摘要
探讨血根碱与顺铂联用对膀胱癌EJ细胞凋亡的影响。应用CCK-8法检测不同浓度血根碱处理膀胱癌EJ细胞并计算IC50;应用Annexin V FITC/PI法检测空白对照组、血根碱组、顺铂组及联合用药组对细胞凋亡的影响应用;流式仪检测细胞周期阻滞情况;Western blot检测联合用药组对Bcl-2表达的影响;构建裸鼠皮下成瘤模型,进一步验证联合用药组对膀胱癌EJ细胞凋亡以及对荷瘤小鼠减毒作用的影响;同时,通过对小鼠重要脏器的HE染色评估血根碱的安全性。结果表明,血根碱能明显抑制EJ细胞增殖,与空白对照组相比,联合用药组EJ细胞凋亡显著(P < 0.05),且更多的EJ细胞被阻滞在G2/M期,联合用药组显著下调Bcl-2的表达(P < 0.001)。裸鼠皮下成瘤模型中,同空白对照组相比,联合用药组中小鼠肿瘤生长明显变缓,细胞凋亡明显增加(P < 0.05)。联合用药对荷瘤小鼠有减轻顺铂副作用的效果,血根碱的生物安全性高,副作用小。实验结果表明,血根碱与顺铂联合用药可通过引起细胞G2/M阻滞,下调Bcl-2的表达,促进细胞凋亡,进而抑制肿瘤生长。
膀胱癌(bladder cancer,BC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。据WHO最新报道,全球膀胱癌每年新增病例约为74 000例,占所有新发肿瘤总数量的7%,病死率也在不断上升,占所有恶性肿瘤病死率的4%,其发病率和病死率在中国也呈逐年上升趋
当前,已从中草药中发现大量对肿瘤有直接或间接抑制作用的天然产物,以此为先导开发新型化疗药物或治疗方式,极具潜力。血根碱(Sanguinarine)广泛存在于罂粟科(Papaveraceae)白屈菜族(Chelidoniaceae)植物中,是中药白屈菜(Chelidonium majus)、博落回(Macleaya cordata)、血水草(Eomecon chionantha)等的主要活性成分,具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和抗菌等作
本研究以人膀胱癌EJ细胞为研究对象,分别从细胞和动物水平,探讨血根碱及与顺铂联用促进膀胱癌EJ细胞凋亡,抑制肿瘤生长,为血根碱作为新型辅助化疗药物的开发以及膀胱癌的临床治疗提供参考和数据支撑。
血根碱(纯度 ≥ 98%,美国Chemfaces公司);顺铂(纯度 ≥ 99%,美国Sigma公司);RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶、青霉素-链霉素混合液(美国Gibco公司);CCK-8试剂盒、Annexin V FITC/PI凋亡检测试剂盒(北京全式金生物科技公司);细胞周期检测试剂盒(美国英杰公司);PVDF膜(美国Millipore公司);GAPDH抗体(中国Abclonal公司);Bcl-2抗体(美国Santa公司);羊抗鼠IgG(美国Thermo公司);TUNEL试剂盒(瑞士Roche公司)。
X3R台式高速大容量离心机、Multiskan Go1510全波长酶标仪(美国Thermo公司);Ckx41倒置显微镜(日本Olympus公司);FACS Calibur流式细胞分析仪(美国BD公司)。
EJ细胞中加入完全培养基(RPMI 1640培养基中加入10% FBS和1%双抗),于37 ℃ 5% CO2的培养箱中进行培养,每隔2天换一次液,细胞贴壁生长融合至80%左右时传代。细胞生长至对数期且状态良好时进行实验。
将细胞按每孔1 × 1
采用血根碱(3.0 μmol/L)、顺铂(0.5 μg/mL)和血根碱(1.5 μmol/L) + 顺铂(0.25 μg/mL)以及PBS空白对照组分别处理膀胱癌EJ细胞24 h。收集细胞并用预冷PBS洗涤2次,将细胞悬浮于Annexin V 缓冲液100 μL中,设立单染和双染管分别加入PI及FITC(5 μL),在室温下孵育30 min,再加入Annexin V缓冲液400 μL,30 min内用流式细胞仪检测,FlowJo软件用于结果分析。
处理细胞方法同“2.3”项部分。提取细胞总蛋白,制备蛋白样本,进行SDS-PAGE电泳,转膜后封闭2 h,TBST洗涤4次,每次5 min,一抗(Bcl-2抗体、GAPDH抗体)(所有抗体以1∶1 000稀释度使用)孵育4 ℃过夜,TBST洗涤后,使用相对应的二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG(所有抗体以1∶1 000稀释度使用)孵育2 h,洗涤,化学发光显色成像,检测目的蛋白变化。
SPF级雌性BALB/c裸鼠40只,5只1笼,饲养与SPF实验室内,标准饲料和灭菌水随机取食。裸鼠随机分成4组,分为空白对照(生理盐水)组,血根碱(20 mg/kg)组,顺铂(5 mg/kg)组,血根碱(10 mg/kg)联合顺铂(2.5 mg/kg)组。每组10只,构建裸鼠皮下成瘤模型,在小鼠右侧腋下接种EJ细胞悬液125 μL(每只1 × 1
采用不同浓度的血根碱处理EJ细胞24和48 h后,CCK-8实验结果显示,与空白对照组相比,血根碱组处理EJ细胞后,能显著抑制细胞增殖(P < 0.05),且呈时间与剂量依赖关系(

Figure 1 Sanguinarine(Sang)inhibits the cell viability of EJ bladder cancer cells ()
Annexin V FITC/PI结果如

Figure 2 Apoptosis rates of EJ cells in control, Sang, cisplatin (Cis) and combination group in 24 h ()
A: Cell apoptosis of EJ cells in control (DMSO), Sang (3.0 μmol/L), Cis (0.5 μg/mL), and combination group were analyzed by flow cytometry. The dose of Sang and Cis was halved in the combination group; B: Apoptosis rates of control, Sang, Cis, and combination group
流式仪检测细胞周期结果(

Figure 3 Cell cycle of EJ cells in control (A), Sang (B), Cis (C), and combination group (D) in 24 h analyzed by flow cytometry ()
Western blot检测空白对照组、血根碱组、顺铂组及联合用药组的Bcl-2表达量。结果(

Figure 4 Effects of control, Sang, Cis, and combination group on the protein levels of Bcl-2 in EJ cells ()
A: Detection of protein level of Bcl-2 by Western blot; B: Quantitative analysis of protein levels of Bcl-2
实验前,全部裸鼠状态良好,体重无统计学差异,皮肤呈健康粉色,反应灵敏,饮食正常。肿瘤接种成功后,肿瘤体积逐渐增大,外观呈球状,首次给药体重各组间无差异。与空白对照组比较,顺铂组小鼠在实验第20天出现不良反应,表现为普遍精神萎靡不振、活动量减少、喜蜷卧聚集一团、皮肤偏白且粗糙少光泽、背部弓起、体重明显下降,个别出现眼皮肿胀等症状。在实验第28天血根碱组和联合用药组出现类似症状,但程度较轻,精神状态及活动力尚可,体重呈上涨趋势。给药期间,肿瘤体积生长曲线如

Figure 5 Effects of drug combination therapy on antitumor and synergia of tumor-bearing mice ()
A: Alterations of tumor volume in control, Sang, Cis and combination group; B: Anti-tumor effects of control, Sang, Cis, and combination group; C: Tumor weight of control, Sang, Cis, and combination group of mice; D: Tumor inhibition rates
肿瘤组织经HE染色的病理结果如

Figure 6 HE staining and TUNEL assay in tumor tissues of different treatment groups
通过对小鼠主要脏器HE染色来评价血根碱组、顺铂组、联合给药组体内毒性变化(

Figure 7 HE staining of major organs (heart, liver, spleen, lung, kidney) treated with different drug groups (black arrow pointed to the damaged area)
如

Figure 8 Effects of drug combination therapy on antitumor and attenuation toxicity effects of EJ tumor-bearing mice ()
A: Alterations of mice body weight; B:Mice body weights; C: Mice spleen weights; D: Mice liver weights ns:not significant
*P < 0.05 vs Cis group
*P < 0.05 vs Cis group
既往研究发现,顺铂通过进入细胞核作用于DNA分子,干扰DNA修复,导致DNA结构改变,发挥抗肿瘤作
Bcl-2基因是一种原癌基因,具有抑制细胞凋亡的作用。已有报道表明,Bcl-2在多种化疗药物的耐药细胞株中呈高表
同时,随着联合用药方案中,顺铂给药剂量的减少,可有效减轻顺铂不良反应对生存质量的影响。本研究中,对于荷瘤小鼠,联合用药组的生存质量较单独使用顺铂组有较为显著的改善,主要体现在体重的保持以及主要脏器损伤的保护,其中对荷瘤小鼠脾脏损伤的保护作用尤为明显。由于脾脏是免疫功能调节的重要器官,这提示本研究可以通过免疫功能及代谢功能评估进一步探索联合用药对顺铂不良反应减毒效果的可能作用机制,有望为膀胱癌临床化疗的改善提供参考。
References
Witjes JA,Bruins HM,Cathomas R,et al. European association of urology guidelines on muscle-invasive and metastatic bladder cancer: summary of the 2020 guidelines[J]. Eur Urol,2021,79(1):82-104. [百度学术]
Zheng RS,Sun KX,Zhang SW,et al. Report of cancer epidemiology in China,2015[J].Chin J Oncol (中华肿瘤杂志),2019,41(1):19-28. [百度学术]
Huddart RA,Hall E,Lewis R,et al. Patient-reported quality of life outcomes in patients treated for muscle-invasive bladder cancer with radiotherapy ± chemotherapy in the BC 2001 phase III randomised controlled trial[J]. Eur Urol,2020,77(2):260-268. [百度学术]
Berdik C. Unlocking bladder cancer[J]. Nature,2017,551(7679):S34-S35. [百度学术]
Galadari S,Rahman A,Pallichankandy S,et al. Molecular targets and anticancer potential of sanguinarine-a benzophenanthridine alkaloid[J]. Phytomedicine,2017,34:143-153. [百度学术]
Achkar IW,Mraiche F,Mohammad RM,et al. Anticancer potential of sanguinarine for various human malignancies[J]. Future Med Chem,2017,9(9):933-950. [百度学术]
Fu CX,Guan GP,Wang HB. The anticancer effect of sanguinarine:a review[J]. Curr Pharm Des,2018,24(24):2760-2764. [百度学术]
He JJ,Wang JY,Hao JC,et al. Antitumor effect of peptide mPEG-SC20k-HM-3 and oxaliplatin combination against human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 in nude mice[J]. J China Pharm Univ(中国药科大学学报),2015,46(4):476-480. [百度学术]
Dasari S,Tchounwou PB. Cisplatin in cancer therapy:molecular mechanisms of action[J]. Eur J Pharmacol,2014,740:364-378. [百度学术]
Zhang BL,Wang XN,Deng JC,et al. p53-dependent upregulation of miR-16-2 by sanguinarine induces cell cycle arrest and apoptosis in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Lett,2019,459:50-58. [百度学术]
Zhang X,Ouyang HZ,Xu W,et al. Effect of celastrol combined medication on the inhibition of HepG2 cell proliferation[J]. J China Pharm Univ(中国药科大学学报),2020,51(2):185-192. [百度学术]
Lee EF,Harris TJ,Tran S,et al. BCL-XL and MCL-1 are the key BCL-2 family proteins in melanoma cell survival[J]. Cell Death Dis,2019,10:342. [百度学术]