摘要
筛选岗松中抗前列腺素E2受体4（EP4）的拮抗剂和探讨抗类风湿关节炎的作用。体外建立HEK293T-EP4细胞拮抗剂筛选模型，采用均相时间分辨荧光（HTRF）技术筛选岗松活性成分。SPF级别ICR小鼠，雄性，随机分为对照组、模型组、甲氨蝶呤组、岗松提取物BF-2（100、50和25 mg/kg）组，体内建立胶原诱导型类风湿性关节炎（CIA）小鼠模型，测量小鼠足趾肿胀体积，苏木精和伊红染色进行病理学检测。小鼠随机分为对照组、岗松提取物BF-2（100、50和25 mg/kg）组和阿司匹林组，采用醋酸诱导扭体试验观察扭体次数。本研究成功建立了EP4体外拮抗剂筛选模型，初筛结果发现岗松提取物BF-2，BF-20，BF-11和BF-12具有较强的EP4拮抗活性［（102.11 ± 3.45）%，（90.31 ± 3.59）%， （75.72 ± 1.79）%和（76.84 ± 1.64）%］，其中，BF-2拮抗活性最强（IC50 = 0.99 ± 0.08 μg/mL）。BF-2可以明显抑制CIA小鼠的足趾肿胀，并缓解关节软骨基质降解和炎性细胞浸润。同时，与对照组比较，BF-2各剂量组小鼠的扭体次数均显著减少。筛选得到了一种EP4拮抗剂BF-2，并且具有潜在抗类风湿性关节炎活性。
关键词
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种具有高发病率和高致残率的自身免疫性疾病，能够引起软骨基质和骨质破
据报道，涉及RA的多种靶点中，前列腺素E2受体4（EP4）是最有潜力的，和其他阻断前列腺素合成的NSAIDs不一样的是，EP4拮抗剂具有免疫调节和直接抗炎活
岗松（Baeckea frutescens L.）属桃金娘科，是一种传统中草药，民间常用于治疗发热、妇女经闭、产后妇女肢体酸痛及类风湿性疾病等。现代研究发现岗松含有丰富的挥发油、黄酮类和间苯三酚类化合物，并且具有广泛的生物学活性，包括抗炎、抑菌、抗病毒和抗肿瘤活
岗松化合物样品均由中国药科大学天然药物化学教研室汪豪教授提供（纯度≥95%）。按照之前文献报
Figure 1 Structure of BF-2 (Baeckein E, C30H34O7)from Baeckea frutescens L.
HEK293T-EP4细胞用含10%FBS+1%双抗（青霉素和链霉素）+G418（0.5 mg/mL）的DMEM培养基于37 ℃培养于5% CO2细胞培养箱，待生长至80% ~ 90%，用0.25% EDTA消化细胞传代。
根据cAMP-d2试剂盒说明书采用384微孔板建立筛选模型。
最佳细胞数确定：将HEK293T-EP4细胞浓度依次用刺激缓冲液（SB溶液）（含1 mmol/L IBMX的DMEM培养基）将细胞梯度稀释为每毫升2 × 1
激动剂模型：使用上述最佳细胞数及对应的Forsklin EC80进行后续实验，用FSB（含EC80 Forsklin的SB溶液）将EP4激动剂PGD2梯度稀释， 第1个最终反应浓度为50 μmol/L，每孔5 μL，将细胞稀释至最佳细胞数，每孔5 μL，将384孔板500 r/min离心15 s， 室温孵育45 min，随后加入cAMP-d2和Anti-cAMP混合液（裂解缓冲液稀释）终止反应，室温继续孵育60 min，待孵育结束后，使用多功能酶标仪于665 nm/615 nm处检测信号，计算EC80。
拮抗剂模型：采用FSB溶液梯度稀释L-161982（EP4拮抗剂），第1个最终反应浓度为100 μmol/L，每孔2.5 μL，与5 μL细胞混合于室温反应30 min。根据上述激动剂模型实验EC80配制含PGD2的FSB溶液，每孔2.5 μL，加入384孔板，反应45 min，随后加入cAMP-d2和Anti-cAMP混合液（裂解缓冲液稀释）终止反应，室温继续孵育60 min，待孵育结束后，使用多功能酶标仪于665 nm/615 nm处检测信号，计算IC50。
使用上述建立的EP4拮抗剂细胞模型从岗松提取物（BF-ext，BF-2，BF-11，BF-13，BF-18，BF-25，BF-32，BF-19，BF-1，BF-20，BF-12，BF-15，BF-22，BF-48和BF-45）中筛选EP4拮抗剂，用FSB溶液稀释化合物（最终反应浓度为100 μg/mL），0.1% DMSO作为阴性对照，L-161982作为阳性对照，每孔2.5 μL，与细胞悬液5 μL混合于室温反应30 min，加入PGD2继续反应45 min，随后加入cAMP-d2和Anti-cAMP混合液（裂解缓冲液稀释）终止反应，室温继续孵育60 min，待孵育结束后，使用多功能酶标仪于665 nm/615 nm处检测信号，计算化合物抑制率。
初筛实验中抑制率达60%以上的化合物进行后续的复筛，将化合物用FSB溶液梯度稀释8个浓度，第1个最终反应浓度为100 μg/mL，每孔2.5 μL，与5 μL细胞混合于室温反应30 min，加入PGD2继续反应45 min，随后加入cAMP-d2和Anti-cAMP混合液（裂解缓冲液稀释）终止反应，室温继续孵育60 min，待孵育结束后，使用多功能酶标仪于665 nm/615 nm处检测信号，计算化合物IC50。
使用ICR小鼠，尾巴根部皮下注射完全弗氏佐剂（含Ⅱ型胶原，2 mg/mL）免疫诱导类风湿性关节炎模型，对照组仅注射生理盐水，其他各组注射含Ⅱ型胶原的完全弗氏佐剂，体积均为100 μL，分别在第1次免疫后7和21 d，注射含Ⅱ型胶原的不完全弗氏佐剂（1∶1）进行二次免疫。选择3点注射，左后足底、尾根部及背部皮内注射共计100 μL。
分对照组、模型组（Model）、甲氨蝶呤（MTX， 1 mg/kg）、岗松提取物BF-2（100、50和25 mg/kg）组，每组5只。在第1次免疫后22 d，开始给药，每天1次，连续给药8 d，对照组及模型组给予等体积的CMC-Na。
排水法：首先在每只小鼠的关节处做一标记，其次向内径2 cm的20 mL注射器注入纯净水，液面与量筒最高刻度平齐。用最小刻度为0.1 mL的1 mL注射用针管吸取注射器内的纯净水约1 mL。再把小鼠足跖缓缓伸入注射器内，使标记与注射器最高刻度平齐。再用已吸入水1 mL的针管向注射器内慢慢注入水液，使液面再次与最高刻度及标记平齐。从1 mL注射器上的刻度处读出其内部剩余液体体积，即为小鼠的足趾体积，重复2次取其均值。
小鼠脱颈椎处死，剔除小鼠踝关节及足趾的皮毛和肌肉，将踝关节及足趾置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后放于10% EDTA脱钙液（pH 8.0），脱钙15 d，每3天换一次液，然后用石蜡包埋，切成5 μm矢状切片，苏木精-伊红（HE）染色，用显微镜观察关节组织的病理形态。
将ICR小鼠分为对照组、阿司匹林（200 mg/kg）和岗松提取物BF-2（100、50和25 mg/kg）组，每组5只，每天1次，连续灌胃8 d，最后一次给药后30 min，腹腔注射1.0%冰醋酸0.2 mL，记录15 min内的小鼠扭体次数。
首先确定了EP4拮抗剂活性检测的条件，以不同浓度的Forskolin刺激细胞，结果表明细胞数为每孔4 000个细胞时，所得信噪比（S/B）最大，且Forskolin EC80为（540.7 ± 63.29） nmol/L（
Figure 2 Establishment of a cell-based 384-well HTRF-cAMP assay for EP4 ()
A and B: Response of HTRF-cAMP assay at various cell densities (4 000, 2 000, and 1 000 cells per well) using Forsklin and the signal to basal ratio (S/B) was calculated； C: Concentration response of EP4 agonist PGD2 in EP4 HTRF-cAMP assay；D: Concentration response of EP4 antagonist L-161982 in EP4 HTRF-cAMP assay
初筛表明，BF-2、BF-20、BF-11和BF-12对EP4受体具有较强拮抗活性，其抑制率分别为（102.11 ± 3.45）%、（90.31 ± 3.59）%、（75.72 ± 1.79）%和（76.84 ± 1.64）%，见
复筛表明，BF-2和BF-20对EP4受体的拮抗活性具有量效关系，但BF-2的拮抗活性较强，其IC50为（0.99 ± 0.08） μg/mL，见
Figure 3 Dose-response curves representing EP4 cAMP responses to compounds which displayed EP4 inhibiting activity ()
A: Concentration response of BF-11 in EP4 HTRF-cAMP assay；B:Concentration response of BF-12 in EP4 HTRF-cAMP assay；C: Concentration response of BF-11 in EP4 HTRF-cAMP assay；D: Concentration response of BF-20 in EP4 HTRF-cAMP assay
与对照组小鼠相比，从第7天开始，模型组小鼠足趾体积显著增加，且一直持续至实验结束，差异有统计学意义（P < 0.05）；确定造模成功后，从第18天开始灌胃给药BF-2和阳性药甲氨蝶呤（MTX），结果表明：与模型组相比，灌胃给予BF-2和MTX组小鼠的足趾体积显著减小，差异有统计学意义（P < 0.05），见
Figure 4 Effect of BF-2 on paw volume in CIA mice ()
A: Results of paw volume of CIA mice at different time points; B: Statistical analysis results of area under the paw volume curve of CIA mice at different time points
HE染色结果表明，对照组小鼠关节组织基质均匀分布，关节腔无炎性细胞浸润；模型组小鼠关节组织基质损伤严重，且伴随有部分增生，同时关节腔有大量炎性细胞浸润；BF-2（25 mg/kg）组小鼠关节组织基质损伤稍有缓解，但基质还存在大量坏死，并且关节腔有炎性细胞浸润；BF-2（50 mg/kg）组小鼠关节组织基质排列比较均匀，但存在细胞坏死及炎性细胞浸润；BF-2（100 mg/kg）组小鼠关节组织基质排列均匀，但关节腔有少量炎性细胞浸润；MTX组小鼠关节组织基质排列均匀，且同时关节腔炎性细胞浸润较少，见
Figure 5 Effect of BF-2 on joint pathology in CIA mice (n = 5)
Red box: cartilage matrix; Yellow box: joint cavity
对照组小鼠扭体次数为43 ± 4.3次，BF-2 25 mg/kg组小鼠扭体次数为20 ± 5.0次，BF-2 50 mg/kg小鼠扭体次数为11 ± 4.6次，BF-2 100 mg/kg组小鼠扭体次数为8 ± 3.7次，阿司匹林组小鼠扭体次数为32 ± 1.8次，这表明与对照组相比给予化合物BF-2和阿司匹林组小鼠的扭体次数显著下降，差异有统计学意义（P < 0.05），见
Figure 6 Effect of BF-2 on the number of writhing in acetic acid induced mice（）
**P < 0.01,
在RA发病机制涉及的多个靶标中，前列腺素E2（PGE2）是最有希望的，因为它与阻碍前列腺素合成的非甾体类抗炎药（NSAIDs）不同，选择性PGE2受体拮抗剂具有将免疫调节剂和直接的抗炎活性结合的潜
据报道，CIA小鼠模型是RA研究的常见模型之一，其被广泛应用于RA的各种研究，以探索RA的发病机制和发现RA的治疗靶
综上所述，本研究从岗松活性成分筛选得到了4种EP4拮抗剂，且BF-2拮抗活性最强。更重要的是，发现BF-2具有抗RA活性，且与抑制炎症反应和软骨基质保护有关。但BF-2抗RA机制依然不清楚，需后续试验进一步研究。
References
Siebert S， Tsoukas A， Robertson J， et al. Cytokines as therapeutic targets in rheumatoid arthritis and other inflammatory diseases［J］. Pharmacol Rev， 2015， 67（2）： 280-309. [百度学术]
Chen Z， Bozec A， Ramming A， et al. Anti-inflammatory and immune-regulatory cytokines in rheumatoid arthritis［J］. Nat Rev Rheumatol， 2019， 15（1）： 9-17. [百度学术]
Strangfeld A， Zink A. Therapy： assessing cancer risk of cytokine inhibitors in RA［J］. Nat Rev Rheumatol， 2010， 6（3）： 126-127. [百度学术]
Tanaka Y. Intensive treatment and treatment holiday of TNF-inhibitors in rheumatoid arthritis［J］. Curr Opin Rheumatol， 2012， 24（3）： 319-326. [百度学术]
Yokoyama U， Iwatsubo K， Umemura M， et al. The prostanoid EP4 receptor and its signaling pathway［J］. Pharmacol Rev， 2013， 65（3）： 1010-1052. [百度学术]
Wu JD， Liu B， Mao W， et al. Prostaglandin E2 regulates activation of mouse peritoneal macrophages by Staphylococcus aureus through Toll-like receptor 2， Toll-like receptor 4， and NLRP3 inflammasome signaling［J］. J Innate Immun， 2020， 12（2）： 154-169. [百度学术]
Blackwell KA， Raisz LG， Pilbeam CC. Prostaglandins in bone： bad cop， good cop［J］？ Trends Endocrinol Metab， 2010， 21（5）： 294-301. [百度学术]
McCoy JM， Wicks JR， Audoly LP. The role of prostaglandin E2 receptors in the pathogenesis of rheumatoid arthritis［J］. J Clin Invest， 2002， 110（5）： 651-658. [百度学术]
Caselli G， Bonazzi A， Lanza M， et al. Pharmacological characterisation of CR6086， a potent prostaglandin E2 receptor 4 antagonist， as a new potential disease-modifying anti-rheumatic drug［J］. Arthritis Res Ther， 2018， 20（1）： 39. [百度学术]
Lu WJ， Liu BM， Ya QK， et al. Overview of research of Baeckea frutescens L.（中药岗松的研究概况）［J］.Guangxi Med J （广西医学）， 2008， 30（10）： 1517-1519. [百度学术]
Hou JQ， Guo C， Zhao JJ， et al. Anti-inflammatory Meroterpenoids from Baeckea frutescens［J］. J Nat Prod， 2017， 80（8）： 2204-2214. [百度学术]
Hou JQ， Guo C， Zhao JJ， et al. Frutescone A-G， tasmanone-based meroterpenoids from the aerial parts of Baeckea frutescens［J］. J Org Chem， 2017， 82（3）： 1448-1457. [百度学术]
Yu QW， Wang H， Huo JT， et al. Suppression of Baeckea frutescens L. and its components on MyD88-dependent NF-κB pathway in MALP-2-stimulated RAW264.7 cells［J］. J Ethnopharmacol， 2017， 207： 92-99. [百度学术]
Zhou JN， Yan M， Gao P， et al. New flavonoids and methylchromone isolated from the aerial parts of Baeckea frutescens and their inhibitory activities against cyclooxygenases-1 and -2［J］. Chin J Nat Med， 2018， 16（8）： 615-620. [百度学术]
Aoki T， Narumiya S. Prostaglandins and chronic inflammation［J］. Trends Pharmacol Sci， 2012， 33（6）： 304-311. [百度学术]
Baum R， Gravallese EM. Bone as a target organ in rheumatic disease： impact on osteoclasts and osteoblasts［J］. Clin Rev Allergy Immunol， 2016， 51（1）： 1-15. [百度学术]
Woodward DF， Jones RL， Narumiya S. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXXXIII： classification of prostanoid receptors， updating 15 years of progress［J］. Pharmacol Rev， 2011， 63（3）： 471-538. [百度学术]
Pohl O， Chollet A， Kim SH， et al. OBE022， an oral and selective prostaglandin F2α receptor antagonist as an effective and safe modality for the treatment of preterm labor［J］. J Pharmacol Exp Ther， 2018， 366（2）： 349-364. [百度学术]
Liu WW， Zhang YJ， Zhu WN， et al. Sinomenine inhibits the progression of rheumatoid arthritis by regulating the secretion of inflammatory cytokines and monocyte/macrophage subsets［J］. Front Immunol， 2018， 9： 2228. [百度学术]
Louis C， Ngo D， D'Silva DB， et al. Therapeutic effects of a TANK-binding kinase 1 inhibitor in germinal center-driven collagen-induced arthritis［J］. Arthritis Rheumatol， 2019， 71（1）： 50-62. [百度学术]
Kang LJ， Kwon ES， Lee KM， et al. 3'-Sialyllactose as an inhibitor of p65 phosphorylation ameliorates the progression of experimental rheumatoid arthritis［J］. Br J Pharmacol， 2018， 175（23）： 4295-4309. [百度学术]
Zhao HQ， Li CJ， Xu YJ， et al. Experimental study on anti- adjuvant arthritis in rats of Baeckea frutescens［J］. Chin J Ethnomedicine Ethnopharmacy（中国民族民间医药杂志）， 2017， 26（5）： 37-41. [百度学术]
Withrow J， Murphy C， Liu YT， et al. Extracellular vesicles in the pathogenesis of rheumatoid arthritis and osteoarthritis［J］. Arthritis Res Ther， 2016， 18（1）： 286. [百度学术]
Furst DE， Emery P. Rheumatoid arthritis pathophysiology： update on emerging cytokine and cytokine-associated cell targets［J］. Rheumatology （Oxford）， 2014， 53（9）： 1560-1569. [百度学术]
Lerner A， Neidhöfer S， Reuter S， et al. MMP3 is a reliable marker for disease activity， radiological monitoring， disease outcome predictability， and therapeutic response in rheumatoid arthritis［J］. Best Pract Res Clin Rheumatol， 2018， 32（4）： 550-562. [百度学术]