AUC_{0-48 h}和AUC_0-∞分别增加了53.62.87和U·h /mL，表明静注后吸收增加；t_1/2增加了2.31 h，ASNCs的CL降低为游离Asp的49%，表明药物在体内停留时间增加。各项参数均表明ASNCs在体内的药代动力学行为优于Asp。

分析非房室模型和房室模型主要药代动力学参数可看出，游离Asp和ASNCs相比，AUC_{0-48 h}和AUC_0-∞均有明显增加，CL均大幅降低，从AUC_{0-48 h}的比较看出，与Asp相比，ASNCs的相对生物利用度约为195.15%（非房室模型）或213.54%（房室模型）。非房室模型和房室模型得出的结果一致。用两种模型分析得到的结果可知，ASNCs提高了Asp的体内活性，降低了清除率，延长了滞留时间，从而提高了Asp的生物利用度。

4 讨论

自组装纳米系统载药量大，制备简单^[

11]，是大分子药物的理想载体。本研究首先将抗肿瘤酶Asp包封于自组装仿生脂质纳米囊中，并考察了ASNCs的微观形态、体外抗胰蛋白酶水解稳定性和体内药代动力学。从抗胰蛋白酶水解稳定性结果上看，ASNCs具有比Asp更高的活性，分析可能原因与包封于脂质纳米粒中的尿酸酶稳定性提高原因类似：蛋白质类药物稳定性改变与空间结构如螺旋结构和三级结构变化有关^{[参考文献 14
百度学术}14]，自组装仿生脂质纳米囊能保护Asp的空间结构，使其构象不会因为外界条件变化而改变^{[参考文献 15
百度学术}15]。大鼠体内药代动力学行为显示，ASNCs相对生物利用度为游离Asp的2倍左右，ASNCs在大鼠体内的AUC_{0-48 h}和c_max均较Asp高，说明将Asp制备成ASNCs后确实可以提高酶在大鼠体内的相对生物利用度，缓释效果明显。同时，与黄永佳等^{[参考文献 2
百度学术}2]制备的Asp核壳型纳米粒相比（AUC_{0-48 h}为86.06 U·h /mL），ASNCs的AUC_{0-48 h}提高了5.65 U·h/mL，说明ASNCs具有更高的生物利用度。分析该纳米粒能提高Asp生物利用度的可能原因一是经过透明质酸修饰后的纳米囊生物相容性更高，避免了Asp在体内由于免疫原性高失活的问题；二是纳米囊能有效封装Asp，在进入血液后，外界血液中的代谢酶对Asp的影响减小，从而达到长效和高效的目的；再者纳米囊能维持Asp的构象，提高其稳定性和活性。

综上，本研究制备的透明质酸修饰的自组装仿生纳米囊，提高了Asp的稳定性和生物利用度，缓释效果明显，同时透明质酸具有靶向肿瘤细胞表面受体CD44的优点，磷脂和胆固醇作为内源性物质具有良好的生物相容性。因此，本实验为构建生物相容性、靶向肿瘤细胞的Asp递送系统提供了思路与方法，为Asp递送系统的进一步研究与应用奠定了理论基础。

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透明质酸修饰天冬酰胺酶自组装仿生纳米囊的稳定性及其体内药代动力学

摘要

关键词

1 材 料

1.1 试 剂

1.2 仪 器

1.3 动 物

2 方 法

2.1 ASNCs的制备及形态考察

2.2 活性测定

2.3 抗胰蛋白酶水解稳定性

2.4 药代动力学考察

2.5 统计学处理方法

3 结 果

3.1 ASNCs的微观形态

3.2 粒径和Zeta电位

3.3 抗胰蛋白酶水解稳定性

3.4 ASNCs药代动力学行为

4 讨 论