摘要
建立一种基于固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱(SPE-UPLC-MS/MS)同时检测污水中多种滥用药物及其代谢物的定量分析方法。样品在pH 2条件下过滤后加入内标,利用Oasis Prime MCX固相萃取柱、甲醇淋洗溶剂4 mL、5%氨水-乙腈洗脱溶剂4 mL和0.1%甲酸水溶液复溶溶剂进行固相萃取,采用色谱柱ZORBAX Eclipse Plus C18进行色谱分析,流动相0.1%甲酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱;采用ESI离子源正离子方式,多反应监测模式(MRM)进行定量分析。所有待测物在各自的标准曲线范围内线性关系良好(r≥0.993 2),定量限为1 ng/L(除苯丙胺为2.5 ng/L),提取回收率范围为82.13%~99.96%,日内与日间精密度均小于9.43%。该方法准确可靠、重复性好,适用于污水中多种滥用药物及其代谢物的定量检测,为实时监测药品滥用提供了分析手段。
关键词
近年来,全球毒品滥用问题不断扩大,毒品危害日益严重,影响人类健康,造成严重的社会危机。联合国毒品和犯罪办公室发布的2019年世界毒品问题报告显示,全球3 500万人患有药物滥用障碍,国际毒品滥用形势严
一种基于污水流行病学的分析方法由Daughton
本研究根据国内外已有的污水分析
13种待测物及其氘代内标储备液均购于美国Cerilliant公司,包括6-单乙酰吗啡(6-MAM)、苯丙胺(AM)、可替宁(COT)、可卡因(COC)、苯甲酰爱康宁(BZE)、氯胺酮(KET)、3,4-亚甲基二氧基苯丙胺(MDA)、3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、甲基苯丙胺(MAM)、甲卡西酮(MC)、吗啡(MOR)、去甲氯胺酮(NK)、可待因(COD)以及6-MAM-D3、AM-D5、COT-D3、COC-D3、BZE-D3、KET-D4、MDA-D5、MDMA-D5、MAM-D5、MC-D3、MOR-D3、NK-D4、COD-D6。乙腈、甲醇(色谱纯,美国TEDIA公司);其余试剂均为市售分析纯;超纯水由实验室制备。
色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (50 mm×2.1 mm,1.8 μm);流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为乙腈;流速为0.3 mL/min;柱温为40 ℃;进样室温度为4 ℃;进样量为5 μL;梯度洗脱程序:0~6 min, B相比例从5%升至25%; 6~6.2 min, B相比例从25%升至100%; 6.2~ 8 min, B相比例保持100%; 8~8.1 min, B相比例从100%降至5%;8.1~11 min, B相比例保持5%以平衡色谱柱。
离子源为电喷雾离子源(ESI 源);检测方式为ES
6-MAM: 6-Monoacetylmorphine; AM: Amphetamine; COT: Cotinine; COC: Cocaine; BZE: Benzoylecognine; KET: Ketamine; MDA: 3, 4-Methylenedioxyamphetamine; MDMA: 3, 4-Methylenedioxymethamphetamine; MAM: Methamphetamine; MOR: Morphine; NK: Norketamine; COD: Codeine

Figure 1 Typical chromatogram of 12 illicit drugs and cotinine
一级储备液:分别取13种待测物的1 mg/mL标准品溶液1 mL于10 mL量瓶中,用甲醇或乙腈溶解并稀释至刻度,配制成含各待测物100 μg/mL的一级储备液;分别取13种氘代内标的100 μg/mL标准品溶液1 mL于10 mL量瓶中,用甲醇或乙腈溶解并稀释至刻度, 配制成含13种氘代内标的 10 μg/mL的一级储备液。
甲醇混合溶液:取AM-D5、MAM-D5、MDA-D5、MDMA-D5、BZE-D3、MOR-D3、KET-D4、NK-D4和COD-D6的一级储备液各1 mL混合加入20 mL量瓶中,甲醇稀释至刻度,得含各内标物500 ng/mL的甲醇混合溶液。
乙腈混合溶液:取MC-D3、6-MAM-D3和COC-D3的一级储备液各1 mL混合加入20 mL量瓶中,乙腈稀释至刻度,得含各内标物500 ng/mL的乙腈混合液。
工作内标溶液:取甲醇混合溶液和乙腈混合溶液各1 mL,混合加入20 mL量瓶中,甲醇稀释至刻度,得25 ng/mL的工作内标溶液。
COT-D3内标溶液:取COT-D3的一级储备液100 μL于20 mL量瓶中,甲醇稀释至刻度,得500 ng/mL COT-D3内标溶液。
所取水样用盐酸调至pH2,-20 ℃条件下冷冻保存,待分析时先融化,然后进行分析。分析前所有水样经GF/
选用Oasis Prime MCX固相萃取柱进行操作。样品50 mL以4 mL/min的速度过柱上样;上样完成后先用甲醇4 mL淋洗;最后用5%的氨水-乙腈溶液4 mL洗脱(流速1 mL/min);50 ℃条件下在真空旋转浓缩仪中挥至剩余约20 μL,用0.1%甲酸水溶液80 μL复溶,涡旋3 min;4 ℃,13 000 r/min 条件下离心取上清液进UPLC-MS/MS分析。
取13种待测物的一级储备液适量,用甲醇逐级稀释,配制成浓度范围为0.5~250 ng/mL的标准曲线混合溶液(除AM浓度范围为1.25~625 ng/mL)和浓度范围为0.5~2 500 ng/mL的COT标准曲线溶液。取不同浓度的标准曲线混合溶液、COT标准曲线溶液、工作内标溶液、COT-D3内标溶液各100 μL,分别用纯水50 mL配制成模拟样品,按“2.5”项下操作后进样分析,以待测物浓度(ng/mL)为横坐标(X),待测物的峰面积为纵坐标(Y),用加权最小二乘法(权重系数:1/
取0.5 ng/mL的标准曲线混合溶液(AM质量浓度为1.25 ng/mL)、0.5 ng/mL的COT标准曲线溶液、工作内标溶液、COT-D3内标溶液各100 μL,分别用纯水50 mL配制成定量下限(LLOQ)模拟样品,按“2.5”项下操作后进样分析。结果表明,当信噪比S/N大于10时,AM的定量下限为2.5 ng/L,其他物质的定量下限为 1 ng/L。同时使用回归曲线偏差法估算各待测物的检测限(LOD)和定量限(LOQ),结果见
取13种待测物的一级储备液适量,用甲醇逐级稀释,配制成质量浓度分别为1,25,200 ng/mL的混合储备液(除AM质量浓度分别为2.5, 62.5, 500 ng/mL)和质量浓度分别为25, 200,2 000 ng/mL的COT储备液。取上述不同浓度的混合储备液、COT储备液、工作内标溶液、COT-D3内标溶液各100 μL,分别用混合污水基质50 mL配制成低、中、高浓度的质控样品,按“2.5”项下操作,每一浓度进行6样本分析,得各待测物的峰面积;对照组另取污水基质50 mL,除内标用初始比例流动相溶液代替外,其余按“2.5”项下操作,向获得的上清液中加入相应浓度的混合储备液、COT储备液、工作内标溶液和COT-D3内标溶液,振摇混匀,分别制备成与上述浓度相同的低、中、高样品。依法测定,每个浓度3样本分析,得各待测物的峰面积。以每一浓度两种处理方法峰面积之比计算提取回收率并求得3种浓度的平均值,结果见
按“2.6.2”项下的方法配制低、中、高3个浓度的质控样品,按“2.5”项下操作,每一浓度进行6样本分析,连续测定3 d,求得各待测物的准确度与精密度的平均值。结果见
按“2.6.2”项下的对照组方法操作,每个浓度3样本分析,得各待测物的峰面积;同时另取相应浓度的混合储备液,COT储备液、工作内标溶液和COT-D3内标溶液各100 µL溶于5% 氨水-乙腈溶液4 mL中,涡旋混匀,50 ℃条件下在真空旋转浓缩仪中挥至剩余约20 μL,用0.1%甲酸水溶液80 μL复溶,涡旋3 min;4 ℃,13 000 r/min条件下离心取上清液进UPLC-MS/MS分析,每一浓度3样本分析,得各待测物的峰面积。以每一浓度两种处理方法的峰面积比值计算基质效应并求得平均值,结果见
取“2.6.2”项下的3种浓度的混合储备液、COT储备液、工作内标溶液、COT-D3内标溶液各100 μL, 用纯水50 mL配制成低、 中、 高 3种浓度的QC样品。分别在4 ℃进样室放置24 h、室温放置24 h和经3次冻融循环后,按“2.5”项下操作,每一浓度进行3样本分析。结果表明,除低浓度吗啡和甲基苯丙胺外,其余待测物水样品在 4 ℃条件下放置24 h稳定;除低浓度甲基苯丙胺外,其余待测物水样品在室温条件下放置24 h稳定且经3次冻融循环后稳定。
将本研究建立的SPE-UPLC-MS/MS法应用于实际样品的检测,从全国10个城市采集的污水样品按“2.4”项和“2.5”项操作后分析测定。各待测物的浓度检测结果如
S1-S10: 10 wastewater samples from different cities
采用3种不同色谱柱进行考察,分别为色谱柱1: Shiseido Capcell PAK C18(2.0 mm×150 mm,5 μm);色谱柱2:Shiseido Capcell PAK C18 (3.0 mm×75 mm,3 μm)和色谱柱3:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (2.1 mm×50 mm,1.8 μm)。实验结果表明色谱柱1的柱长较长,相同梯度洗脱条件下需更长时间才能完全洗脱,且峰形较短柱更宽;色谱柱2的大部分待测物的峰形良好,可在较短时间内完成各化合物的分离洗脱,但待测物之一的COT及其氘代内标峰出现分叉干扰且无法改变;色谱柱3的所有待测物的峰形良好,可在短时间内完成各化合物的分离洗脱。故色谱柱选择Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18。
根据各待测物的性质及pKa,采用SEP-PAK VAC C18、Oasis Prime HLB、Oasis Prime MCX 3种不同固相萃取柱,以及甲醇、乙腈、5%氨水-甲醇溶液、5%氨水-乙腈溶液4种不同洗脱溶剂分别进行考察。实验结果表明,SEP-PAK VAC C18柱上利用5%氨水-甲醇溶液可将待测组分洗脱出,但萃取效果较差;Oasis Prime HLB柱上利用甲醇和乙腈均可将待测组分洗脱出,但萃取效果较差;Oasis Prime MCX柱上利用5%氨水-甲醇溶液和5%氨水-乙腈溶液均可将待测组分洗脱出并获得良好的回收率,但甲醇作为洗脱液,挥干所需时间远远长于乙腈。故选用Oasis Prime MCX柱为方法用固相萃取柱且5%氨水-乙腈溶液为方法洗脱溶剂。
3.2.2 洗脱溶剂体积的选择 采用2,4,8 mL 3种不同体积的洗脱溶剂进行考察。实验结果表明,2 mL洗脱溶剂无法将待测物完全洗脱;4 mL洗脱溶剂能将各待测物完全洗脱且峰面积较大; 8 mL洗脱溶剂效果与4 mL无明显差别。考虑到减少有机溶剂的污染,故选用4 mL为方法用洗脱溶剂体积。
3.2.3 淋洗溶剂的选择
采用超纯水、pH2的超纯水、甲醇和2%甲酸-甲醇溶液4种不同的淋洗溶剂进行考察。实验结果表明,超纯水及pH2的超纯水与有机溶剂淋洗无明显差别,但会在洗脱过程中带入水分导致最终挥干时间增加;甲醇及2%甲酸-甲醇溶液二者淋洗结果无明显差别。考虑到节省时间成本,故选择甲醇为方法用淋洗溶剂。
本研究建立了一种同时检测污水中多种滥用药物及其代谢物的固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱定量分析方法。该方法操作简单、定量限低、重现性好,已成功应用于国内10个城市的污水实际样品检测,具有较高的准确度和可靠性。公安部门基于此方法进行毒情监测,可以准确掌握毒品滥用信息,预防和打击毒品犯罪,为全面开展各项禁毒工作提供了重要的技术支持和数据支撑。
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