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载铜绿假单胞菌DNA疫苗温敏水凝胶系统的构建及体内评价

  • 石敏 1
  • 雍琴 1
  • 何颖娜 2
  • 黄仕琴 3
  • 赵轩 1
  • 余娴 1
1. 重庆医科大学附属第二医院Ⅰ期临床试验研究室，重庆 400010； 2. 河北中医学院药学院，石家庄 050200； 3. 重庆市江津区中心医院，重庆 402260

中图分类号： R944

最近更新：2021-04-30

DOI：10.11665/j.issn.1000-5048.20210207

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EN 引
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摘要

构建载铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA） DNA疫苗的PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶系统，评价该系统的体内免疫效力。通过简单物理混合法制备PA DNA疫苗的PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶，测量其胶凝温度；评价其体外毒性、体外累计释放率；通过凝胶体积变化评价水凝胶的体内降解；将小鼠分为对照组（PBS）、水凝胶组（Hydrogel）、in vivo-jetPEI/质粒DNA组（in vivo-jetPEI/pDNA）、水凝胶+in vivo-jetPEI/质粒DNA组（Gel+in vivo-jetPEI/pDNA），免疫3次，每次间隔10 d，末次免疫2周后处死小鼠，检测血清特异性IgG抗体、脾淋巴细胞增殖情况及细胞上清液中IFN-γ水平。结果显示，PLGA-PEG-PLGA水凝胶具有温敏性，相变温度为（32 ± 0.5） ℃；体外对DC 2.4细胞无明显毒性；体外释放7 d时约释放80%的质粒DNA；PLGA-PEG-PLGA在体内具有可降解性，大约15 d几乎完全降解；体内免疫实验表明in vivo-jetPEI/pDNA及Gel+in vivo-jetPEI/pDNA组小鼠脾淋巴细胞明显增殖、特异性IgG抗体及IFN-γ水平升高，且水凝胶可增强DNA疫苗诱导的免疫反应水平。结果表明，载PA DNA疫苗的温敏水凝胶系统是研发PA疫苗有前景的一种新策略。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一种机会性致病菌，可造成机体的严重感染，尤其是在医疗机构及免疫功能低下的人群中［

1］，可引起局部感染（如呼吸道、泌尿道、胃肠道、眼睛、皮肤和关节）或全身性菌血症［2］。由于PA对大多数抗生素都存在耐药性［3］，临床治疗PA感染显得十分棘手，研发PA疫苗是解决这一治疗困境的一种有前景的策略。

PA相关疫苗研究已发展几十年，到目前为止，研究的候选疫苗抗原包括脂多糖、多糖、多糖结合物、鞭毛、外膜蛋白、Ⅲ型分泌系统等，此外PA疫苗的减毒活疫苗及灭活疫苗亦有研究［

4］。不少疫苗在前期动物模型取得不错的免疫反应并进入了临床试验［2］，然而目前仍无PA疫苗可以用于临床。外膜蛋白F （outer membrane protein F，OprF）在不同菌株中高度保守［5］，且与群体感应、毒素分泌和细胞黏附有关［6］，因而是PA最有希望的候选抗原疫苗之一［7］。本课题组前期构建的PA OprF DNA疫苗（pVAX1-OprF-VP22）证实其具有良好的免疫原性，在动物体内可引起体液免疫及细胞免疫反应［8］。

DNA疫苗具有易生产、价格合理、热稳定、安全可靠且不存在减毒疫苗毒力回升风险等优点［

9］，因而备受研究者青睐。目前已有DNA疫苗进入临床试验阶段，部分DNA疫苗已被批准用于动物疾病的防治［10］。尽管DNA疫苗优势明显，但因其在体内易被核酸酶降解、抗原提呈细胞摄取率低［11］，诱发的免疫效力有限，如何提高DNA疫苗免疫原性是亟需解决的难题，迄今尚无DNA疫苗应用于临床治疗。水凝胶是一种高分子聚合物形成的网络体系，可因外界环境变化如pH、温度、光、热等刺激发生溶胶-凝胶相变［12］，具有良好的生物相容性、可调的多孔性及对生物流体的亲和力等特性，因而广泛应用于药物递送、组织工程等生物医学领域［13］。其中温敏性可注射水凝胶因其随温度变化在注射部位由溶胶态转变为凝胶态的特点，可作为疫苗储库缓慢释放包载的抗原，具有良好的应用前景。poly（d，l-lactic-co-glycolic acid）-b-poly（ethylene glycol）-b-poly（d，l-lactic-co-glycolic acid） （PLGA-PEG-PLGA）材料由于可生物降解性、生物相容性好、可控的降解速率、易于给药、可调节的溶胶-凝胶转变等优点，广泛用于药物递送等方面［14-16］，但关于其用于DNA疫苗的递送报道较少。

本实验拟构建载PA DNA疫苗的PLGA-PEG-PLGA温敏性水凝胶递送系统，通过皮下注射该系统，在体温环境下PLGA-PEG-PLGA发生相变转变为凝胶态，在注射部位形成抗原储库可连续释放抗原质粒，提高机体对抗原的摄取，进而引发更为强大的免疫反应，为PA DNA疫苗研发提供一种新的策略方法。

1 材 料

1.1　重组质粒、OprF抗原蛋白、细胞及实验动物

重组质粒pVAX1-OprF-VP22 （pDNA）由本实验室保存，OprF抗原蛋白由上海生工生物有限公司合成并保存于-80 ℃，小鼠骨髓来源的树突状细胞系DC 2.4由本实验室保存。实验所用动物为健康雌性BALB/c小鼠（6 ~ 8周），SPF级，购于重庆医科大学实验动物中心，动物自由进食、饮水，本研究通过重庆医科大学附属第二医院伦理委员会批准，整个研究过程符合伦理学要求。

1.2　主要试剂

PLGA-PEG-PLGA［Mr：1 654（PLGA）-1 500（PEG）-1 654（PLGA）， 丙交酯（LA）∶乙交酯（GA）=3∶1］（济南岱罡生物工程有限公司）；聚乙烯亚胺（polyethyleninime， PEI，美国Polysciences公司）；in vivo-jetPEI体内转染试剂（法国Polyplus公司）；Lipo8000转染试剂、红细胞裂解液、青霉素-链霉素溶液（100 ×）、胰蛋白酶溶液、牛血清白蛋白（BSA）（碧云天生物有限公司）；MEM培养基、NEAA（美国Gibco公司）；RPMI 1640基础培养基（美国Hyclone公司）；小鼠IFN-γ ELISA试剂盒（瑞典Mabtech公司）；胎牛血清（FBS）（赛米克生物有限公司）；PBS溶液、CCK-8试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；无内毒素质粒大提试剂盒、单组分TMB显色液、ELISA终止液、吐温20（北京索莱宝科技有限公司）。

1.3　仪 器

Varioskan LUX酶标仪（美国Thermo公司）；Zetasizer Nano ZS90纳米粒度电位仪（英国Malvern Panalytical仪器有限公司）；3-18台式高速离心机（湖南可成仪器设备有限公司）；iCEN-24R低温高速离心机（杭州奥盛仪器有限公司）；NanoDropTM one超微量紫外-分光光度计（美国Thermo公司）。

2 方 法

2.1　PLGA-PEG-PLGA水凝胶制备

室温条件下称取一定量的PLGA-PEG-PLGA材料，溶于PBS （pH 7.4）溶液中，配制质量分数为20%的PLGA-PEG-PLGA溶液，置于4 ℃备用。

2.2　PLGA-PEG-PLGA水凝胶相变温度及37 ℃凝胶时间测定

利用倒置试管法检测相变温度，将配制好的水凝胶及含PEI/pDNA复合物的水凝胶样品（PLGA-PEG-PLGA终浓度为20%，pDNA质量浓度为0.1 μg/μL）置于EP管中，恒温水浴锅从15 ℃开始缓慢升温，每升高0.5 ℃观察凝胶溶液状态，当倒置EP管后30 s后溶液均不流动则视为水凝胶已完全凝胶化，记录此时的温度即为相变温度，在相同实验条件下测量3次取均值。同时测量37 ℃条件下水凝胶凝胶化所需要的时间，每隔5 s观察一次水凝胶形态，当溶液完全凝胶化时记录下所需时间，相同实验条件下测量3次取均值。

2.3　PLGA-PEG-PLGA水凝胶粒径测定

制备20%水凝胶样品，稀释一定倍数后利用纳米粒度电位仪（检测温度为25 ℃）检测水凝胶自组装形成的胶束粒径大小。

2.4　PLGA-PEG-PLGA水凝胶细胞毒性实验

使用MEM完全培养基（含10% FBS，1% NEAA，1%双抗）培养DC 2.4细胞，取对数生长期的DC 2.4细胞于96孔板中培养，将细胞分组为：对照组（PBS），水凝胶组（Gel），Lipo8000转染试剂/质粒（Lipo/pDNA）组，水凝胶+Lipo8000转染试剂/质粒（Gel+Lipo/pDNA）组，分别加入处理因素PBS 20 μL、水凝胶10 μL+PBS 10 μL、Lipo8000/pDNA 5 μL+PBS 15 μL、水凝胶10 μL + Lipo8000/pDNA 5 μL+PBS 5 μL，Lipo8000/pDNA复合物配制方法参照说明书。每组设置3个复孔，分别培养24和48 h后吸去培养基，PBS润洗2次，每孔加入含10 μL CCK-8溶液的培养基，37 ℃继续孵育4 h，利用酶标仪测450 nm处的吸收度A，计算细胞存活率，细胞存活率公式为：细胞存活率=（实验组吸收度－调零组吸收度）/（对照组吸收度－调零组吸收度）× 100%。

2.5　PLGA-PEG-PLGA水凝胶体外释放实验

制备水凝胶、含pDNA或PEI/pDNA复合物的水凝胶（PLGA-PEG-PLGA终浓度为20%，pDNA含量为60 μg），混匀后4 ℃静置1 h使pDNA或PEI/pDNA复合物均匀分散于水凝胶样品中，然后将水凝胶样品置于37 ℃环境下完全凝胶化后加入PBS溶液（37 ℃预热）500 μL，于37 ℃、60 r/min恒温振摇，于预定时间点取出全部上清液，并补足新鲜PBS溶液500 μL，紫外分光光度法检测上清液中质粒的浓度。

2.6　PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶体内降解

取水凝胶200 μL注射于BALB/c小鼠背部皮下，分别于注射后30 min、3 d、5 d、10 d、15 d处死小鼠，对注射部位的凝胶进行拍照，观察凝胶残余体积变化情况。

2.7　动物免疫方案

将6 ~ 8周大小的健康雌性BALB/c小鼠随机分为4组（n = 3）：对照组（PBS）、水凝胶组（Hydrogel）、in vivo-jetPEI/质粒DNA组（in vivo-jetPEI/pDNA）、水凝胶+in vivo-jetPEI/质粒DNA组（Gel+in vivo-jetPEI/pDNA）。各组制剂注射于小鼠背部皮下，具体为：PBS组每只注射PBS 200 μL，Hydrogel组每只注射20%水凝胶溶液200 μL，in vivo-jetPEI/pDNA组每只注射含pDNA 20 μg的in vivo-jetPEI/pDNA复合物溶液200 μL，Gel+in vivo-jetPEI/pDNA组每只注射含in vivo-jetPEI/pDNA复合物（含pDNA 20 μg）的20%水凝胶溶液200 μL。每隔10 d免疫1次，共免疫3次，末次免疫后2周处死小鼠。

2.8　血清特异性IgG抗体检测

参考文献［

8］中的方法，利用间接ELISA法检测血清中特异性IgG抗体。将OprF蛋白（5 μg/mL）包被于96孔酶标板中，于4 ℃过夜。弃去96孔板中的液体，5% BSA于37 ℃封闭2 h，PBST（PBS含0.1%吐温20）洗板，加入一定倍数稀释的血清样本，37 ℃孵育1 h，PBST洗板，加入HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体，37 ℃孵育1 h，PBST洗板，加入单组分TMB显色液，37 ℃避光孵育一定时间后加入ELISA终止液，于450 nm处测定吸收度。

2.9　脾淋巴细胞增殖实验

末次免疫2周后无菌获取各组小鼠脾脏，分离脾脏淋巴细胞，调整细胞浓度每毫升2 × 106个细胞，每孔加细胞悬液100 μL于96孔板中，每组小鼠设阴性对照（细胞+培养基）、抗原刺激（终浓度10 μg/mL OprF）、阳性对照（终浓度5 μg/mL ConA）。每个处理因素设3个复孔。培养72 h后利用CCK-8法检测细胞增殖情况。

2.10　IFN-γ水平检测

按上述方法制备脾脏淋巴细胞混悬液，调整细胞浓度为每毫升2 × 106 个细胞，每孔加细胞悬液100 μL于96孔板中，用OprF蛋白（终浓度为10 μg/mL）刺激各组淋巴细胞，37 ℃、5% CO2条件下，96孔板中培养72 h后收集上清液，根据ELISA试剂盒说明书检测淋巴细胞分泌的IFN-γ水平。

2.11　数据统计分析

所有数据均用x¯±s表示，利用软件SPSS 26.0处理分析数据，多组间比较使用单因素方差分析（One-Way ANOVA），多个样本均数的两两比较采用LSD法，P<0.05被认为具有统计学意义。

3 结 果

3.1　PLGA-PEG-PLGA水凝胶具有合适的相变温度及凝胶时间

为了验证PLGA-PEG-PLGA水凝胶的温敏特性，利用倒置试管法进行判断。图1结果表明，在4 ℃时，含或不含PEI/pDNA复合物的20% PLGA-PEG-PLGA水凝胶溶液均表现为可自由流动的溶液态，而在37 ℃时则表现为稳定的凝胶态。检测了PLGA-PEG-PLGA的相变温度，结果如表1所示，含或不含PEI/pDNA复合物的20% PLGA-PEG-PLGA水凝胶溶液在32 ℃左右时即发生溶胶-凝胶相变转化为不能流动的凝胶，37 ℃时可以在2 min内形成稳定的凝胶态。

Figure 1 Appearance changes of the different copolymer with a concentration of 20% at different temperatures

Table 1 Phase transition temperature and gelation time (37 °C) of 20% hydrogel solution
SamplesPhase transition temperature/°CAverage value/°CGelation time/sAverage value/s
Gel 31.5; 32.0; 32.5 32.0 ± 0.5 75; 80; 70 75 ± 5
Gel+PEI/pDNA 33.0; 32.0; 32.5 32.5 ± 0.5 65; 75; 70 70 ± 5

3.2　PLGA-PEG-PLGA水凝胶粒径

检测20% PLGA-PEG-PLGA水凝胶溶液的粒径发现其粒径为（43.99 ± 1.242） nm，多分散系数（polydispersity index，PDI）为0.325 ± 0.026，说明水凝胶自组装形成的胶束粒径分布较均一。有研究表明，PLGA-PEG-PLGA形成的胶束有助于细胞对PEI/pDNA复合物的内吞过程，增强基因转染效率［

17］。结合水凝胶的温敏相变特性，表明20% PLGA-PEG-PLGA水凝胶溶液可作为一种理想的材料用于抗原基因的体内递送。

3.3　PLGA-PEG-PLGA水凝胶体外无明显细胞毒性

将PLGA-PEG-PLGA水凝胶溶液处理细胞24和48 h后检测细胞活性以评估水凝胶的体外毒性。结果如图2所示，与对照组（PBS组）相比，Gel组、Lipo8000/pDNA组及含Lipo8000/pDNA复合物水凝胶组的细胞活性无明显差异（P > 0.05），在各组制剂处理细胞24及48 h后细胞存活率均在90%以上，说明PLGA-PEG-PLGA水凝胶的体外生物相容性良好，其负载Lipo8000/pDNA复合物后对细胞也无明显毒性。细胞毒性结果表明空白水凝胶及负载阳离子聚合物/pDNA复合物水凝胶在体外细胞相容性良好，可进一步用于体内研究。

Figure 2 Cytotoxicity analysis of DC 2.4 cells treated with different treatments for 24 h （A）and 48 h（B） (x¯±s, n=3)

3.4　PLGA-PEG-PLGA水凝胶体外缓慢释放质粒DNA

为验证水凝胶具有缓慢释放质粒DNA的作用，将pDNA及PEI/pDNA复合物分别加入水凝胶中进行体外释放实验，在不同时间点检测释放介质中的质粒含量以计算水凝胶中质粒DNA的累计释放率。结果如图所示，在体外释放7 d时，PEI/pDNA组约释放出总量的80%（图3-B），与游离pDNA组释放4 d时的累计释放率相当（图3-A）。这说明PLGA-PEG-PLGA能很好的携带pDNA或PEI/pDNA复合物并不断释放，可作为抗原储库达到缓释目的，且pDNA以复合物形式负载于水凝胶中时可进一步延长其释放时间。

Figure 3 In vitro release curve of 20% PLGA-PEG-PLGA hydrogel (x¯±s, n=3)

A: Gel+pDNA group; B: Gel+PEI/pDNA group

3.5　PLGA-PEG-PLGA水凝胶体内具有生物降解性

为了评价水凝胶的体内可降解性，将20% PLGA-PEG-PLGA水凝胶200 μL注射至小鼠皮下，于不同时间点观察皮下水凝胶形态及体积变化。结果如图4所示，将溶液态的水凝胶注射至体内后可在注射部位形成凝胶，随着时间延长，水凝胶在体内逐渐降解，注射15 d后几乎完全降解，这说明PLGA-PEG-PLGA水凝胶具有良好的生物可降解性。

Figure 4 Degradation behavior of 20% PLGA-PEG-PLGA hydrogel in murine subcutaneous

3.6　PLGA-PEG-PLGA水凝胶可增强DNA疫苗诱导的体液免疫反应

为了评估不同处理因素在小鼠体内诱导的体液免疫水平，利用间接ELISA法检测各组小鼠的血清特异性IgG抗体水平。结果显示，与PBS组相比，Hydrogel组小鼠血清抗体水平无统计学差异（P > 0.05），而in vivo-jetPEI/pDNA组及Gel+in vivo-jetPEI/pDNA组血清特异性IgG抗体水平有升高表现（P < 0.05；P < 0.01），且Gel+in vivo-jetPEI/pDNA组与in vivo-jetPEI/pDNA组比较亦有升高（P < 0.05），这表明DNA疫苗可诱导小鼠体内产生体液免疫反应，DNA疫苗负载于水凝胶后可在一定程度上增强其在小鼠体内诱导的体液免疫水平。

Figure 5 Analysis of serum specific IgG antibody levels in immunized mice (x¯±s, n=3)

A: PBS; B: Hydrogel; C: in vivo-jetPEI/pDNA; D: Gel+in vivo-jetPEI/pDNA *P < 0.05, **P < 0.01 vs PBS group; #P < 0.05 vs in vivo-jetPEI/pDNA group

3.7　PLGA-PEG-PLGA水凝胶可增强DNA疫苗诱导的脾淋巴细胞增殖水平

利用CCK-8法检测经PA OprF蛋白刺激72 h后脾淋巴细胞增殖情况。图6结果显示，与PBS组相比较，Hydrogel组脾淋巴细胞刺激指数（stimulation index， SI）无明显差异（P > 0.05），而in vivo-jetPEI/pDNA组及Gel+in vivo-jetPEI/pDNA组脾淋巴细胞SI明显升高（P < 0.05，P < 0.01），且Gel+in vivo-jetPEI/pDNA组SI较in vivo-jetPEI/pDNA组增高（P < 0.05），这说明脾淋巴细胞在体外受到同一抗原刺激后可再次增殖，水凝胶在一定程度上可增强铜绿假单胞菌OprF DNA疫苗诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖水平。

Figure 6 Proliferation analysis of splenic lymphocytes in immunized mice (x¯±s, n=3)

A: PBS; B: Hydrogel; C: in vivo-jetPEI/pDNA; D: Gel+in vivo-jetPEI/pDNA *P < 0.05 ,**P < 0.01 vs PBS group; #P < 0.05 vs in vivo-jetPEI/pDNA group

3.8　PLGA-PEG-PLGA水凝胶可增强DNA疫苗诱导的脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平

收集各组小鼠脾淋巴细胞上清液，利用ELISA试剂盒检测各组小鼠的细胞上清液分泌IFN-γ水平。结果如图7所示，与PBS组比较，Hydrogel组脾淋巴细胞分泌的IFN-γ水平无统计学差异（P > 0.05），in vivo-jetPEI/pDNA及Gel+in vivo-jetPEI/pDNA组脾淋巴细胞分泌的IFN-γ水平明显增高（P < 0.01），Gel+in vivo-jetPEI/pDNA组IFN-γ分泌水平较in vivo-jetPEI/pDNA组增高（P < 0.01），表明PA DNA疫苗可以诱导小鼠分泌IFN-γ，水凝胶的应用可增强DNA疫苗诱导分泌的IFN-γ水平，这与脾淋巴细胞增殖实验结果类似。

Figure 7 Analysis of IFN-γ in supernatant of splenic lymphocytes in immunized mice (x¯±s, n=3)

A: PBS; B: Hydrogel; C: in vivo-jetPEI/pDNA; D: Gel+in vivo-jetPEI/pDNA **P < 0.01 vs PBS group; ##P < 0.01 vs in vivo-jetPEI/pDNA group

4 讨 论

铜绿假单胞菌感染是临床治疗的一大难题，由于铜绿假单胞菌对现目前大多数抗生素都存在耐药性，并且多重耐药菌株感染率正在逐年上升，因而研究PA疫苗可作为预防PA感染的一项有应用前景的策略。PA疫苗经过几十年的发展，已有不少候选抗原疫苗在各种动物感染模型证实其具有免疫效力并进入临床试验阶段［

4］，但目前仍无真正应用于临床。OprF抗原基因高度保守，其在PA急性感染及慢性感染过程中均可表达［18］，临床前试验及临床试验均证实其具有免疫原性［7-8， 19］，因而OprF是非常有应用前景的一个候选抗原。本课题组前期实验结果也证实pVAX1-OprF-VP22 DNA疫苗可引起小鼠体内产生体液及细胞免疫反应，对PA肺部感染模型具有保护作用［8］。但是DNA疫苗存在抗原提呈细胞摄取率低、易被体内核酶降解而导致免疫原性不足的问题，因而需要新的递送材料去改善这一不足。

温敏水凝胶通常为自由流动的溶胶态，在低温或室温下具有良好的可注射性，被注入目标部位后，因温度变化载药系统可以自发变成半固体凝胶，可以作为药物的缓释库［

20］。PLGA-PEG-PLGA为物理交联的PEG-PLGA三嵌段共聚物，是用于缓释药物载体、细胞和组织工程以及耳部疾病药物输送系统的最深入研究的温敏水凝胶［21］，利用PLGA-PEG-PLGA作为DNA疫苗的递送载体，在体内注射部位形成凝胶持续释放负载的质粒DNA，作为抗原储库起到延长释放、增加抗原提呈细胞对抗原摄取的作用。

通过倒置试管法发现，20% PLGA-PEG-PLGA水凝胶在4 ℃为自由流动的液体，而37 ℃表现为不能流动的凝胶，含或不含PEI/pDNA复合物的PLGA-PEG-PLGA水凝胶相变温度均在32 ℃左右，且在37 ℃条件下均可在2 min内形成凝胶，这说明加入PEI/pDNA复合物对水凝胶的相变温度无明显影响。动态光衍射法对水凝胶胶束粒径检测表明水凝胶自组装形成的胶束直径约44 nm，PDI为0.325，说明水凝胶内部自组装的胶束分布均一。这些结果表明水凝胶在小鼠体内条件下可形成凝胶，具有作为抗原储库递送DNA疫苗、延长释放从而增强免疫效力的潜力。

材料的安全性是应用于体内的必要前提，利用CCK-8法检测含或不含转染试剂/pDNA复合物的水凝胶对DC 2.4细胞的细胞毒性大小，结果表明PLGA-PEG-PLGA水凝胶具有良好的细胞生物相容性，可用于进一步体内实验。体外释放实验表明，在释放7 d后大概80%的质粒DNA从水凝胶中释放出来，说明水凝胶可持续缓慢释放所负载的质粒DNA，延长质粒DNA在体内的留存时间。为了验证水凝胶在体内是否具有可生物降解性，将20% PLGA-PEG-PLGA水凝胶注射至小鼠皮下部位并观察不同时间后皮下水凝胶凝胶残留情况。结果表明，注射15 d后几乎所有的水凝胶都被降解，这表明水凝胶具有生物可降解性，与之前文献报道的结果相似［

22］。PLGA-PEG-PLGA水凝胶以及其降解产物（乳酸、羟基乙酸和PEG）均被普遍认为是安全的材料［23］，在整个实验过程中小鼠精神、活动及进食均正常，这表明PLGA-PEG-PLGA水凝胶是可以应用于体内的安全材料。

为了验证水凝胶可以增强DNA疫苗的免疫效力，将小鼠分为PBS组、Hydrogel组、in vivo-jetPEI/pDNA组以及Gel+in vivo-jetPEI/pDNA组，分别进行免疫，然后收集各组小鼠脾脏淋巴细胞及血清进行相关检测。通过检测免疫小鼠血清特异性IgG抗体和脾淋巴细胞分泌的特异性IFN-γ以评价各组制剂引发的体液及细胞免疫反应水平，结果显示，Hydrogel组的IgG抗体及IFN-γ水平与PBS组无差异，这表明空白水凝胶在体内不会引发小鼠产生特异性免疫反应，水凝胶材料本身不具有特异性免疫原性。而in vivo-jetPEI/pDNA组及Gel+in vivo-jetPEI/pDNA组的IgG抗体及IFN-γ水平均增高，且Gel+in vivo-jetPEI/pDNA组较in vivo-jetPEI/pDNA组增高更明显，表明水凝胶可引起小鼠体内产生更强的体液及细胞免疫反应。

淋巴细胞作为重要的免疫细胞，其增殖情况是激活免疫反应的一个关键事件。脾淋巴细胞增殖实验可以评价抗原特异性脾细胞的免疫功能，间接反映机体的免疫水平［

24］。研究中将各组免疫小鼠脾淋巴细胞与OprF蛋白体外共孵育，测其刺激指数。与PBS组相比，Hydrogel组SI无明显差异，而in vivo-jetPEI/pDNA及Gel+in vivo-jetPEI/pDNA组SI明显增高，且Gel+in vivo-jetPEI/pDNA组较in vivo-jetPEI/pDNA组更高（图6）。这表明免疫后小鼠分离的脾淋巴细胞在体外受到同一抗原的再次刺激时可再次增殖，这可能与脾淋巴细胞获得免疫记忆有关［25］，水凝胶可诱导体内产生更高水平的免疫记忆。

分析水凝胶递送系统增强了DNA疫苗诱导的体液免疫及细胞免疫反应的原因，可能是水凝胶溶液在注射部位形成凝胶后，可持续地释放所负载的质粒DNA，使注射部位细胞周围的质粒DNA浓度保持在较高水平［

26］；此外聚合物降解形成的PLGA-PEG-PLGA胶束与pDNA/阳离子聚合物的共存亦促进细胞对质粒DNA的内吞作用［17， 25］，这两方面的因素共同促进了细胞对质粒DNA的摄取，增强了质粒DNA转染效率，从而引发更强的免疫反应。

综上，本实验制备了载PA DNA疫苗的PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶递送系统，该系统易于制备，具有安全可降解的生物特性，可作为抗原储库持续释放抗原，增强抗原提呈细胞对抗原的摄取，进而诱导体内发生更强的免疫反应，最终达到增强PA DNA疫苗的免疫效力的作用。目前尚无PA DNA疫苗温敏水凝胶递送系统的报道，本研究的载PA DNA 疫苗PLGA-PEG-PLGA温敏水凝胶系统是研发PA DNA疫苗的一种有前景的应用平台。

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