摘要
异源表达鲍曼不动杆菌AB0057的UDP-葡萄糖4-差向异构酶并表征其酶学性质以及分析其结构与功能。将异构酶基因构建到pET-28a表达载体并在大肠埃希菌BL21（DE3）中异源表达，使用高效液相色谱检测酶活力及表征酶学性质。系统发育分析、序列比对、同源建模与分子对接分析其结构与关键催化位点。结果显示，重组酶Gne1获得可溶性表达，质量约为38.9 kD，催化最适温度为44 ℃，最适pH为6.0，米氏常数KM与催化常数kcat分别为（1.227 ± 0.082 4） mmol/L和（82.64 ± 3.562） × 1
大多数构型的吡喃糖分子及其衍生物在自然界中较为稀
UDP-葡萄糖4-差向异构酶（EC 5.1.3.2）是作用于UDP-葡萄糖或UDP-半乳糖的C-4差向异构酶，能够特异性改变4-羟基构型以实现两种底物相互转化。不同来源的UDP-葡萄糖4-差向异构酶对底物的杂泛性不同，据此可被分为3类：第1类是对UDP-葡萄糖/UDP-半乳糖具有偏好性，第3类是对UDP-N-乙酰葡萄糖胺/UDP-N-乙酰半乳糖胺均具有偏好性，如来自大肠埃希菌O5：K4：H4的UDP-葡萄糖4-差向异构酶显示出对乙酰化底物更高的活
本研究对与大肠埃希菌UDP-葡萄糖4-差向异构酶进化关系较近的鲍曼不动杆菌AB0057来源的同工酶Gne1的酶学性质进行表征，通过序列比对、同源建模与分子对接等方法揭示了其与底物、辅因子的结合模式和催化机制，为蛋白质工程改造提高酶活力进而应用于稀有功能糖的生物合成提供理论依据。
UDP-葡萄糖4-差向异构酶Gne1（GenBank： ACJ39545.1）来源于鲍曼不动杆菌AB0057；异源表达宿主大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞（北京全式金生物技术有限公司）；UDP-葡萄糖4-差向异构酶基因与表达载体pET-28a（上海生工生物工程股份有限公司）；T7通用引物（北京擎科新业生物技术有限公司）。
PrimeSTAR Max Premix DNA高保真聚合酶（日本宝日医公司）；限制性核酸内切酶（美国赛默飞世尔公司）；质粒DNA小量制备试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；PCR产物纯化试剂盒（美国康宁公司）；PAGE蛋白电泳凝胶制备试剂盒（西安晶彩生物科技有限公司）；Bradford蛋白质浓度测定试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）；蛋白质亲和色谱介质Ni NTA Bead 6FF（常州天地人和生物科技有限公司）；超滤管Amicon Ultra-15（美国默克公司）；尿苷-5'-二磷酸葡萄糖二钠盐（uridine 5'-diphosphoglucose disodium salt，UDPG，上海源叶生物科技有限公司）；尿苷-5'-二磷酸半乳糖二钠盐（上海麦克林生化科技有限公司）；其余试剂为市售分析纯。
UDP-葡萄糖4-差向异构酶与表达载体连接的酶切位点选择Nde I和EcoR I，并根据大肠埃希菌常用密码子对目的基因进行优化，委托公司进行合成。合成的质粒与大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞混匀后42 ℃热激90 s转化，加入LB培养基800 μL 于37 ℃，220 r/min恒温摇床复苏1 h。复苏后经4 000 r/min离心去上清液600 μL，剩余培养基重悬菌体后均匀涂布到含有25 μg/mL 卡那霉素的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养12 h后挑取单克隆转接到含有25 μg/mL卡那霉素LB液体培养基5 mL中，同时使用T7通用引物对单克隆进行菌落PCR验证并送金唯智公司测序。转接后的5 mL LB液体培养基37 ℃，220 r/min培养12 h后提取质粒，限制性核酸内切酶与质粒反应1 h后使用1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。PCR体系和程序以及酶切体系见
挑取测序正确的单克隆接种于含25 μg/mL卡那霉素的LB培养基5 mL中，37 ℃、220 r/min培养过夜，将菌液（0.5%接种量） 5 mL转接于含25 μg/mL卡那霉素的LB培养基1 000 mL中，37 ℃，220 r/min培养至A600为0.6 ~ 0.8（2 ~ 3 h） ，加入IPTG至浓度为1 mmol/L，20 ℃，诱导20 h。诱导结束后，菌液经5 000 r/min离心20 min收集菌体，加入Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH 8.0，250 mmol/L NaCl） 80 mL重悬，使用高压细胞匀质仪破碎菌体。破碎完成后，4 ℃、10 000 r/min、30 min离心2次，收集上清液过Ni柱2次。使用洗涤液1（30 mmol/L咪唑、50 mmol/L Tris-HCl、250 mmol/L NaCl）和洗涤液2（50 mmol/L咪唑、50 mmol/L Tris-HCl、250 mmol/L NaCl）各150 mL（30倍Ni柱体积）以洗脱杂蛋白，使用25 mL（5倍Ni柱体积）洗脱液（200 mmol/L咪唑、50 mmol/L Tris-HCl、250 mmol/L NaCl）洗脱目的蛋白并收集在离心管中。纯化出的酶经10% SDS-PAGE凝胶电泳验证，并转移至截流量为10 kD的超滤管中，5 000 r/min离心20 min，弃滤液，向超滤管中加入Tris-HCl缓冲液（50 mmol/L，pH 8.0）至最高限，5 000 r/min，20 min，重复此步骤5次，将浓缩液转移至2 mL 离心管中，加入少量甘油。使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白质含量。
Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.0）缓冲液的100 μL反应体系中包含5 mg/mL纯化后的蛋白，2 mmol/L天然底物UDP-葡萄糖，37 ℃ 反应1 h，反应结束后沸水浴3 min使酶变性，12 000 r/min离心30 min，吸取上清液并使用0.22 μm滤膜过滤，滤液使用高效液相色谱仪分析，色谱柱为Agilent SB-C18（4.6 mm × 150 mm， 5 μm）分析柱，流速为0.8 mL/min，乙酸三乙胺缓冲液（40 mmol/L，pH 6.0）等度洗脱，柱温25 ℃，进样量5 μL，紫外检测器设置波长为262 nm，分析时间为15 min。
44 ℃，pH 6.0条件下，每分钟转化1 μmol底物所需要的酶量，即1个酶活力单位，以U表示。反应体系中的UDP-葡萄糖浓度按照下式计算：y = 2 131.558 x，
在温度为44 ℃条件下，反应体系中UDP-葡萄糖的浓度为1 mmol/L，pH梯度选择5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，其中pH梯度5.0、6.0、7.0使用50 mmol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制，pH梯度7.0、8.0、9.0使用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液配制，pH梯度9.0和10.0使用50 mmol/L Gly-NaOH缓冲液配制。
使用MEGA 7.0软件对KEGG数据库中选择E.C.number为5.1.3.2、5.1.3.6和5.1.3.7共24条蛋白序列与GalE序列进行比对，比对参数选择默认值，进化树构建方法选择邻接法，自展值设置为1 000，进化距离由p-distance计算。在NCBI中使用Batch CD-search分析该组序列的保守结构域及预测配体的结合位点。将进化关系较近的Gne1的蛋白序列在NCBI中进行Blast分析，数据库选择“PDB protein database”，选择相似度较高5条蛋白序列与Gne1在ClustalX2中进行比对，参数选择默认值，比对结果使用ESPript 3.0软件进行着色，二级结构模板使用来自大肠埃希菌的同工酶（PDB： 1XEL，相似度55.2%）。
T7通用引物扩增的片段长度的理论值为1 336 bp，菌落PCR产物经琼脂糖凝胶电泳验证正确（
Figure 1 Colony PCR results and enzymatic digest verification
M: DNA ladder; 1-4: Coloy PCR results; 5: Recombinant plasmid digested by restriction enzymes
重组酶在1 L的LB培养基中经1 mmol/L IPTG 20 ℃诱导20 h后，离心去除培养基后得到湿菌体的质量为44.5 g。重组酶质量约为38.9 kD，10% SDS-PAGE电泳显示（
Figure 2 SDS-PAGE analysis of the recombinant enzyme
M: Protein marker; 1: Cell lysate; 2: Lysate supernatant; 3: Purified Gne1
对重组酶Gne1的天然活性进行验证，以UDP-葡萄糖为底物，其标准品保留时间为13.0 min，与Gne1反应1 h后，检测到产物UDP-半乳糖生成，保留时间为11.5 min，与UDP-半乳糖标准品保留时间一致（
Figure 3 HPLC assay of Gne1 activity
A: UDP-glucose; B: UDP-galactose; C:UDP-glucose incubated with Gne1
该酶的最适温度进行研究（
Figure 4 Optimal temperature, pH assay and kinetic parameters of Gne1 ()
A: Optimal temperature assay; B: Optimal pH assay; C: Kinetic parameters assay
酶的最适pH探究发现（
根据得出的最适温度44 ℃和最适pH 6.0为反应条件再次反应，反应体系中底物初始浓度为3.0 mmol/L，计算酶比活力为（1.558 ± 0.069 7）mU/mg。
酶促反应动力学研究表明（
选择来源于鲍曼不动杆菌AB0057的UDP-葡萄糖4-差向异构酶（Genbank：ACJ39545.1）进行表征，一个重要的原因是其与研究较透彻的且显示出塔格糖催化活性的来自于大肠埃希菌的同工酶（Genbank：NP_415280.3）进化关系较近（
Figure 5 Bioinformatic analysis of Gne1 with its homologs
A: Multiple sequence alignments; B: Phylogenetic tree analysis
进化分析显示（
预测催化活性位点除了Y150和K154外，还包括上游的N101及S125。预测的NAD结合位点为G8，A10，G11，Y12，I13，D32，N33，L34，S35，N36，S37，G58，D59，I60，F81，A82，G83，K85，N100，S123，S124，S125，Y150，K154，Y178，F179，P181。预测的底物结合位点为S125，A126，T127，Y150，Y178，F179，N180，N199，N200，L201，L216，S217，I218，Y219，G230，R232，Y234，V270，R293，D296。
二级结构预测结果显示，Gne1蛋白包含11个α螺旋和13个β折叠。与NAD相互作用的二级结构涉及7个β折叠与3个α螺旋，分布在Gne1的N端。与底物相互作用的二级结构涉及5个β折叠和4个α螺旋，分布在Gne1的C端。关键催化氨基酸靠近序列中间位置，位于与NAD相互作用位点和与底物相互作用位点的交叠处。
除了进化分析、序列分析和二级结构的研究，同源建模及分子对接可以揭示Gne1的结构特点，从而更加明确蛋白与配体的相互作用，对异构酶的改造作出更明确的指导。
以相似性较高的来自大肠埃希菌的异构酶（序列相似性为55.22%）为模板（PDB ID：1XEL）在Swiss Model网站对Gne1进行同源建模，对建模进行评估显示（
Figure 6 Homologous modelling structure and Ramachandran plot
A: Protein structure of Gne1 homologous modelling; B: Ramachandran plot of Gne homologous modelling
同源建模结果显示（
酶与配体的相互作用结果显示（
Figure 7 Interaction with ligands in Gne1
A: Interaction with NAD; B: Interaction with substrate
与底物UDP-葡萄糖的结合具有重要作用的氨基酸包括Ser125，Asn180，Asn200，Leu201，Ser217，Try219，Asp296。Ser125与葡萄糖的4-羟基紧密接触，距离仅为2.55 Å，除了来自蜡状芽孢杆菌里的蛋白，该位点完全保守，推测其为催化关键位点。Asn180分别与葡萄糖6-羟基和β-磷氧形成氢键，除了链霉菌和蜡状芽孢杆菌的蛋白，该位点完全保守。Arg232和Arg293，分别β-磷氧与和α-磷氧形成氢键及盐桥，前者完全保守，后者除蜡状芽孢杆菌的蛋白外完全保守。Asp296与腺嘌呤核糖的2-羟基形成氢键，除蜡状芽孢杆菌的蛋白，该位点严格保守。
本研究对来源于鲍曼不动杆菌的UDP-葡萄糖4-差向异构酶进行了表征并对与配体结合及催化的相关氨基酸进行了探究。Gne1在大肠埃希菌BL21（DE3）中获得可溶性表达，并显示出对于天然底物UDP-葡萄糖的催化活力，其最适温度和pH分别为44 ℃和pH 6.0，底物浓度为3.0 mmol/L时测得其酶比活力为（1.558 ± 0.069 7） mU/mg，米氏常数KM与催化常数kcat分别为（1.227 ± 0.082 4） mmol/L和（82.64 ± 3.562） × 1
异构酶通常与NAD具有非常高的亲和力，纯化出的酶一般都含有完整的NAD，其可在浓盐酸胍中变性而后从酶中分离出
Gne1除了其N端与NAD结合的结构域外，还有一个用于与底物UDP-葡萄糖结合的较小的C端结构域。与NAD相比，该结构域中与底物相互作用形成氢键的氨基酸仅有7个，形成盐桥的有2个，其他相互作用均比NAD少。其中，与UDP形成氢键相互作用的氨基酸有6个，而与吡喃糖相互作用的氨基酸仅有2个，与UDP结合作用强而与吡喃糖结合作用较弱，这反映了在催化过程中，UDP基团对吡喃糖起到重要的定位作用，因此其对吡喃糖4-羟基构型的催化特异性可能是由于UDP基团的正确定位产生的，同时作用力的减弱也增加了底物的活动性。对大肠埃希菌来源的同工酶晶体结构研究表明，UDP-葡萄糖，UDP-甘露糖，UDP-4-脱氧-4-氟-葡萄糖和UDP-4-脱氧-4-氟-半乳糖在吡喃糖基结合位点中，吡喃糖的取向是不同
然而，除了Ser125，Tyr150可能也参与到了催化作用中，在一些研究中表明，Tyr提供了一般酸碱催化的驱动力，与Ser在介导质子转移中起着重要作用。这两个位点的双重突变Tyr149Phe/ Ser124Ala-GalE的最大活性仅为野生型的千分之一，单点突变后的活性为野生型的千分之一以
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