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色谱-质谱联用技术鉴定盐酸咪达唑仑的有关物质

- ORCID：
金瑞
- ORCID：
闫若凝
- ORCID：
陆宇婷
- ORCID：
宋敏
- ORCID：
杭太俊

中国药科大学药物分析系，南京 210009

中图分类号： R917

最近更新：2020-11-03

DOI：10.11665/j.issn.1000-5048.20200309

摘要

色谱-质谱联用（LC-MS）技术鉴定盐酸咪达唑仑中的有关物质。采用Thermo BDS Hypersil C₁₈ （100 mm×4.6 mm，2.4 μm）色谱柱，以乙腈-25 mmol/L醋酸铵水溶液（冰醋酸调节pH为5.5）为流动相梯度洗脱，对盐酸咪达唑仑有关物质进行分离，电喷雾正离子化-四极杆-飞行时间串联质谱（ESI-Q-TOF/MS）高分辨测定各有关物质母离子及其子离子的准确质量和元素组成，通过光谱解析并结合合成工艺分析鉴定了它们的结构，并对部分杂质进一步采用对照品对照确证。在所建立的分析条件下，盐酸咪达唑仑及其有关物质分离良好，检测并鉴定出盐酸咪达唑仑及其强制降解试验样品中22个主要有关物质，其中8个为美国药典规定的已知杂质。LC-MS技术能有效地分离鉴定盐酸咪达唑仑中的有关物质，可为其贮存条件制定、生产工艺优化和质量控制提供参考依据。

关键词

盐酸咪达唑仑; 有关物质; 结构鉴定; 色谱-质谱联用

盐酸咪达唑仑（1-甲基-8-氯-6-（2-氟苯基）-4H-咪唑并［l，5-a］［l，4］苯并二氮杂䓬盐酸盐，midazolam hydrochloride，图1）是一种短效苯二氮䓬类药物（GABA-a激动剂），对中枢神经系统有抑制作用，起效快，不良反应少^［

1-5］，可用于镇静催眠、抗惊厥及麻醉诱导^{［参考文献 6-7}6-7］。目前，文献报道主要集中在临床应用和药理学研究^{［参考文献 6-9}6-9］。咪达唑仑有关物质研究虽已有报道^{［参考文献 10-13}10-13］，主要阐述了咪达唑仑有关物质分析方法的建立及验证^{［参考文献 10
百度学术}10］，针对工艺杂质、降解杂质的鉴定和裂解机制的研究^{［参考文献 11-13}11-13］尚不完善。

本研究建立了适用于盐酸咪达唑仑全部有关物质（工艺杂质及降解产物）检查的LC-MS方法，通过光谱检测和分析、对照品比对、并结合合成工艺（图1），共分析鉴定了成品中潜在的22个有关物质，其中包括中间体、副产物及分降解产物（图2），可为盐酸咪达唑仑的贮存条件制定，生产工艺和质量控制提供参考依据。

Figure 1 Typical synthetic routes of midazolam hydrochloride

1 材料

1.1　试剂

盐酸咪达唑仑及其有关物质对照品（中国食品药品检定研究院及USP对照品）；乙酸铵、冰醋酸（AR级，南京化学试剂有限公司）；乙腈（CR级，美国Tedia公司），市售超纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

1.2　仪器

岛津LCMS-9030四极杆飞行时间质谱仪、LabSolutions数据处理系统（日本岛津公司）； BS21S分析天平（德国Sartorius公司）。

2 方法

色谱条件：Thermo BDS HYPERSIL C₁₈ （100 mm × 4.6 mm，2.4 μm）色谱柱；流动相A相为25 mmol/L乙酸铵缓冲溶液（用冰醋酸调节pH至5.5），B相为乙腈，线性梯度洗脱（A∶B）：0 min （75∶25）→20 min（50∶50）→25 min（50∶50）→26 min（75∶25）→32 min（75∶25），流速0.65 mL/min，柱温40 ℃，检测波长254 nm，进样量10 μL。

质谱条件：电喷雾正离子化，高分辨Q-TOF/MS测定，NaI溶液（400 μg/mL）准确质量校正。喷雾电压4.0 kV，雾化气压力230 kPa，流量3 L/min，接口温度300 ℃，加热气流量10 L/min，干燥气流量10 L/min，氩气CID碰撞能量30～40 eV，扫描范围m/z 50~1 000。

供试品溶液：取盐酸咪达唑仑约5 mg，精密称定，置于5 mL量瓶中，加25%乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成质量浓度为1 mg/mL的供试品溶液。精密量取上述溶液适量，加25%乙腈定量稀释，配制0.1%的自身对照溶液。

混合对照品溶液：取各有关物质对照品（有关物质5、 6、 8、 10、 13、 16、 17、 18、 19、 21和22）适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释成质量浓度均约为1 μg/mL的溶液，作为混合杂质对照溶液。

强制降解试验溶液：取盐酸咪达唑仑约5 mg，加0.01 mol/L盐酸溶液0.2 mL， 60 ℃水浴放置10 min，或加0.01 mol/L氢氧化钠溶液0.2 mL， 60 ℃水浴放置10 min，或加30%过氧化氢1 mL， 60 ℃水浴放置10 h，或加25%乙腈1 mL，90 ℃水浴放置6 d，或加25%乙腈1 mL光照（4 500 lx）放置2 d，或110 ℃烘箱中放置10 d，或光照（4 500 lx）放置10 d，分别处理后，各加25%乙腈溶解（酸碱处理样品先中和）并稀释至5 mL，配制成质量浓度均约为1 mg/mL的强制降解试验溶液。同时进行空白溶剂试验。

3 结果

3.1　有关物质检查

美国药典（USP 43）中采用乙腈-100 mmol/L醋酸盐缓冲溶液等度洗脱^［

14］的反相HPLC方法检查咪达唑仑的有关物质。该条件下潜在有关物质之间的分离差异较大，耗时较长。

本研究优化了缓冲溶液浓度，并使用梯度洗脱方法进行盐酸咪达唑仑中有关物质的分离与检查。结果：显著改善了盐酸咪达唑仑各有关物质的分离度，提高了分析效率，并适用于有关物质的LC-MS鉴定。

根据工艺过程、潜在副产物分析^［

13，15］，结合强制降解试验，分离检测到盐酸咪达唑仑中潜在的22个主要有关物质（图2），对各杂质依保留时间从小到大顺序编号。其中8个为工艺杂质：5、6、8、11、13、17、18和19；11个为降解产生：1、2、4、7、9、12、14、15、16、20和22； 3个既是工艺杂质又是降解杂质：3、10、21。并且有关物质：5、6、8、10、13、17、18和21分别与USP 43规定的已知有关物质A、C、B、D、E、F、G和H相对应。

采用0.1%主成分自身对照法估算杂质的含量，盐酸咪达唑仑原料药中仅检测到1个有关物质（3）的含量大于0.1%。

强制降解试验结果表明（表1），盐酸咪达唑仑在酸、碱破坏条件下，有关物质3的含量显著增大，并新增1个明显降解产物（有关物质16）。在高温干法条件下，未见明显降解产物；在高温湿法破坏条件下，产生4个主要降解产物（有关物质7、15、16、21）。在干法光照条件下，新增1个明显降解产物（有关物质4）；在湿法光照破坏条件下，产生6个主要降解产物（有关物质2、7、12、14、16、22）。在氧化破坏条件下，产生9个主要降解产物（有关物质1、2、4、7、9、10、14、20、22）。

Table 1 Material balance of the stressed samples of midazolam hydrochloride

Sample	m/mg	Area_API	Area_Impurities	Total area	Total area/Sample weight	Calibration
Normal	5.12	25 057 041	244 425	25 301 466	4.94×10⁶	1.00
Acid	5.02	22 582 999	1 211 053	23 794 052	4.74×10⁶	0.96
Alkaline	5.03	22 983 352	630 032	23 613 384	4.69×10⁶	0.95
Oxidation	4.96	21 119 501	1 278 797	22 398 298	4.52×10⁶	0.91
Dry thermal	5.12	24 484 586	415 227	24 899 813	4.86×10⁶	0.98
Wet thermal	5.01	25 184 043	520 509	25 704 552	5.13×10⁶	1.04
Dry photolysis	5.05	25 365 361	440 405	25 805 766	5.11×10⁶	1.03
Wet photolysis	4.98	26 512 382	748 254	27 260 636	5.47×10⁶	1.11

Figure 2 HPLC-UV chromatograms of midazolam hydrochloride

注：

a：Blank; b：Reference 0.1%; c：Active pharmaceutical ingredients（API）and its stressed solutions (d：Acid; e：Alkaline; f：Oxidation; g：Wet thermal; h：Dry thermal; i：Wet photolysis; j：Dry photolysis); k：Impurity references mixture; l：Impurity 11 reference

3.2　有关物质鉴定

采用Q-TOF/MS高分辨测定各有关物质的母离子及子离子的准确质量和元素组成，并通过合成工艺路线及反应机制的分析，推定各主要有关物质的结构；主要工艺杂质（3、5、6、8、10、11、13、17、18、19和21），均进一步通过制备和对照品比对确证。结果见表2、图3和图4。

Table 2 LC-MS characteristics of midazolam related substances

No.	t_R/min	[M+H]⁺(m/z)	Ion formula	Dif./(×10^-6)	Product ions (m/z)	Origins
1	3.769	248.058 91	C₁₂H₁₁ClN₃O⁺	1.588	219，178，150，139，111，88	Dr
2	4.268	359.059 55	C₁₈H₁₃ClFN₂O₃⁺	0.628	315，297，240，222，123，95	Dr
3	6.442	344.095 83	C₁₈H₁₆ClFN₃O⁺	-0.623	315，297，274，123，109，95	Pr，Dr
4	8.441	342.080 08	C₁₈H₁₄ClFN₃O⁺	-0.919	325，311，307，278，260，211，177，116	Dr
5(A)	8.682	328.101 91	C₁₈H₁₆ClFN₃⁺	2.378	258，234，223，125，95	Pr
6(C)	8.975	304.101 13	C₁₆H₁₆ClFN₃⁺	0.264	287，246，211，109	Pr
7	8.976	358.075 49	C₁₈H₁₄ClFN₃O₂⁺	0.506	315，297，235，222，123，95	Dr
8(B)	9.202	330.116 87	C₁₈H₁₈ClFN₃⁺	0.273	301，273，260，211，166，109，95	Pr
9	9.866	342.081 55	C₁₈H₁₄ClFN₃O⁺	3.378	307，272，260，240，265，225	Dr
10(D)	10.183	342.080 49	C₁₈H₁₄ClFN₃O⁺	0.280	322，320，281，253，204	Pr, Dr
11	10.246	292.124 00	C₁₈H₁₅FN₃⁺	-1.548	250，231，210，183，155，128	Pr
12	10.788	342.080 78	C₁₈H₁₄ClFN₃O⁺	1.127	325，297，262，234，109	Dr
13(E)	11.976	348.054 89	C₁₆H₁₂ClFN₃O₃⁺	0.909	330，302，287，227，123	Pr
14	12.477	289.054 47	C₁₅H₁₁ClFN₂O⁺	2.161	261，259，226，206，165，140，109	Dr
15	12.638	326.085 55	C₁₈H₁₄ClFN₃⁺	0.215	297，261，243，221，201，128	Dr
16	14.057	343.064 69	C₁₈H₁₃ClFN₂O₂⁺	0.816	315，297，246，150，123，109，95	Dr
17(F)	14.566	328.102 03	C₁₈H₁₆ClFN₃⁺	2.744	297，258，222，205，109，95	Pr
API	15.194	326.085 54	C₁₈H₁₄ClFN₃⁺	0.185	291，249，244，223，209	API
18(G)	16.273	308.096 07	C₁₈H₁₅ClN₃⁺	3.792	273，266，226，191，169，155，129	Pr
19	18.267	332.059 25	C₁₆H₁₂ClFN₃O₂⁺	-1.231	315，287，271，259，236，163，109	Pr
20	19.166	273.059 55	C₁₅H₁₁ClFN₂⁺	2.268	256，236，221，201	Dr
21(H)	19.928	326.085 76	C₁₈H₁₄ClFN₃⁺	0.860	299，258，250，222，189，128	Pr
22	20.239	273.059 51	C₁₅H₁₁ClFN₂⁺	2.122	177，150，136	Dr

注：

Pr:Process related substance;Dr:Degradation product

Figure 3 Chemical structures of midazolam related substances 1-22

Figure 4 MS/MS spectra of midazolam and its related substances [M+H]⁺ ionsAPI(m/z 326); 1(m/z 248); 2(m/z 359); 3(m/z 344); 4(m/z 342); 5(m/z 328); 6(m/z 304); 7(m/z 358); 8(m/z 330); 9(m/z 342); 10(m/z 342); 11(m/z 292); 12(m/z 342); 13(m/z 348); 14(m/z 289); 15(m/z 326); 16(m/z 343); 17(m/z 328); 18(m/z 308); 19(m/z 332); 20(m/z 273); 21(m/z 326); 22(m/z 273)

ESI-Q-TOF/MS测得咪达唑仑［M+H］⁺的准确质量为326.085 54，与离子式C₁₈H₁₄ClFN₃⁺相应；其主要特征碎片离子（图5）m/z 291.120 3（C₁₈H₁₄FN₃^+⋅）249.085 0（C₁₆H₁₀FN₂⁺）、244.035 7（C₁₄H₈ClFN⁺）、223.081 3（C₁₅H₁₀FN^+⋅）和209.065 2（C₁₄H₈FN^+⋅），分别是［M+H］⁺脱去一个Cl原子、同时脱氯与咪唑环裂解脱乙烯亚胺（CH₂=C=NH）、脱2-甲基咪唑基、脱氯并七元杂环开环重排、或同时脱氯与2-甲基咪唑基单元产生。咪达唑仑的二级质谱和裂解途径分析对解析确证其有关物质结构具有参考意义。

Figure 5 Midazolam [M+H]⁺ion MS/MS fragmentation pathways

3.2.1　工艺杂质的结构鉴定

根据合成工艺、潜在副产物分析^［

13，15］和对照品比对，确证鉴定各工艺有关物质的结构及其来源。

有关物质3是成品中存在的特征杂质，并且在强制降解的多个试验条件下极易产生，所以有关物质3是咪达唑仑的关键工艺杂质和关键质量指标成分。ESI-Q-TOF/MS测得有关物质3［M+H］⁺的准确质量344.095 83，与离子式C₁₈H₁₆ClFN₃O⁺相应，与咪达唑仑元素组成相比，多1分子水；据文献报道^［

16］，咪达唑仑制成盐酸盐时，处于酸性环境中，结构中亚胺基会发生可逆性水解开环，有关物质3是该水解产物。其主要特征碎片（图6）离子m/z 315.072 0（C₁₇H₁₃ClFN₂O⁺）、274.048 9（C₁₅H₁₀ClFNO⁺）和123.025 8（C₇H₄FO⁺）均与分子结构中含有二苯酮单元特征相应，分别与［M+H］+脱亚胺（CH₂=NH）、咪唑环裂解乙烯亚胺（CH₂=C=NH）、或二苯酮基断裂相应。确证有关物质3是咪达唑仑结构中苯并二氮杂䓬环上亚胺基水解开环，而形成的二苯酮胺降解或工艺杂质。

Figure 6 RS 3 [M+H]⁺ion MS/MS fragmentation pathways

有关物质10主要在氧化破坏条件下产生，［M+H］⁺的准确质量342.080 49，与离子式C₁₈H₁₄ClFN₃O+相应，与咪达唑仑元素组成相比，多一个O元素。MS及对照品比对确证鉴定有关物质10为咪达唑仑的苯并二氮杂䓬环上亚胺的N氧化副产物（USP咪达唑仑杂质D），其二级质谱碎片离子（图7）均确证相应结构。

Figure 7 RS 10 [M+H]⁺ion MS/MS fragmentation pathways

有关物质21主要在高温湿法条件下产生，［M+H］⁺的准确质量为326.085 76，与离子式C₁₈H₁₄ClFN₃⁺相应，与咪达唑仑相对分子质量一致，两者互为同分异构体。MS及对照品比对确证鉴定有关物质21是咪达唑仑合成中七元杂环上双键位置异构的副产物（USP 咪达唑仑杂质H），其二级质谱碎片离子（图8）均确证相应结构。

Figure 8 RS 21 [M+H]⁺ion MS/MS fragmentation pathways

有关物质5和17［M+H］⁺的准确质量分别为328.101 91和328.102 03，均与离子式C₁₈H₁₆ClFN₃⁺相应，比咪达唑仑相对分子质量多2；有关物质8［M+H］⁺的准确质量为330.116 87，与离子式C₁₈H₁₈ClFN₃⁺相应，比咪达唑仑相对分子质量多4；结合咪达唑仑合成工艺^［

15］，MS及对照品比对确证鉴定。有关物质5是咪达唑仑合成过程中的一个中间体（图1，USP 咪达唑仑杂质A），有关物质8和17是咪达唑仑发生不同程度还原，而产生的副产物（USP咪达唑仑杂质B和F）。

有关物质6［M+H］⁺的准确质量为304.101 13，与离子式C₁₆H₁₆ClFN₃⁺相应，其碎片离子287.079 5（C₁₆H₁₃ClFN₂⁺）比［M+H］⁺少17，与NH₃相应；结合咪达唑仑合成工艺^［

15］，MS及对照品比对，确证鉴定有关物质6是咪达唑仑合成过程中的一个中间体（图1，USP咪达唑仑杂质C）。

有关物质11［M+H］⁺的准确质量为292.124 00，与离子式C₁₈H₁₅FN₃⁺相应，与咪达唑仑元素组成相比，少1个Cl元素，多1个H元素，其一级质谱结果中也未出现Cl的同位素峰，说明该杂质与咪达唑仑结构中的Cl被H替代相应。MS及对照品比对，确证鉴定有关物质11为咪达唑仑的非氯代副产物。

有关物质13［M+H］⁺的准确质量为348.054 89，与离子式C₁₆H₁₂ClFN₃O₃⁺相应，与咪达唑仑元素组成相比，少两个C元素，多3个O元素；其特征碎片m/z 330.046 0（C₁₆H₁₀ClFN₃O₂⁺）、302.071 7（C₁₆H₁₂ClFN₂O^+⋅）、287.039 6（C₁₅H₉ClFN₂O⁺），分别与［M+H］⁺离子丢失1分子H₂O、1分子NO₂和硝基亚甲基碎片相应；确证分子结构中含有硝基取代。结合咪达唑仑合成工艺^［

15］，MS及对照品比对，确证有关物质13是咪达唑仑合成过程中的一个中间体（图1，USP 咪达唑仑杂质E）。

有关物质18［M+H］⁺的准确质量为308.096 07，与离子式C₁₈H₁₅ClN₃⁺相应，与咪达唑仑元素组成相比，少1个F元素多1个H元素。MS及对照品比对，确证有关物质18为咪达唑仑非氟代的副产物（USP咪达唑仑杂质G）。

有关物质19［M+H］⁺的准确质量为332.059 25，与离子式C₁₆H₁₂ClFN₃O₂⁺相应，与有关物质13元素组成相比，少一个O元素；结合咪达唑仑合成工艺^［

15］，MS及合成对照品比对，确证有关物质19是咪达唑仑合成过程中的中间体（图1）。

3.2.2　降解杂质的结构鉴定

通过有关物质HPLC定位及质谱特征分析，测得各降解杂质母离子的准确质量和离子组成及它们的二级质谱特征碎片（图4），结合咪达唑仑裂解规律，对强制降解样品中产生的有关物质进行综合分析，鉴定它们的结构。

有关物质1和2是咪达唑仑的特征氧化降解杂质，反相色谱保留显著降低，表明极性显著增大。有关物质1［M+H］⁺的准确质量为248.058 91，与离子式C₁₂H₁₁ClN₃O⁺相应，与咪达唑仑被氧化脱去2-氟苯基单元的羟基取代转化物相应；其主要特征碎片（图9）离子m/z 219.035 8（C₁₁H₈ClN₂O⁺）、178.006 0（C₉H₅ClNO⁺）和150.014 7（C₈H₅ClN⁺）分别与［M+H］⁺开环裂解脱去亚胺（CH₂=NH）、进一步咪唑环裂解（CH₂=C=NH）、或咪唑环和酰基亚胺（CHO-N=CH₂）同时脱去相应，确证了该杂质结构中仍然保留了与咪达唑仑相应的咪唑环并苯并二氮杂䓬环基本结构特征。同时测得m/z 138.997 1（C₇H₄ClO⁺）和111.002 4（C₆H₄Cl⁺）离子，它们进一步证明了咪达唑仑被氧化脱去2-氟苯基单元后，羟基取代亚胺转化成内酰胺的结构特征。

Figure 9 RS 1 [M+H]⁺ion MS/MS fragmentation pathways

有关物质2 ［M+H］⁺的准确质量为359.059 55，与离子式C₁₈H₁₃ClFN₂O₃⁺相应，与咪达唑仑元素组成相比，多3O、少NH；其主要特征碎片（图10）离子m/z 315.071 6（C₁₇H₁₃ClFN₂O⁺）、297.062 2（C₁₇H₁₁ClFN₂⁺）和123.025 2（C₇H₄FO⁺）均与有关物质3的特征碎片一致，表明其分子结构中也含有二苯酮单元。又m/z 315离子与其［M+H］⁺脱去羧基单元相应。所以，鉴定有关物质2是咪达唑仑结构中苯并二氮杂䓬环上亚胺基发生水解开环、并氧化成羧酸，而生成的二苯酮类降解杂质。其极性明显增大，反相色谱保留显著减弱。

Figure 10 RS 2 [M+H]⁺ion MS/MS fragmentation pathways

有关物质7也是氧化降解杂质，并在湿法加热和光照条件下产生，其［M+H］⁺的准确质量为358.075 49，与离子式C₁₈H₁₄FClN₃O₂⁺相应，与咪达唑仑元素组成相比，多2个O元素；其主要特征碎片（图11）离子m/z 315.074 1（C₁₇H₁₃ClFN₂O⁺）、297.060 0（C₁₇H₁₁ClFN₂⁺）和123.025 5（C₇H₄FO⁺）均与有关物质3的特征碎片一致，表明其分子结构中也含有二苯酮单元。又m/z 315离子与其［M+H］⁺脱去酰胺（O=C=NH）单元相应。所以，鉴定有关物质7是咪达唑仑苯并二氮杂䓬环上亚胺基发生水解开环、并氧化成酰胺，而生成的二苯酮类降解杂质。

Figure 11 RS 7 [M+H]⁺ion MS/MS fragmentation pathways

有关物质4和9均主要为氧化降解杂质，有关物质12主要在湿法光照条件下降解产生，三者［M+H］⁺的准确质量分别为342.080 08、342.081 55和342.080 78，均与离子式C₁₈H₁₄ClFN₃O⁺相应，与咪达唑仑元素组成相比，均多一个O元素，并都与咪达唑仑的氧化副产物10互为同分异构体。所以，在咪达唑仑结构中，存在多个易被氧化降解的位点，潜在多种氧化产物结构，需要结合二级质谱区别确证。

有关物质4的主要特征碎片离子（图12）m/z 325.068 3（C₁₈H₁₁ClFN₂O⁺）、311（C₁₇H₉ClFN₂O⁺）、307.116 2（C₁₈H₁₄FN₃O^+⋅）、278.112 8（C₁₇H₁₃FN³⁺）和260.035 0（C₁₄H₈ClFNO⁺），分别与［M+H］+脱NH₃、咪唑环断裂（NH₂-CH₃）、脱Cl原子、脱1分子HCl和羰基单元、或咪唑环断裂脱去相应。因此，鉴定有关物质4为咪达唑仑的甲基与咪唑亚胺双键异构，并且氮杂䓬环的CH₂被氧化而成的酰基亚胺化合物。

有关物质9的二级质谱图与有关物质4相似，也有特征碎片离子m/z 307.116 1（C₁₈H₁₄FN₃O^+⋅）、260（C₁₄H₈ClFNO⁺），推测二者具有类似的特征结构；但是，未见有关物质4特有的与［M+H］⁺脱NH₃和咪唑环断裂（NH₂-CH₃）碎片m/z 325.068 3（C₁₈H₁₁ClFN₂O⁺）和311（C₁₇H₉ClFN₂O⁺）；所以，有关物质9中的杂环氮均为叔胺状态，其特征碎片265.077 4（C₁₆H₁₀FN₂O⁺）和225.061 6（C₁₄H₈FNO^+⋅）分别与［M+H］⁺脱去一个Cl原子且咪唑环断裂脱乙烯亚胺（CH₂=C=NH）、或咪唑环与苯并二氮杂䓬环同时断裂特征相应。确证，有关物质9为咪达唑仑的咪唑环双键与氮杂䓬环异构后，再被氧化而成的酰基亚胺化合物（图12）。

有关物质12的主要特征碎片离子（图12）m/z 325.083 8（C₁₈H₁₁ClFN₂O⁺）、297.060 4（C₁₇H₁₁ClFN₂⁺）和262.092 4（C₁₇H₁₁FN₂^+⋅）分别与［M+H］⁺脱去NH₃、脱去酰胺（O=CH-NH₂）、或进一步脱去Cl原子相应，表明结构中存在内酰胺结构，且易脱去NH₃。所以鉴定有关物质12是咪达唑仑的甲基与咪唑亚胺双键异构和氮杂䓬的环亚胺的双键异构并羟基取代转化物（图12）。

Figure 12 RS 4,9,12 [M+H]⁺ions MS/MS fragmentation pathways

有关物质14是光照湿法条件的特征杂质，也是氧化降解杂质，其［M+H］⁺的准确质量为289.054 47，与离子式C₁₅H₁₁FClN₂O⁺相应，与咪达唑仑元素组成相比，多1个O元素，少C₃H₃N；其主要特征碎片（图13）m/z 261（C₁₄H₁₁ClFN₂^+⋅）和259（C₁₄H₉ClFN₂^+⋅）均与［M+H］⁺脱去羰基相应，226.093 2（C₁₄H₁₁FN₂^+⋅）与206.086 7（C₁₄H₁₀N₂^+⋅）分别为m/z 261脱去一个Cl原子、进一步脱去1分子HF而成。确证有关物质14是咪达唑仑的咪唑环氧化开环脱去，形成内酰胺的降解杂质^［

13］。

Figure 13 RS 14 [M+H]⁺ ion MS/MS fragmentation pathways

有关物质15是高温湿法降解杂质，其［M+H］⁺的准确质量326.085 55，与离子式C₁₈H₁₄N₃FCl⁺相应，与咪达唑仑及有关物质21的元素组成一致，三者互为同分异构体，这与咪达唑仑母核中多个双键易发生双键位置异构的特征相应；有关物质15的特征碎片离子（图15）m/z 297.062 2（C₁₇H₁₁FN₂⁺）、243.100 5（C₁₆H₉N₃⁺）和221.064 7（C₁₅H₈FN^+⋅）分别与［M+H］⁺脱亚胺（CH₂=NH）、脱去Cl原子及1分子HF并咪唑环裂解乙烯（CH₂=CH₂）、或同时脱氯且咪唑环裂解（CH=N-C（CH₃）=NH）相应；m/z 221.064 7（C₁₅H₈FN^+⋅）比咪达唑仑特征碎片离子223.081 3（C₁₅H₁₀FN^+⋅）少2，说明有关物质15是苯并二氮杂䓬环上为烯双键；除有关物质21外咪达唑仑双键位置异构体还存在两种（图14），相对于化合物a，化合物b更容易脱亚胺（CH₂=NH）产生m/z 297.062 2。所以，鉴定有关物质15是咪达唑仑高温条件下产生双键位置异构的化合物（图15）。

Figure 14 Possible structures of RS 15

有关物质16也是高温湿法降解特征杂质，并在湿法光照条件下产生，其［M+H］⁺的准确质量为343.064 69，与离子式C₁₈H₁₃ClFN₂O₂⁺相应；与咪达唑仑元素组成相比，多2个O元素，少NH；其主要特征碎片离子（图16）m/z 315.0775（C₁₇H₁₃ClFN₂O⁺）、297.068 5（C₁₇H₁₁ClFN₂⁺）和123.024 6（C₇H₄FO⁺）均与有关物质3的特征碎片一致，表明其分子结构中也含有二苯酮单元，又m/z 315离子与其［M+H］⁺脱去CO相应。所以，鉴定有关物质16是咪达唑仑苯并二氮杂䓬环上亚胺基水解开环，并氧化脱氨成醛，而形成的二苯酮类化合物，并通过合成对照品比对确证。

Figure 15 RS 15 [M+H]⁺ion MS/MS fragmentation pathways

Figure 16 RS 16 [M+H]⁺ion MS/MS fragmentation pathways

有关物质20和22同为氧化降解杂质，22还是湿法光照条件下的特征降解杂质，测得有关物质20和22［M+H］⁺的准确质量分别为273.059 55和273.059 51，均与离子式C₁₅H₁₁ClFN₂⁺相应，两者互为同分异构体，与咪达唑仑元素组成相比，少C₃H₃N，与咪唑环的开环重排异构化相应。

有关物质22的主要特征碎片离子（图18）m/z 177.023 2（C₉H₆ClN₂⁺），比其［M+H］⁺少96，与其结构中易发生氟苯基裂解相应，其他裂解特征均与氯苯并1，3-哌嗪特征结构相应；MS及合成对照品比对，确证有关物质22其是咪达唑仑上咪唑环断裂，同时七元杂环发生重排产生的特征光降解杂质，在氧化条件下也易生成。

有关物质20的主要特征碎片离子m/z 256.036 0（C₁₅H₈ClFN⁺）、221.065 8（C₁₅H₈FN^+⋅）和201.061 2（C₁₅H₇N^+⋅），分别为［M+H］⁺脱NH₃、进一步脱去一个Cl原子、或继续脱去1分子HF产生。推测，咪唑环的开环重排异构化有3种可能的结构（图17），其中化合物b不易脱NH₃离子，化合物c虽易脱NH₃，但其结构中含有伯氨基，极性相对较大。所以，鉴定有关物质20具有氮杂䓬的环烯单亚胺结构的化合物（图17-a，图18）。

Figure 17 Possible structures of RS 20

Figure 18 RS 20, 22 [M+H]⁺ions MS/MS fragmentation pathways

4 讨论

在建立的LC-MC联用鉴定条件下，盐酸咪达唑仑与各有关物质均得到有效的分离，共检测到22个有关物质，其中8个为工艺相关的中间体或副产物杂质：5、6、8、11、13、17、18和19；有11个为分降解产物：1、2、4、7、9、12、14、15、16、20和22；3个既是工艺杂质也是降解杂质：3、10和21。

强制降解试验表明，盐酸咪达唑仑在酸、碱条件下咪达唑仑结构中七元杂环上亚胺基易发生水解开环，生成特征有关物质3；在高温湿法条件下，容易产生咪达唑仑异构体（有关物质15、21）；在氧化、光照条件下，咪达唑仑结构中的咪唑环和苯并二氮杂䓬环上亚胺基易水解开环并氧化为二苯酮类降解杂质，或氧化为内酰胺、羟基取代转化物和N氧化杂质。因此，盐酸咪达唑仑原料药应避光、阴凉暗处密闭存储。

此外，临床上咪达唑仑常被制成糖浆剂^［

17］，并加入枸橼酸等辅料矫味，故枸橼酸也可能参与水解，生成二苯酮胺的枸橼酸酰胺潜在制剂特征有关物质S1，其脱H₂O则形成有关物质S2（图19），它们均已经通过杂质谱分析、MS及对照品比对确证。

Figure 19 Synthesis of the RS S1 and S2

通过LC-MS技术对盐酸咪达唑仑有关物质进行分析研究，探讨了其杂质来源和降解途径，为其贮藏条件制定、工艺优化提供了依据，为更好的质量控制提供了参考，为稳定性研究奠定了基础^［

18-19］。

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色谱-质谱联用技术鉴定盐酸咪达唑仑的有关物质

摘要

关键词

1 材 料

1.1 试 剂

1.2 仪 器

2 方 法

3 结 果

3.1 有关物质检查

3.2 有关物质鉴定

4 讨 论