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ALK5抑制剂的设计、合成及其生物学活性评价

  • 许涛 1,2
  • 王小伟 2
  • 刘晓蓉 2
  • 王亚洲 2
  • 李志裕 1
1. 中国药科大学药学院，南京 210009； 2. 南京圣和药业股份有限公司，南京 211100

中图分类号： R914； R965

最近更新：2020-09-17

DOI：10.11665/j.issn.1000-5048.20200408

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EN 引
目录contents

摘要

以ALK5抑制剂LY-3200882作为先导化合物，利用生物电子等排和构象限制等药物设计策略，结合分子对接技术，设计并合成了10个结构新颖的化合物，其结构经1H NMR、HR-MS表征。体外活性筛选结果显示，大多数化合物具有良好的激酶抑制活性。其中，化合物B4表现出显著优于LY-3200882的ALK5抑制活性(IC50 = 1.4 nmol/L vs 41.1 nmol/L)，同时对NIH3T3细胞中TGFβ-ALK5-SMAD2/3信号通路具有良好的抑制活性(IC50 = 14.2 nmol/L)。进一步研究表明，化合物B4的药代动力学性质良好，口服暴露量及生物利用度满足成药性要求，值得进一步开发。

转化生长因子家族配体包括TGF-βs、抑制素、激活素、骨形成蛋白、生长和分化因子，在细胞增殖、分化、凋亡、迁移、细胞外基质表达和免疫应答等众多过程中都发挥着重要作用[

1-2]。TGF-β活化后，在细胞表面与TGF-β RII结合并使其激活，活化的TGF-β RII募集并结合TGF-β RI (ALK5)形成异源三聚体复合物，通过激活Smad2/3将信号传导至胞浆，Smad2/3再与Smad4结合形成复合物，然后转入细胞核以调节各种靶基因的转录[3]。除了经典的Smad途径外，TGF-β还可激活非Smad途径，如促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路等[4]。

以往研究报道，在乳腺癌、结直肠癌、肝细胞癌等多种肿瘤类型中，TGF-β及其信号通路高表达[

5]。TGF-β信号转导在介导肿瘤微环境的原发性改变和促进肿瘤细胞转移、侵袭和免疫逃逸过程中发挥重要作用[6-7]。作为TGF-β信号通路中的重要节点蛋白，ALK5是治疗TGF-β信号转导异常相关疾病的理想靶标，也是目前针对TGF-β信号通路开发小分子抑制剂的主要靶标。

目前共有6个ALK5小分子抑制剂进入临床研究阶段，其中公开结构的有3个(图1)。LY-3200882是礼来公司开发的新一代ALK5抑制剂，通过ATP竞争结合位点抑制ALK5激酶活性，阻断TGF-β与其受体结合。LY-3200882是一种强效的ALK5激酶抑制剂(IC50 = 90 nmol/L)，在多个实验动物肿瘤模型中也表现出显著的抗肿瘤活性，目前正处于实体瘤治疗的Ⅱ期临床试验[

8]。

Figure 1 ALK5 inhibitors in clinical phase

为了寻找新型ALK5激酶抑制剂，本研究选取LY-3200882作为先导化合物，通过分析LY-3200882与ALK5蛋白的作用方式(图2)，发现母核C区的吡啶氮原子作为氢键受体与激酶铰链区His283骨架的NH之间形成一个关键的氢键作用，在吡唑环所处的选择性口袋中，存在一个水分子介导的氢键作用。以往研究报道，这两个氢键相互作用分别对化合物的ALK5激酶抑制活性和p38 MAPK选择性至关重要[

9]。

Figure 2 Proposed binding mode of LY-3200882 (pdb code: 2wou)

根据以上分析，对活性起关键作用的母核C区予以保留，利用生物电子等排、构象限制等策略，结合分子对接技术，设计了两类结构新颖的化合物(图3)。首先，通过改造处在溶剂区的侧链得到A系列化合物，探索理化性质对抑制活性的影响，初步确定A区优势基团，进而改造另一端侧链得到B系列化合物，以期筛选出活性和成药性更优的化合物。

Figure 3 Molecular design based on the structure of LY-3200882

1 合成路线

目标化合物的合成如路线1所示。化合物1与2-氯吡啶-4-醇在DMF中用碳酸钾为碱反应得到化合物2，再与DMF-DMA反应形成化合物3，经水合肼关环生成化合物4，随后与烷基化试剂环丙基硼酸在Chan-Lam偶联条件下反应得到化合物5，最后和相应的胺经Buchwald-Hartwig偶联得到目标化合物。

Scheme 1 Synthetic route of the target compounds

2 实验部分

2.1　仪器与试剂

Bruker Avance Ⅲ HD 400 MHz型核磁共振仪（德国Bruker公司，TMS为内标）； Q Exactive高分辨质谱仪（美国Thermo公司）； MP70型熔点仪（瑞士Mettler-Toledo公司）；Waters e2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；所用化学试剂均为市售化学纯或分析纯产品，一般均不经纯化处理直接使用。

ALK5激酶（Carna公司，批号 09-141）；Bright-Glo Luciferase assay system（美国Promega公司）；Luc-Smad2/3-NIH3T3小鼠成纤维细胞，由中国药科大学徐晓军研究员实验室馈赠。

雄性BALB/c小鼠，体重(18~22 g)，购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(苏)2016-0010。

2.2　化学合成

2-((2-氯吡啶-4-基)氧基)-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙-1-酮(2)

氩气保护下，将化合物1 (1.45 g, 7.0 mmol)的无水DMF(5 mL)溶液加入到2-氯-4羟基吡啶(0.91 g, 7.0 mmol)，碳酸钾(1.48 g, 14.0 mmol)和无水DMF(20 mL)的混合物中，升温至90 ℃反应2 h。降至室温，加入饱和食盐水，乙酸乙酯萃取，无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂得红色油状物1.47 g，收率82%，ESI-MS(m/z):257.1 [M+H]+。

(E)-2-((2-氯吡啶-4-基)氧基)-3-(二甲基氨基)-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)丙-2-烯-1-酮(3)

将化合物2(1.47 g，5.74 mmol)，1，1-二甲氧基三甲胺(3.24 mL，24.4 mmol)加热至100 ℃回流反应2 h。冷却，加入乙酸乙酯，饱和食盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，旋干溶剂得棕色油状物1.78 g，收率99%，ESI-MS(m/z):312.0 [M+H]+。

2-氯-4-((3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)氧基)吡啶(4)

将化合物3(1.78 g，5.74 mmol)溶于醋酸溶液60 mL中，冰浴下用恒压滴液漏斗加入水合肼(3.0 g，60.0 mmol)，室温反应过夜。加入乙酸乙酯，饱和碳酸氢钠溶液洗涤，无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂得棕色粗品1.05 g，无需纯化，直接用于下一步，ESI-MS (m/z):281.1[M+H]+。

2-氯-4-((1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)氧基)吡啶(5)

将2,2′-联吡啶(0.70 g，4.4 mmol)，乙酸铜(0.80 g，4.4 mmol)和1，2-二氯乙烷(10 mL)于75 ℃反应25 min，冷却至室温。加入化合物4(1.12 g，4.0 mmol)，环丙基硼酸(0.69 g，8.0 mmol)和碳酸钠(0.85 g，8.0 mmol)，氧气氛围下，75 ℃反应2 h。冷却至室温，加入饱和食盐水，二氯甲烷萃取，无水Na2SO4干燥，减压除去溶剂，柱色谱纯化得黄色固体1.10 g，收率86%；mp：112~114 ℃。ESI-MS(m/z):320.1[M+H]+。

4-((1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)氧基)-N-(2-(三氟甲基)吡啶-4-基)吡啶-2-胺(A1)

氩气保护下，将化合物5(192 mg，0.60 mmol)，2-三氟甲基-4-氨基吡啶(119 mg， 0.78 mmol)， 4，5-双二苯基膦-9，9-二甲基氧杂蒽(69 mg， 0.12 mmol)，醋酸钯(13.5 mg，0.06 mmol)，碳酸铯 (293 mg，0.90 mmol)溶于1，4-二氧六环15 mL，加热至100 ℃反应过夜。冷却，加入饱和食盐水，二氯甲烷萃取，无水Na2SO4干燥，旋干溶剂，制备HPLC纯化得白色固体85 mg，收率31%；mp：168~170 ℃；纯度96.7%； 1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δ: 9.96(1H，s，pyrazole-H)，8.45(1H，d，J=5.4 Hz，pyridine-H)，8.25(1H，s，NH)，8.22(1H，d，J=5.7 Hz，pyridine-H)，7.90(1H，s，pyridine-H)，7.80(1H，d，J=4.4 Hz，pyridine-H)，6.70(1H，d，J=4.7 Hz，pyridine-H)，6.40(1H，s，pyridine-H)，3.83(2H，d，J=11.1 Hz，OCH2)，3.69(1H，s，CH)，3.30(2H，d，J=13.3 Hz，OCH2)，2.72(1H，m，CH)，1.67(4H，s，2-CH2)，1.06(2H，s,CH2)，0.96(2H，d，J=6.0 Hz，CH2)；HR-MS(ESI) for C22H22F3N5O2 [M+H]+ : Calcd. 446.179 8; Found 446.179 2。

4-(4-((4-((1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)吡啶-2-基)-2-甲基丁-3-炔-2-醇(A2)

制备方法同化合物A1，将2-三氟甲基-4-氨基吡啶换成4-(4-氨基吡啶-2-基)-2-甲基丁-3-炔-2-醇，得白色固体25 mg，收率18%；mp: 110~112 ℃；纯度92.8%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δ:9.60(1H，s，pyrazole-H)，8.23(1H，d，J=5.5 Hz，pyridine-H)，8.18(1H，d，J=5.7 Hz，pyridine-H)，7.89(1H，s，pyridine-H)，7.89(1H，s，NH)，7.46(1H，d，J=4.5 Hz，pyridine-H)，6.64(1H，d，J=4.6 Hz，pyridine-H)，6.36(1H，s，pyridine-H)，5.57(1H，s，OH)，3.83(2H，d，J=11.1 Hz，OCH2)，3.67(1H，m，CH)，3.29(2H，s，OCH2)，2.86~ 2.66(1H，m，CH)，1.66(4H，s，2-CH2)，1.48(6H，s，2-CH3)，1.05(2H，s，CH2)，0.99~0.91(2H，m，CH2)；HR-MS(ESI) for C26H29N5O3 [M+H]+: Calcd.460.234 3; Found 460.233 6。

N-(2-(1H-吡唑-4-基)吡啶-4-基)-4-((1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基基)氧基)吡啶-2-胺(A3)

制备方法同化合物A1，将2-三氟甲基-4-氨基吡啶换成2-(1H-吡唑-4-基)吡啶-4-胺，得淡黄色固体65 mg，收率33%；mp: 111~113 ℃；纯度97.7%； 1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δ: 13.02(1H，s，NH)，9.49(1H，s，pyrazole-H)，8.24(1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H)，8.18(1H，d，J=5.7 Hz，pyridine-H)，8.04(2H，s，pyrazole-H)，7.88(1H，s，NH)，7.85(1H，s，pyridine-H)，7.51(1H，d，J=5.3 Hz，pyridine-H)，6.61(1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H)，6.39(1H，s，pyridine-H)，3.83(2H，d，J=11.3 Hz，OCH2)，3.75~3.61(1H， m， CH)， 3.33(2H， d， J=4.2 Hz，OCH2)，2.88~2.64(1H，m，CH)，1.67(4H，s，2-CH2)，1.03(2H，s，CH2)，0.96(2H，m，CH2)；HR-MS(ESI) for C24H25N7O2 [M+H]+: Calcd. 444.214 2; Found 444.213 3。

2-(2-(4-((4-((1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)吡啶-2-基)苯基)丙-2-醇(A4)

制备方法同化合物A1，将2-三氟甲基-4-氨基吡啶换成2-(2-(4-氨基吡啶-2-基)苯基)丙-2-醇，得白色固体117 mg，收率67%；mp: 195~197 ℃；纯度94.8%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δ: 9.61(1H，s，pyrazole-H)，8.38(1H，d，J=5.5 Hz，pyridine-H)，8.20(1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H)，8.14(1H，s，Ar-H)，7.92(1H，s，NH)，7.90(2H，s，Ar-H)，7.66(1H，d，J=5.3 Hz，Ar-H)，7.58(2H，d，J=7.8 Hz，pyridine-H)，6.63(1H，d，J=5.7 Hz，pyridine-H)，6.41(1H，s，pyridine-H)，5.09(1H，s，OH)，3.84(2H，d，J=11.2 Hz，OCH2)，3.68(1H，m，CH)，3.33(2H，m，OCH2)，2.75(1H，m，CH)，1.69(4H，s，2-CH2)，1.47(6H，s，2-CH3)，1.06(2H，s，CH2)，0.96(2H，m，CH2)；HR-MS(ESI) for C30H33N5O3[M+H]+:Calcd.512.265 6;Found 512.264 6。

4-(4-((4-((1-环丙基-3-(四氢-2H-吡喃-4-基)-1H-吡唑-4-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)吡啶-2-基)四氢-2H-吡喃-4-醇(A5)

制备方法同化合物A1，将2-三氟甲基-4-氨基吡啶换成4-(4-氨基吡啶-2-基)四氢-2H-吡喃-4-醇，得白色固体85 mg，收率28%；mp: 92~94 ℃；纯度96.6%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δ: 9.53(1H，s，pyrazole-H)，8.24(1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H)，8.14(1H，d，J=5.8 Hz，pyridine-H)，7.88(1H，s，NH)，7.78(1H，s，pyridine-H)，7.71(1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H)，6.59(1H，d，J=7.8 Hz，pyridine-H)，6.38(1H，s，pyridine-H)，5.18(1H，s，OH)，3.83(2H，d，J=8.6 Hz，OCH2)，3.79~3.70(4H，m，2-OCH2)，3.70~3.63(1H，m，CH)，3.31(2H，m，OCH2)，2.79~2.63(1H，m，CH)，2.17(2H，m，CH2)，1.66(2H，m，CH2)，1.40(2H，d，J=12.9 Hz，CH2)，1.04(2H，m，CH2)，1.00~0.86(2H，m，CH2)；HR-MS(ESI) for C26H31N5O4[M+H]+: Calcd.478.244 9; Found 478.244 0。

4-(4-((4-((1-环丙基-3-(4,4-二氟环己基)-1H-吡唑-4-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)吡啶-2-基)四氢-2H-吡喃-4-醇(B1)

制备方法同化合物A5，将2-溴-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙-1-酮换成2-溴-1-(4，4-二氟环己基)乙烷-1-酮，得白色固体170 mg，收率26%；mp:56~58 ℃；纯度96.9%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δ:9.52(1H，s，pyrazole-H)，8.24(1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H)，8.14(1H，d，J=5.8 Hz，pyridine-H)，7.88(1H，s，NH)，7.77(1H，d，J=1.9 Hz，pyridine-H)，7.70(1H，dd，J=5.6，2.1 Hz，pyridine-H)，6.58(1H，dd，J=5.8，2.2 Hz，pyridine-H)，6.38(1H， d， J=2.2 Hz，pyridine-H)，5.17(1H，s，OH)，3.73(4H，m，2-OCH2)，3.67(1H，m，CH)，2.68(1H，m，CH)，2.16(2H，m，CH2)，2.01(2H，m，CH2)，1.86(4H，m，2-CH2)，1.68(2H，m，CH2)，1.40(2H，d，J=12.7 Hz，CH2)，1.04(2H，m，CH2)，0.97~0.92(2H，m，CH2)；HR-MS(ESI) for C27H31F2N5O3[M+H]+: Calcd. 512.246 8; Found 512.246 6。

4-(4-((4-((3-(3- 唑环[3.1.0]己-6-基)-1-环丙基-1H-吡唑-4-基)氧基)吡啶-2-基)胺基)吡啶-2-基)四氢-2H-吡喃-4-醇(B2)

制备方法同化合物A5，将2-溴-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙-1-酮换成1-(3-氧杂环[3.1.0]己烷-6-基)-2-溴乙烷-1-酮，得白色固体135 mg，收率14%；mp: 63~ 65 ℃；纯度98.2%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δ: 9.52(1H，s，pyrazole-H)，8.24(1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H)，8.14(1H，d，J=5.8 Hz，pyridine-H)，7.85(1H，s，NH)，7.78(1H，d，J=1.8 Hz，pyridine-H)，7.69(1H，dd，J=5.6，2.0 Hz，pyridine-H)，6.59(1H，dd，J=5.8，2.2 Hz，pyridine-H)，6.43(1H，d，J=2.1 Hz，pyridine-H)，5.17(1H，s，OH)，3.80~3.70(6H，m，3-OCH2)，3.69~3.64(1H，m，CH)，3.59(2H，m，OCH2)，2.17(2H，m，CH2)，1.87(2H，d，J=8.0 Hz，CH2)，1.62(1H，t，J=7.8 Hz，CH)，1.41(2H， d， J=12.8 Hz， CH2)，1 .04(2H，m，CH2)，0.96–0.92(2H，m，CH2)；HR-MS(ESI) for C26H29N5O4[M+H]+:Calcd.476.229 2;Found 476.228 1。

4-(4-((4-((1-环丙基-3-苯基-1H-吡唑-4-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)吡啶-2-基)四氢-2H-吡喃-4-醇(B3)

制备方法同化合物A5，将2-溴-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙-1-酮换成2-溴-1-苯乙烷-1-酮，得白色固体65 mg，收率21%；mp: 137~139 ℃；纯度99.6%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δ: 9.49(1H，s，pyrazole-H)，8.23(1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H)，8.16(1H，d，J=5.8 Hz，pyridine-H)，8.12(1H，s，NH)，7.76(1H，d，J=1.6 Hz，pyridine-H)，7.70(2H，d，J=7.4 Hz，Ar-H)，7.66(1H，dd，J=5.6，1.9 Hz，pyridine-H)，7.36(2H，t，J=7.6 Hz，Ar-H)，7.28(1H，d，J=7.4 Hz，Ar-H)，6.67(1H，dd，J=5.8，2.1 Hz，pyridine-H)，6.43(1H，d，J=2.0 Hz，pyridine-H)，5.17(1H，s，OH)，3.82(1H，m，CH)，3.79~3.63(4H，m，2-OCH2)，2.16(2H，m，CH2)，1.39(2H，d，J=12.9 Hz，CH2)，1.16(2H，m，CH2)，1.04(2H，m，CH2)；HR-MS(ESI) for C27H27N5O3 [M+H]+ : Calcd. 470.2187; Found 470.2180。

4-(4-((4-((1-环丙基-3-(2-氟苯基)-1H-吡唑-4-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)吡啶-2-基)四氢-2H-吡喃-4-醇(B4)

制备方法同化合物A5，将2-溴-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙-1-酮换成2-溴-1-(2-氟苯基)，得白色固体32 mg，收率22%；mp: 67~69 ℃；纯度93.6%； 1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δ: 9.50(1H，s，pyrazole-H)，8.23(1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H)，8.16(1H，s，NH)，8.09(1H，d，J=5.9 Hz，pyridine-H)，7.76(1H，d，J=1.8 Hz，pyridine-H)，7.67(1H， dd， J=5.6，1.9 Hz，pyridine-H)，7.54(1H，m，Ar-H)，7.44~7.35(1H，m，Ar-H)，7.27~7.16(2H，m，Ar-H)，6.57(1H，dd，J=5.8，2.2 Hz，pyridine-H)，6.43(1H，d，J=2.1 Hz，pyridine-H)，5.19(1H，s，OH)，3.90~3.81(1H，m，CH)，3.80~3.64(4H，m，2-OCH2)，2.16(2H，m，CH2)，1.38(2H，d，J=12.9 Hz，CH2)，1.22~1.12(2H，m，CH2)，1.04(2H，m，CH2)；HR-MS(ESI) for C27H26FN5O3 [M+H]+: Calcd. 488.209 2; Found 488.208 5。

4-(4-((4-((1-环丙基-3-(3-氟苯基)-1H-吡唑-4-基)氧基)吡啶-2-基)氨基)吡啶-2-基)四氢-2H-吡喃-4-醇(B5)

制备方法同化合物A5，将2-溴-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙-1-酮换成2-溴-1-(3-氟苯基)，得白色固体28 mg，收率19%；mp: 117~119 ℃；纯度99.8%；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6) δ: 9.51(1H，s，pyrazole-H)，8.24(1H，d，J=5.6 Hz，pyridine-H)，8.17(1H，d，J=5.9 Hz，pyridine-H)，8.15(1H，s，NH)，7.77(1H，d，J=1.4 Hz，p yridine-H)，7.67(1H，dd， J=5.5，1.8 Hz，pyridine-H)，7.54(1H，d，J=7.8 Hz，Ar-H)，7.48~7.35(2H，m，Ar-H)，7.18~7.07(1H，m，Ar-H)，6.69(1H，dd，J=5.8，2.1 Hz，pyridine-H)，6.44(1H，d，J=1.9 Hz，pyridine-H)，5.17(1H，s，OH)，3.84(1H，m，CH)，3.80~3.67(4H，m，2-OCH2)，2.16(2H，m，CH2)，1.40(2H，d，J=12.9 Hz，CH2)，1.22~1.15(2H，m，CH2)，1.09~0.98(2H，m，CH2)；HR-MS(ESI) for C27H26FN5O3 [M+H]+: Calcd. 488.209 2; Found 488.208 5。

2.3　ALK5激酶抑制活性评价

将化合物溶解于指示剂量的DMSO中(从 10 μmol/L按3倍稀释)，用Echo转移化合物100 nL到384孔反应板中。将ALK5激酶加入1倍激酶缓冲液(40 mmol/L Tris，pH 7.5，0.10% BSA，20 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT)中，形成2倍酶溶液，向384孔反应板中加入2.5 µL，室温孵育10 min。将FAM标记的多肽和ATP加入1倍激酶缓冲液，形成2倍底物溶液，并转移2.5 µL至384孔反应板，于28 ℃孵育120 min。转移反应液5 μL到一块新的384孔板反应孔中，加入ADP-Glo试剂5 μL终止反应，于28 ℃孵育120 min。转移激酶检测试剂10 μL到反应孔中，振荡1 min，室温静置30 min。在Envision上读取发光值。

2.4　NIH3T3细胞活性评价

Luc-Smad2/3-NIH3T3细胞于10 cm培养皿中正常培养至汇合度达90%，消化后收集至15 mL离心管中，1 000 r/min离心5 min后，去除上清液，用培养基1 mL重悬后，稀释10倍计数，根据计数后的结果稀释细胞，将每孔4 000个细胞数传入96孔板中(每孔加入重悬细胞100 μL)。称取化合物2 mg，使用DMSO配制成4 mmol/L母液，用2% FBS培养基稀释，加入1×化合物溶液100 μL，使其终浓度分别为20 000，5 000，1 250，312.5，78.125，19.53，4.88，1.22 nmol/L，每孔TGF β1终浓度为4 ng/mL，与化合物一起用2% FBS培养基稀释。然后移去细胞上清液，每孔加入Glo Lysis Buffer 100 μL，缓慢摇晃使其均匀溶解细胞，室温裂解5 min。每孔加入Bright-glo luciferase assay system 100 μL，室温孵育5 min，振荡2 min，将上清液180 μL转入白底96孔板，检测化学发光信号。

2.5　药代动力学评价

单次口服给药(po)组：10 mg/kg，0.2 mL/10 g；单次尾静脉注射给药(iv)组：1 mg/kg，0.1 mL/10 g，n=3；po或给药后于5、15、30 min，1、2、6、10、24 h自眼眶静脉丛采血于肝素化EP管(0.6 mL)中，暂置于碎冰上。然后以8 000 r/min离心5 min，转移上层血浆15 μL，加甲醇-乙腈（1∶1）150 μL沉淀(含 1 ng/mL邻甲苯海拉明)，振荡3 min，4 500 r/min，离心5 min，取上清液(容器：2 mL深孔板) 50 μL，加入稀释剂(甲醇-水，1∶1) 500 μL，振荡3 min，4 500 r/min离心5 min，转移上清液200 μL用LC-MS/MS进样分析。根据上述步骤所得血药浓度数据绘制血药浓度-时间曲线图，用WinNonlin软件求算药代动力学参数。

3 结果与讨论

目标化合物的体外活性结果如表1所示。在A系列化合物中，将A区叔醇替换成吸电子基(A1-A2)，激酶抑制活性明显降低。当引入不同环状给电子基(A3~A5)时，抑制活性与阳性药相当或更优，其中化合物A5的抑制活性(IC50 = 2.4 nmol/L)最优，比阳性药提升2.5倍。A区构效关系表明，引入给电子基有助于增强活性，而吸电子基的引入则会导致活性明显损失。在细胞活性测试中，化合物A5对NIH3T3细胞中TGFβ-ALK5-SMAD2/3信号通路表现出较好的抑制活性(IC50 = 69.6 nmol/L)，于是确定四氢吡喃醇为A区优势基团。

Table 1 IC50 of the target compounds against ALK5 enzyme and NIH3T3 cell
Compd.R1R2ALK5/(nmol/L)NIH3T3/(nmol/L)
A1 X1 Y1 344 ND
A2 X2 Y1 179 ND
A3 X3 Y1 37 ND
A4 X4 Y1 36 ND
A5 X5 Y1 16 69.6
B1 X5 Y2 3.8 58.2
B2 X5 Y3 62 384.8
B3 X5 Y4 5.4 27.1
B4 X5 Y5 1.4 14.2
B5 X5 Y6 2.4 22.2
LY-3200882 41.1 ND
注：

ND： Not determined

通过固定四氢吡喃醇，利用生物电子等排，将B区四氢吡喃环替换成二氟环己烷(B1)，相比于阳性药，抑制活性显著提高(IC50 = 3.8 nmol/L)，可能是因为二氟甲基的体积较氧原子略大，疏水作用的加强导致抑制活性提高。引入桥环结构(B2)活性与阳性药相当，表明四氢吡喃环上位阻对活性影响相对较小。当用苯环替换四氢吡喃环时(B3)，抑制活性得到显著改善，可能苯环与结合口袋中某些氨基酸残基存在π-π堆积作用，使得结合力增强。此外，苯环上取代基及其位置对活性有一定影响，引入氟原子可进一步提高活性，且氟位于邻位时(B4)抑制活性更强(IC50 = 1.4 nmol/L)，具有阳性药31倍的优势。在细胞活性测试中，化合物B4对NIH3T3细胞中TGFβ-ALK5-SMAD2/3信号通路表现出最佳的抑制活性(IC50 = 14.2 nmol/L)。基于化合物B4良好的体外抑制活性，对其药代动力学性质做进一步考察。

药代动力学的评价结果如表2所示。化合物B4呈现较低的清除率(CL = 5.2 L·h-1·kg-1)，暴露量(AUC = 1 584.0 ng/mL·h)良好，半衰期为1.8 h，口服生物利用度达到85.0%，基本具备每天一次口服给药的潜力。

Table 2 Pharmacokinetic parameters of compound B4 a
Compd.po(10 mg/kg)iv (1 mg/kg)
t1/2/h

cmax/

(ng/mL)

AUC(0-t)/

(ng/mL·h)

F/%

c0/

(ng/mL)

CL/

(L·h-1·kg-1)

Vd/

(L/kg)

AUC0-t/(ng/mL·h)
B4 1.8 480.3 1 584.0 85.0 417.8 5.2 3.5 186.4
注：

a Compound in a solution of 20% PG， 5% EtOH， 5% solutol and 70% water

为了进一步说明化合物的构效关系，本研究使用分子对接方法研究了化合物B4与靶蛋白ALK5在活性位点的结合模式(pdb: 2wou)。通过图4可以看出，化合物B4(紫色)保留了在ALK5激酶铰链区与His283的直接氢键作用，以及选择性口袋中水分子介导的氢键相互作用。另外发现化合物B4与LY-3200882(绿色)母核部分叠合良好，与LY-3200882不同的是，溶剂区吡喃环上的羟基与Asp290形成一个氢键作用，B区苯环上的对位氢原子与Lys337形成一个非经典氢键。这些信息为后续ALK5抑制剂的设计提供了借鉴和理论基础。

Figure 4 Proposed binding mode of B4 (purple) and overlaid with LY-3200882 (green)

4 小 结

本研究通过分析LY-3200882与ALK5的结合模式，保留对活性起关键作用的母核区域，利用生物电子等排和构象限制等策略，设计并合成了10个目标化合物。通过两轮优化得到化合物B4，不仅表现出显著的体外抑制活性，而且具备良好的药代动力学性质，具有进一步开发的潜在价值。

同等贡献声明

许涛与王小伟为共同第一作者

XU Tao and WANG Xiaowei contributed equally to this work

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