摘要
制备吸入用瑞德西韦脂质体并对其体外性质进行评价。首先对瑞德西韦脂质体制备方法进行考察，通过单因素实验确定了制剂的处方组成和制备工艺。然后对瑞德西韦脂质体吸入剂的基本性质、体外沉积性质和空气动力学粒径等进行了全面评价。结果显示，以薄膜分散法制备并以pH 6.5磷酸盐缓冲液为水化介质制得的脂质体其粒径较小、包封率高、48 h几乎无沉淀产生。优化后的处方中药物与二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）的比例为1∶20，胆固醇占总脂材的10%，并加入20%二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-mPEG 2000）以提高脂质体稳定性。在冷冻干燥过程中加入4%海藻糖作为冻干保护剂，得到的冻干剂具有理想的外观并且复溶前后粒径变化较小、稳定性良好。透射电镜下观察到脂质体的微观形态呈表面光滑的球状结构，且粒径分布均匀。体外释放显示，经雾化器雾化前后脂质体混悬液的释放曲线无明显改变；体外沉积性质考察表明，使用新一代撞击器测得的细颗粒占51.4%，质量中值空气动力学粒径小于5 μm。实验结果表明，吸入用瑞德西韦脂质体具有良好的包封率和稳定性，雾化后的脂质体混悬液粒度分布均匀，能够有效地在肺部沉积，为新型冠状病毒肺炎的治疗提供了新的思路。
新型冠状病毒肺炎（COVID-19），简称“新冠肺炎”，是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一种重症急性呼吸综合征。该病毒主要通过呼吸系统进行传播，主要通过作用于肺泡上皮细胞中存在的血管紧张素转换酶-2受体（ACE-2）感染人
瑞德西韦（remdesivir）是一种核苷类似物的氨基磷酸酯前药，其体内活性代谢产物核苷三磷酸（NTP）能够与天然ATP竞争性作用于病毒的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp），引起病毒RNA链延伸过程的错配或终止，抑制病毒的复
本研究采用脂质体为药物载体制备了瑞德西韦脂质体吸入制剂，并以包封率、粒径和多分散系数等为评价指标对其制备工艺进行筛选和优化，旨在制备具有良好的载药能力和空气动力学性质的吸入用瑞德西韦脂质体，以期改善药物在肺内的分布，提高瑞德西韦的治疗效果。
瑞德西韦原料药（批号：20200319，含量：97.9%，中国药科大学徐云根教授实验室提供）；二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC，瑞士Corden Pharma公司）；胆固醇（大连美仑生物技术有限公司）；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-mPEG 2000， 上海艾韦特医药科技有限公司）；甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖（上海麦克林生化科技有限公司）；甲醇（色谱纯，美国Tedia公司），其他试剂均为市售分析纯。
取10 μg/mL瑞德西韦甲醇溶液置于紫外-可见光分光光度计中，于200 ~ 500 nm波长范围下进行紫外全波长图谱的扫描。结果表明，在246 nm波长处瑞德西韦有最大吸收，且此波长处空白脂质体甲醇溶液无明显干扰，因此选择以246 nm作为瑞德西韦含量测定的检测波长较为合适。
精密称取瑞德西韦原料药5 mg于50 mL量瓶中，甲醇溶解定容作为储备液（100 μg/mL）。精密移取适量体积的储备液至10 mL量瓶中，以50%甲醇稀释成质量浓度为2、4、6、8、10、15 μg/mL的系列标准溶液，在246 nm波长条件下使用紫外分光光度计进行测定，以吸收度（A）为纵坐标，样品质量浓度ｃ（μg/mL）为横坐标，进行线性回归，得到线性方程A=0.061 6c - 0.001 5 （
分别采用薄膜分散法、乙醇注入法和逆向蒸发法制备瑞德西韦脂质体。以脂质体的粒径、多分散系数、包封率以及稳定性为考察指标，选择合适的制备方法。
精密称取处方量瑞德西韦原料药、DPPC、胆固醇以及DSPE-mPEG 2000置于圆底烧瓶中，加入氯仿15 mL，溶解混匀后于45 ℃水浴条件下使用旋转蒸发仪除去有机溶剂。加入适量pH 6.5 PBS缓冲液进行水化，冰浴条件下将脂质体混悬液进行探头超声分散（200 W， 10 min）。
精密称取适量DPPC、胆固醇以及DSPE-mPEG 2000，加入无水乙醇5.0 mL溶解。于45 ℃搅拌状态下将药物的乙醇溶液缓慢注入缓冲液中。在45 ~ 50 ℃水浴条件下使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，加入适量pH 6.5 PBS缓冲液定容至5.0 mL，冰浴探头超声分散（200 W， 10 min）。
精密称取处方量瑞德西韦原料药、DPPC、胆固醇以及DSPE-mPEG 2000置于圆底烧瓶中，加入氯仿15 mL溶解，混匀后加入少量pH 6.5 PBS缓冲液探头超声分散（200 W，5 min）形成乳化剂。在45 ℃条件下使用旋转蒸发仪除去有机溶剂，加入适量pH 6.5 PBS缓冲液水化后，冰浴探头超声分散（200 W， 10 min）。
不同方法制备得到的脂质体结果如
控制处方中稳定剂DSPE-mPEG 2000和胆固醇的用量一致，仅调整药物与磷脂的比例分别为1∶5、1∶15、1∶20、1∶30，按照“2.2”项下薄膜分散法制备瑞德西韦脂质体，以粒径及包封率作为考察指标对其进行评价。结果见
Figure 1 Influence of the weight ratio of drug to phospholipid on encapsulation efficiency (EE) and particle size of remdesivir-loaded liposomes ()
控制制备的脂质体中总脂材用量以及药物用量不变，分别加入0%、10%、20%、30%、40%的胆固醇，按照“2.2”项下薄膜分散法制备脂质体，以粒径及包封率作为考察指标对其进行评价。结果如
Figure 2 Influence of the weight ratio of cholesterol on EE and particle size of remdesivir-loaded liposomes ()
实验过程中发现，仅以磷脂和胆固醇为组成成分的脂质体包载瑞德西韦后其粒径可达576 nm，标准差较大，并且24 h内脂质体混悬液有明显沉降，无法维持混悬状态，稳定性极差。因此，选择加入一定量的DSPE-mPEG 2000作为稳定剂。设计比例分别为0%、5%、10%、20%，按照“2.2”项下薄膜分散法制备脂质体，以粒径、包封率和稳定性作为考察指标对其进行评价，结果见
Figure 3 Influence of the weight ratio of DSPE-mPEG 2000 on EE and particle size of remdesivir-loaded liposomes ()
分别以纯化水、生理盐水、pH 4.0醋酸盐缓冲液、pH 6.5 PBS缓冲液以及pH 7.4 PBS缓冲液作为水化介质，考察其对脂质体混悬液的包封率、粒径及外观稳定性的影响。
结果如
Figure 4 Influence of different hydration medium on EE and particle size of remdesivir-loaded liposomes ()ABS: Acetate bufler solution; PBS: Phosphate buffer solution
由于冷冻干燥是一个较为复杂的过程，会对脂质体和药物的活性产生一定的破坏，因此需要加入适量冻干保护剂以减轻冻干造成的应力损伤。因此，分别考察甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖和海藻糖等冻干保护剂对瑞德西韦脂质体冻干的保护作用，暂定其加入量为5% （每100毫升加入5 g）。将冻干制剂的外观、复溶时间及复溶后的粒径、包封率作为评价的指标。
结果表明，无冻干保护剂的脂质体冻干后复溶时间长（67 s），粒径明显增大，稳定性较差，24 h内有大量沉淀。而加入冻干保护剂之后，脂质体冻干前后的粒径变化较小，超声复溶时间明显缩短（5 ~ 12 s），稳定性得到明显提升（
Figure 5 Influence of lyoprotectants (A) and trehalose concentration (B) on EE and particle size of remdesivir-loaded liposomes ()
在此基础上，进一步对海藻糖加入的量进行筛选。实验表明，加入不同浓度的海藻糖作为冻干保护剂制得的样品复溶后脂质体混悬液的粒径无明显差异，且包封率和稳定性均较好。其中，加入冻干保护剂的量为2%时，复溶时间较长（27 s）并且冻干的固体外观形态较差。而按4% ~ 10%的量加入冻干保护剂的制剂各项参数均无明显差异（
采用透射电子显微镜（TEM）观察瑞德西韦脂质体的外观形态。取复溶后的瑞德西韦脂质体混悬液10 μL滴在铜网上，静置3 ~ 5 min后用滤纸吸去多余的水分，向铜网表面滴加2%磷钨酸溶液，负染5 min，烘干后将样品放置在TEM下观察并拍摄电镜照片。如
Figure 6 TEM images of remdesivir-loaded liposomes
适宜的复溶溶剂有利于维持脂质体混悬液的粒径大小、均一性和混悬状态。本实验中分别以纯化水、0.9%生理盐水和pH 6.5 PBS缓冲液作为脂质体冻干制剂的复溶溶剂，以复溶后脂质体的粒径、PDI作为评价指标，考察复溶后脂质体混悬液在25 ℃和4 ℃条件下的稳定性。由
Figure 7 Stability of remdesivir-loaded liposomes at 25 °C (A) and 4 °C (B) after reconstitution in different solvent ()
Figure 8 Drug release curve of remdesivir-loaded liposomes before and after nebulization ()
精密称取相当于瑞德西韦0.5 mg的脂质体冻干制剂3份，以生理盐水2 mL复溶后置于截留相对分子质量为3 500 的透析袋中，以新配制模拟肺液200 mL作为溶出介质，37 ℃下进行药物释放考察。分别于0.25、0.5、1、2、4、6 h时间点取样1 mL，同时补加等温、等体积的模拟肺液。测定瑞德西韦的含量，计算药物的累积释放度并绘制释放度-时间曲线。
收集经雾化器雾化后得到的样品，同法进行释放度测定并绘制释放度-时间曲线，并与未雾化的样品释放行为进行比较。如
参照2020版《中华人民共和国药典》四部通则0951项下的要
吸入瑞德西韦脂质体混悬液经雾化后的药物沉积量分布如
Figure 9 Drug deposition ratio of remdesivir-loaded liposomes ()MOC: Mircro-orifice collector
使用科普利吸入制剂测试数据分析软件（CITDAS）软件计算相关参数：微细粒子百分比（FPF）、质量中值空气动力学粒径（MMAD）和几何标准偏差（GSD）。结果表明，雾化气溶胶颗粒的FPF为（54.31 ± 2.74）%，MMAD为（4.50 ± 0.38） μm；GSD为（2.06 ± 0.34）%。以上数据说明，雾化后脂质体混悬液可能在肺部沉积的微细粒子所占比大于50%，并且雾化液滴符合药典规定的粒径大小，具有较窄的粒径分布，表现出理想的肺部沉积性。
新型冠状病毒的主要通过飞沫传播由呼吸道感染人体，临床主要表现为轻度、中度、重度肺炎和广泛的肺实质损伤。2020年10月FDA批准吉利德公司上市了一款用于静脉注射的瑞德西韦制
脂质体是一种可用于肺部靶向给药的理想载体，它可以制备成不同的粒径、不同的形式以满足给药需求并且能极大程度地改善药物的稳定性。DPPC是肺表面活性剂的主要成分之
瑞德西韦的溶解度较差，通过脂质体包封可显著改善其溶解度，而脂质体包封率主要受到处方中磷脂和胆固醇用量的影响。因此，本研究主要以单因素试验对脂质体处方组成进行优化。结果表明，包封率随磷脂占比的增加而增加，随胆固醇用量的增加而减少。由于胆固醇可嵌入磷脂双分子层中，改善磷脂膜的刚性和稳定性，减少药物在雾化过程的渗
由于瑞德西韦在水溶液中不稳
雾化吸入剂的气溶胶微粒的大小直接影响药物在呼吸系统中的沉积部位和沉积量，进而影响临床药效。微粒的沉积主要由惯性碰撞、重力沉积和扩散运动所决定的。通常惯性碰撞是粒径大于5 μm的气溶胶颗粒沉积的主要机制，此时颗粒主要沉积于主气道和口咽部；粒径在1 ~ 5 μmol/L范围内的微粒可以轻松到达下呼吸道，并沉积在气管、支气管和肺泡；小于0.5 μm的微粒则主要通过布朗扩散作用在呼气过程中被排出肺部。故本研究选择采用NGI测定吸入剂的ASPD，NGI是2015年《中华人民共和国药典》新引入的装置，它能测定不同粒径大小范围内的药物沉积量，获得较双级撞击器更全面的雾化特性数
以上实验表明，本研究开发的吸入用瑞德西韦脂质体能够高效地包载瑞德西韦，体外稳定性良好。对其空气动力学性质的评估表明，雾化后的吸入剂气溶胶微粒满足肺部给药所需的粒径要求，有利于药物经呼吸道直接到达肺部病灶部位，为药物的体内有效性研究奠定了基础。
References
Babadaei MMN，Hasan A，Vahdani Y，et al. Development of remdesivir repositioning as a nucleotide analog against COVID-19 RNA dependent RNA polymerase［J］. J Biomol Struct Dyn，2021，39（10）：3771-3779. [百度学术]
Wang RH，Zheng ZH，Zhang YQ，et al. Progress of research on immune escape mechanism of coronavirus［J］. J China Pharm Univ（中国药科大学学报），2021，52（1）：1-9. [百度学术]
World Health Organization. WHO coronavirus disease （COVID-19） dashboard.［2021-02-18］https：//covid19.who.int. [百度学术]
Bao YF，Xue QR，Wu HP，et al. Advances in point-of-care testing for new Corona virus nucleic acid［J］. J China Pharm Univ（中国药科大学学报），2020，51（6）：635-645. [百度学术]
Kokic G，Hillen HS，Tegunov D，et al. Mechanism of SARS-CoV-2 polymerase stalling by remdesivir［J］. Nat Commun，2021，12（1）：279. [百度学术]
Sheahan TP，Sims AC，Graham RL，et al. Broad-spectrum antiviral GS-5734 inhibits both epidemic and zoonotic coronaviruses［J］. Sci Transl Med，2017，9（396）：eaal3653. [百度学术]
Wang M，Cao R，Zhang L，et al. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus （2019-nCoV） in vitro［J］. Cell Res，2020，30（3）：269-271. [百度学术]
Warren TK，Jordan R，Lo MK，et al. Therapeutic efficacy of the small molecule GS-5734 against Ebola virus in rhesus monkeys［J］. Nature，2016，531（7594）：381-385. [百度学术]
Sun D. Remdesivir for treatment of COVID-19：combination of pulmonary and IV administration may offer aditional benefit［J］. AAPS J，2020，22（4）：77. [百度学术]
Niven RW，Schreier H. Nebulization of liposomes. I. effects of lipid composition［J］. Pharm Res，1990，7（11）：1127-1133. [百度学术]
National Pharmacopoeia Committee. Chinese Pharmacopoeia：Part 4（中华人民共和国药典：四部）［S］. Beijing：China Medical Science and Technology Press，2020：138-143. [百度学术]
U.S. Food and Drug Administration. FDA approves first treatment for COVID-19［EB/OL］.（2020-10-22）. https：//www.fda.gov/news-events/press-announcements/fda - approves - first - treatment-covid-19. [百度学术]
Grein J，Ohmagari N，Shin D，et al. Compassionate use of remdesivir for patients with severe covid-19［J］. N Engl J Med，2020，382（24）：2327-2336. [百度学术]
Veldhuizen R，Nag K，Orgeig S，et al. The role of lipids in pulmonary surfactant［J］. Biochim Biophys Acta，1998，1408（2/3）：90-108. [百度学术]
Boni LT，Miller BS，Malinin V，et al. Sustained release of antiinfectives：US7718189［P］. 2010-05-18. [百度学术]
Siegel D，Hui HC，Doerffler E，et al. Discovery and synthesis of a phosphoramidate prodrug of a pyrrolo［2，1-f］［triazin-4-amino］adenine C-nucleoside （GS-5734） for the treatment of Ebola and emerging viruses［J］. J Med Chem，2017，60（5）：1648-1661. [百度学术]
Wang XY，Gao L，Zhou Y，et al. Comparison of aerodynamic particle size distribution of salmeterol and fluticasone propionate powder for inhalation with the three impactors［J］. Chin J Pharm Anal（药物分析杂志），2020，40（1）：186-197. [百度学术]
Wei NY，Zhou Y，Chen CC，et al. Determination of aerodynamic particle size distribution of ambroxol hydrochloride inhalation solution［J］. Chin J New Drugs（中国新药杂志），2018，27（17）：1994-1998. [百度学术]