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三七总皂苷玉米脂蛋白纳米粒对大鼠脑缺血再灌注损伤的药效学研究

- ORCID：
梁意萍 ¹
- ORCID：
付文 ¹
- ORCID：
张振海 ²
- ORCID：
吕慧侠 ¹

1. 中国药科大学药学院药剂系，南京 211198； 2. 南京中医药大学附属中西医结合医院江苏省中医药研究院，南京 210028

中图分类号： R944； R965

最近更新：2021-06-28

DOI：10.11665/j.issn.1000-5048.20210308

摘要

对三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）与卵磷脂、β-谷甾醇、玉米醇溶蛋白共组装制备的三七总皂苷玉米脂蛋白纳米粒（PNS-lipid-zein nanoparticles，PLZ-NPs）进行了体外细胞实验，以及大鼠脑缺血再灌注损伤的药效学研究。采用反溶剂沉淀法制备了PLZ-NPs，运用激光粒度仪和透射电镜显微镜对纳米粒进行表征，MTT法评价了纳米粒的细胞毒性，激光共聚焦和流式细胞术分析了Caco-2细胞对纳米粒的摄取情况。大脑中动脉闭塞（MCAO）法构建了大鼠脑缺血再灌注损伤模型，连续3 d灌胃给药后，取脑组织进行2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色，并检测脂质过氧化物丙二醛（MDA）、炎症因子IL-1β、TNF-α、凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的水平。结果显示，PLZ-NPs平均粒径为（116.4 ± 0.81）nm，PDI为0.048，Zeta电位为-（31.5 ± 0.31）mV。MTT实验表明，玉米脂蛋白载体的生物安全性良好，且能显著提高Caco-2细胞对纳米粒的摄取（纳米粒组在4 h时细胞摄取量提高至游离组的1.76倍）。TTC染色中，PNS和PLZ-NPs组的梗死面积比模型组均有减少，另外MDA、IL-1β、TNF-α、Bax的含量明显下降，Bcl-2含量增加，而且PLZ-NPs组对脑缺血再灌注损伤的保护作用显著优于PNS组（P<0.05）。实验结果表明，本实验制备的玉米脂蛋白纳米粒具有良好的稳定性、药物负载能力和生物安全性，能显著提高肠上皮细胞对药物的摄取，有效改善脑缺血再灌注对大鼠造成的损伤。

关键词

三七总皂苷; 玉米醇溶蛋白; 玉米脂蛋白纳米粒; 脑缺血再灌注

三七总皂苷（Panax notginseng saponins，PNS）来源于五加科植物三七，具有改善脑缺血和缺血再灌注引起的损伤、促进神经功能恢复、降低心肌耗氧量、改善心肌供血等功能^［

1-3］，被广泛用于治疗心脑血管疾病。PNS的常用剂型有注射剂、片剂、胶囊剂以及颗粒剂等，如主成分为PNS的血塞通注射剂是一种临床常用的药物。但是中药注射剂的不良反应高发，而且心脑血管疾病的防治通常需要长期用药，因此，开发PNS的口服剂型改善患者的顺应性十分必要。

PNS中的主要成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1均属于具有一定表面活性的皂苷类成分，由皂苷元和糖基构成，具有易溶于水，膜渗透性差的特点^［

4-6］。PNS在胃肠道中不稳定，易被胃酸破坏或被肠道菌群分泌的糖苷酶水解^{［参考文献 7-9}7-9］，从而导致口服生物利用度较低。为提高PNS口服制剂的生物利用度，有报道将PNS制成油包水（W/O）型纳米乳或PNS复合纳米囊泡等纳米制剂进行口服给药，经验证这种纳米结构能有效改善游离PNS口服吸收差的缺点，提高药物的治疗效果^{［参考文献 10-12}10-12］。

玉米醇溶蛋白（zein）是一种生物相容性良好的植物蛋白，含有超过50%的疏水性氨基酸，形成了同时具有亲水区域和疏水区域的两亲性蛋白，这种两亲性特征是玉米醇溶蛋白能够自组装的主要原因之一^［

13］。R1、Rg1和Rb1借助其亲脂性苷元和亲水性糖基，在玉米醇溶蛋白自组装的过程中与其亲水或疏水区域互相缠绕结合，实现对药物高效率的包封与装载，如Hong等^{［参考文献 14

百度学术}14］将卵磷脂包裹在玉米醇溶蛋白表面制备了核壳型结构的纳米粒来包载药物，相比仅有磷脂的纳米粒，核壳型纳米粒的载药量提高了2.3倍。由于玉米醇溶蛋白在中性溶液中不稳定易聚集，因此将玉米醇溶蛋白与透明质酸等多糖或磷脂共用来提高玉米醇溶蛋白纳米粒的稳定性^{［参考文献 15

百度学术}15］。另外，Xie等^{［参考文献 16

百度学术}16］制备的脂化蛋白纳米粒与人工胃液共孵育后，药物残留量从游离组的（29.49 ± 3.28）%增加到了纳米粒组的（43.00 ± 3.77）%，说明脂化蛋白纳米粒的结构可在一定程度上保护玉米醇溶蛋白和药物不被酸性环境和酶破坏。

实验借鉴纳米制剂能够提高药物口服吸收，玉米醇溶蛋白能有效提高载药量的特点，设计并制备了PNS、玉米醇溶蛋白、卵磷脂和β-谷甾醇共组装的三七总皂苷玉米脂蛋白纳米粒（PNS-lipid-zein nanoparticles，PLZ-NPs）。其中卵磷脂作为一种能增强药物膜渗透性的两性离子表面活性剂，常与胆固醇共用制备脂质体^［

17-18］，它能提高纳米粒稳定性以及增强药物与细胞膜的亲和力；β-谷甾醇是一种结构与胆固醇相似的植物甾醇，具有良好的抗氧化活性，取代胆固醇作为脂质体膜材，可避免胆固醇导致心脑血管疾病的负面效应^{［参考文献 19

百度学术}19］。本实验期望所制备的PLZ-NPs纳米粒中的玉米醇溶蛋白能实现自组装负载PNS，同时纳米粒外层的磷脂与β-谷甾醇可以提高玉米醇溶蛋白纳米粒的稳定性，增强纳米粒与肠道上皮细胞的亲和性，并降低胃肠道中酶对药物的降解，最终能提高PNS的口服生物利用度，改善对脑卒中等心脑血管疾病的治疗效果，为此类药物口服剂型的开发提供设计思路和实验基础。

1 材料

1.1　试剂

三七总皂苷（PNS，南京景竹生物科技有限公司，纯度85%）；玉米醇溶蛋白（东京化成工业株式会社）；蛋黄卵磷脂（安庆中创磷脂工程技术有限责任公司）；β-谷甾醇（阿拉丁试剂有限公司）；水合氯醛（上海凌峰化学试剂有限公司）；TTC染色试剂（北京谨明生物科技有限公司）；BCA蛋白含量检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；丙二醛（MDA）试剂盒、ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所）；甲醇、乙醇、乙腈均为色谱纯，其他试剂均为市售分析纯。

1.2　仪器

Nano-ZSE激光粒度仪（英国Malvern公司）；SPARK酶联免疫细胞仪（瑞士Tecan公司）；FV3000激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）；Accuri c6小型全自动流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）；H-7650透射电镜显微镜（日本Hitachi 公司）。

1.3　细胞及动物

人结肠癌细胞株Caco-2（江苏凯基生物技术股份有限公司）。SPF级SD大鼠，雄性，体重（260 ± 20）g，许可证号码：SCXK（沪）018-0004，由南京青龙山动物繁育场提供，所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方法

2.1　PLZ-NPs纳米粒的制备和表征

根据本实验已有经验^［

16］采用反溶剂共沉淀法制备纳米粒。精密称取PNS、玉米醇溶蛋白、卵磷脂和β-谷甾醇（质量比12∶4∶3∶1）溶于适量80%乙醇，再趁热分散于水中，搅拌至溶液呈白色乳光即得三七总皂苷玉米脂蛋白纳米粒（PNS-lipid-zein nanoparticles，PLZ-NPs）。同样的制备方法，不加入脂质制备三七总皂苷玉米蛋白纳米粒（PNS-zein nanoparticles，PZ-NPs）；不加入PNS制备玉米脂蛋白纳米粒（lipid-zein nanoparticles， LZ-NPs）；将异硫氰酸荧光素（FITC）代替PNS，制备得到FITC玉米脂蛋白纳米粒（FITC-lipid-zein nanoparticles，FLZ-NPs）。

将纳米粒溶液适当稀释后，用激光粒度仪测定纳米粒的粒径、PDI以及Zeta电位，并用透射电镜观察形貌。

2.2　PLZ-NPs纳米粒的细胞毒性和细胞摄取实验

2.2.1　Caco-2细胞的培养

Caco-2细胞培养在含10%血清，1%非必需氨基酸，1%双抗的DMEM培养基中，培养设置条件为37 ℃，5% CO₂。

2.2.2　MTT法检测PLZ-NPs纳米粒的细胞毒性

取对数生长期的Caco-2细胞接种于96孔板中并培养48 h后，分别与PNS、PLZ-NPs以及空白纳米粒LZ-NPs共孵育4 h；之后加入1 mg/mL MTT溶液，继续孵育4 h。孵育结束后加入二甲基亚砜（DMSO），酶联免疫细胞仪在570 nm处测定各孔吸收度（A），通过计算得到细胞存活率。

2.2.3　激光共聚焦定性考察细胞对纳米粒的摄取

将对数生长期的Caco-2细胞接种于共聚焦皿上，分别与游离的FITC、FLZ-NPs共孵育4 h。孵育结束后，用4%多聚甲醛固定细胞15 min， DAPI溶液0.1 mL染核15 min，激光共聚焦拍摄细胞摄取图片。

2.2.4　流式细胞仪定量考察细胞对纳米粒的摄取

将对数生长期的Caco-2细胞接种于12孔板中培养48 h后，分别与游离的FITC、FLZ-NPs共孵育1、2、4 h后，流式细胞仪定量测定细胞内的荧光强度。

2.3　纳米粒的对大鼠脑缺血再灌注损伤的治疗

2.3.1　MCAO法建立大鼠脑缺血再灌注模型

大鼠的脑缺血再灌注造模选择雄性SD大鼠（260 ± 20）g，术前禁食12 h，可自由饮水。3.3%水合氯醛（330 mg/kg）腹腔注射麻醉后，剪开颈部皮肤，钝性分离肌肉组织并游离血管，自制栓线从颈外动脉沿着血管插入颈内动脉，直至脑内。大鼠缺血2 h后松动栓线恢复血液灌注，待完全清醒后，选择有行为损伤的动物进行后续实验^［

20-21］。随机选择建模成功的大鼠分为4组（n=5），假手术组（sham）只进行麻醉和血管分离，不结扎及导入线栓，灌胃给予生理盐水；模型组（model）为成功建立缺血再灌注模型后，灌胃给予生理盐水；游离PNS药物组（PNS group）和制剂组（PLZ-NPs group）为成功建模后，分别灌胃游离PNS（200 mg/kg）和PLZ-NPs（含PNS为200 mg/kg）溶液。大鼠手术清醒后灌胃给药，每天1次，连续3 d，最后1天给药4 h后，处死大鼠并取脑组织进行后续实验。

2.3.2　脑组织中相关指标的检测^[

22-24]

取新鲜的大脑组织，-20 ℃冷冻30 min后切成厚度2 mm左右的脑片，用2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液进行染色，正常脑组织染色后呈红色，梗死区呈白色。取梗死对应侧的脑组织，称重后加PBS制备脑组织匀浆液，按试剂盒说明检测蛋白质总含量、丙二醛（MDA）、以及ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β、Bcl-2和Bax的含量。

3 结果

3.1　PLZ-NPs的表征

如图1-A～图1-C所示，不加脂质的PZ-NPs在室温下静置2 h后明显变得浑浊，溶液透光性下降，24 h后出现明显的絮状物沉淀；而PLZ-NPs无明显变化，溶液的乳光和透光性良好，说明脂质的加入显著提高了纳米粒的稳定性。

Figure 1 Images of PZ-NPs (left) and PLZ-NPs (right) at 0 h(A), 2 h(B) and 24 h (C); the TEM images of PLZ-NPs(D) and "fingerprint structure" of PLZ-NPs(E)

PZ-NPs：Panax notginseng saponins-zein nanoparticles；PLZ-NPs：Panax notginseng saponins -lipid-zein nanoparticles

PLZ-NPs的平均粒径为（116.4 ± 0.81）nm，PDI为0.048，Zeta电位为-（31.5 ± 0.31）mV，结合图1-D的TEM图说明，PLZ-NPs的粒径分布均一，无明显的聚集状态，图1-E的标记处存在卵磷脂形成的“指纹结构”^［

25-27］。另外，PZ-NPs的Zeta电位为（17.6 ± 0.7）mV，卵磷脂可通过静电吸引等方式与PZ-NPs相互作用，最终改变了纳米粒Zeta电位的正负值。综上所述，合理推测PLZ-NPs是以玉米蛋白纳米粒为内核，卵磷脂包裹在玉米蛋白纳米粒外层的核壳型纳米粒。

3.2　PLZ-NPs的细胞毒性和细胞摄取实验

MTT法考察了纳米粒的细胞毒性，从图2-A可知，游离药物PNS组、纳米制剂PLZ-NPs组及空白载体LZ-NPs组的质量浓度为50 ~ 400 µg/mL时，细胞存活率均在90%以上，当质量浓度提高到700 µg/mL时，PLZ-NPs组和LZ-NPs组的细胞存活率仍在80%以上，表明PNS、卵磷脂、β-谷甾醇和玉米醇溶蛋白的细胞毒性较低，生物安全性良好。

Figure 2 Cytotoxicity test and the uptake assay in Caco-2 cells by flow cytometry and laser confocal microscopy

A：Cell viability of Caco-2 at different concentrations of Panax notginseng saponins （PNS）, PLZ-NPs and lipid-zein nanoparticles（LZ-NPs） ( $\bar{x} \pm s, n = 6$ ); B：Fluorescence intensity of free FITC and FITC-lipid-zein nanoparticles （FLZ-NPs）uptake by Caco-2 cells at 1, 2, and 4 h ( $\bar{x} \pm s, n = 3$ ); C：Uptake of free FITC and FLZ-NPs in Caco-2 cells ^**P < 0.01, ^***P < 0.001 vs free FITC group

流式细胞术定量检测细胞内荧光强度的结果如图2-B所示，细胞对FLZ-NPs的摄取量显著提升，在1、2、4 h分别增加至游离FITC的620%、1 040%和1 760%，且呈现明显的时间依赖性。

从图2-C中的荧光强度可定性看出，Caco-2细胞对游离FITC和包载FITC的FLZ-NPs纳米粒的摄取有较大差异，细胞对FLZ-NPs的摄取显著增强。FITC和模型药物PNS具有相似的亲水特性，而细胞膜对脂溶性物质的亲和力更强，而FLZ-NPs纳米粒表面的脂质结构改善了FITC的亲脂性，显著提高了细胞的摄取。

3.3　大鼠脑缺血再灌注脑损伤的保护作用

从图3-A可知，假手术组（sham）的脑组织呈正常的红色；而用MCAO法成功建模后，模型组（model）在插入栓线侧的脑组织出现白色梗死区，PNS和PLZ-NPs组的白色区域相对模型组均有减小，说明灌胃给予PNS和PLZ-NPs对大鼠脑损伤有一定的缓解作用。

Figure 3 Detections of PLZ-NPs for the treatment of cerebral ischemia-reperfusion injury in rats ( $\bar{x} \pm s, n = 5$ )

A：TTC staining of brain tissues; B-F：Contents ofMDA (B), IL-1β(C), TNF-α(D), Bax(E) and Bcl-2 (F) in brain tissues ^*P < 0.05, ^**P < 0.01 vs model group; ^#P < 0.05 vs PNS group The sham group was only underwent surgical anesthesia and vascular separation, without ligation and insertion of embolus. Model group was cerebral ischemia reperfusion model which was established by MCAO method, and both groups administered on gavage of normal saline. The PNS group and PLZ-NPs group were established the cerebral ischemia reperfusion model by MCAO, and PNS (200 mg/kg) and PLZ-NPs (200 mg/kg) were administrated with gastric infusion

缺血再灌注损伤通常会加剧代谢性氧化应激和破坏血-脑脊液屏障，最终造成继发性脑组织损伤^［

28-29］，机体中过量的氧自由基会攻击脂质生物膜中的多不饱和脂肪酸，导致脂质氧化生成一系列的脂质过氧化物，如MDA。另外，缺血再灌注后的脑细胞会受到损伤从而产生多种炎症因子，如IL-1β和TNF-α等，因此检测脑组织中的MDA、IL-1β和TNF-α的含量能够间接反映细胞的损伤程度^{［参考文献 30

百度学术}30］。

如图3所示，对比模型组，PNS组和PLZ-NPs组的MDA含量分别下降了约19.6%和33.11%，IL-1β含量分别下降了约20%和27.7%，TNF-α分别下降约13.0%和21.6%；相比PNS组，PLZ-NPs组的MDA含量下降了约16.8%，IL-1β和TNF-α的含量分别下降了约9.6%和9.9%。其中，PNS组和PLZ-NPs组的MDA和IL-1β含量经统计分析具有显著性差异（P<0.05）。

Bcl-2蛋白是一种细胞存活的促进因子，Bax蛋白是与Bcl-2同源的水溶性相关蛋白，Bax基因是一种重要的凋亡基因，过度表达可拮抗Bcl-2的保护效应^［

22，31］。通过检测脑组织中这两种蛋白质的含量，能间接反映药物对损伤的改善作用以及减少细胞凋亡的功效。从图3结果可知，相比模型组，PNS组和PLZ-NPs组的Bax蛋白含量分别下降了约9.5%和18.5%，PLZ-NPs组比PNS组下降了约9.9%；Bcl-2的含量分别上升了约33.8%和58.8%，PLZ-NPs组比PNS组上升了约18.7%。其中，PNS和PLZ-NPs组的Bax含量具有显著性差异（P<0.05）。以上结果表明，PNS和PLZ-NPs能有效改善脑缺血再灌注导致的损伤，对出现梗死后的脑组织具有一定的保护作用，且PLZ-NPs比PNS的作用更强。

4 讨论

玉米醇溶蛋白由于分子内部的疏水作用，可自组装形成表面亲水的球状粒子结构，卵磷脂通过疏水键、氢键和静电吸引等方式与其相互作用^［

32］，形成具有核壳型结构的PLZ-NPs纳米粒，Zeta电位的改变和透射电镜的考察结果也验证了这一设想。

PZ-NPs溶液极不稳定，室温下静置2 h后出现明显的浑浊，溶液透光性下降。推测由于玉米醇溶蛋白的等电点（pI=6.20）与PZ-NPs溶液的pH（pH 6.40）较为接近，导致蛋白分子之间的相互作用减弱，极易碰撞而产生聚集沉淀^［

33］，而卵磷脂的包封降低了分子间的相互作用，显著提升了PLZ-NPs的稳定性。

MTT实验表明，玉米脂蛋白纳米粒的生物相容性良好，与Caco-2细胞共孵育后，能显著提升细胞对亲水性物质的摄取，且摄取量具有时间依赖性，这为PLZ-NPs促进肠上皮细胞对水溶性PNS的摄取和吸收提供了依据。

在药效实验中，相比模型组，PNS和PLZ-NPs组在TTC染色和MDA、IL-1β、TNF-α、Bax、Bcl-2的含量检测中均有更好的表现，且PLZ-NPs的效果优于游离的PNS，推测玉米脂蛋白纳米粒能有效促进肠道对药物的摄取，显著提高了体内的药物浓度，从而改善了药物对脑缺血再灌注损伤的保护作用。

本实验证实了玉米脂蛋白纳米粒能显著促进细胞对亲水性物质的摄取，改善PNS对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，为此类中药口服剂型的开发设计提供了思路与方法。

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三七总皂苷玉米脂蛋白纳米粒对大鼠脑缺血再灌注损伤的药效学研究

摘要

关键词

1 材 料

1.1 试 剂

1.2 仪 器

1.3 细胞及动物

2 方 法

2.1 PLZ-NPs纳米粒的制备和表征

2.2 PLZ-NPs纳米粒的细胞毒性和细胞摄取实验

2.3 纳米粒的对大鼠脑缺血再灌注损伤的治疗

3 结 果

3.1 PLZ-NPs的表征

3.2 PLZ-NPs的细胞毒性和细胞摄取实验

3.3 大鼠脑缺血再灌注脑损伤的保护作用

4 讨 论