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金刚纂中木脂素对食管鳞癌细胞的抑制作用

  • 戚微岩 1
  • 夏春磊 1
  • 安柔锦 1
  • 高新梅 1
  • 李东平 1
  • 徐寒梅 1,2
1. 中国药科大学江苏省合成多肽药物发现与评价中心,南京 211198; 2. 中国药科大学天然药物活性组分与 药效国家重点实验室,南京 211198

中图分类号: R931.6R965

最近更新:2022-03-09

DOI:10.11665/j.issn.1000-5048.20220114

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摘要

金刚纂(Euphorbia neriifolia L.)是大戟科植物,采用硅胶柱色谱以及制备HPLC等多种色谱技术,从金刚纂地上部分中分离出5个已知的木脂素成分,并对这5种木脂素的潜在抗肿瘤活性进行体外研究,其中化合物2对食管鳞癌细胞,特别是KYSE-410和KYSE-450细胞,表现出增殖抑制和细胞毒性。机制研究进一步证明化合物2可通过激活caspase-3/9及下调Bcl-2/Bax蛋白表达比例,诱导癌细胞发生显著凋亡。实验结果显示,化合物2在体外对食管鳞癌细胞,尤其是KYSE-410细胞具有显著抑制作用,表明化合物2具有良好的抗肿瘤活性,应对其进行深入研究。

大戟科植物包含约2 000个种属,广泛分布在热带和温带地

1。大戟科植物其化学成分复杂,其中萜烯已被广泛研究。金刚纂是大戟科大戟属植物,作为一种传统药用植物,在关节炎、糖尿病、炎症和肿瘤的治疗中已得到广泛应2-3。大戟属植物中的成分已被证明具有广泛的生物学活性,如细胞毒性、抗炎、抗菌以及抗HIV病毒等活性,但针对金刚纂中的木脂素活性的报道较4-5

从植物中提取的木脂素是中药的重要成分,其中一些已被批准作为治疗药物或药物先导化合

6。本研究从金刚纂的地上部分中分离鉴定出5个已知木脂素,分别为threo-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-{4-[(E)-3-acetoxypropen-1-yl]-2-methoxyphenoxy}propan-1,3-diol (1)、threo-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-{4-[(E)-3-acetoxypropen-1-yl]-2-methoxyphenoxy}propan-1,3-diol-3-acetate (27、黄花菜木脂素A(38、curcasinlignan D (49和丁香脂素(510,并研究其对食管鳞癌细胞系的抑制活性。

1 材 料

1.1 药品与试剂

金刚纂药材地上部分采自广西壮族自治区东兰县,由云南省农业科学环境资源研究所王群副研究员进行鉴定。Welch Ultimate XB-C18柱(20 mm × 250 mm,10 μm,上海月旭科技股份有限公司);300 ~ 400目硅胶(青岛海洋化工工厂);MCI凝胶(CHP20P,75 ~ 150 μm,三菱化学工业有限公司);cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、caspase 3、caspase 9、Bcl-2、Bax抗体(沈阳万类生物科技有限公司);HRP标记的山羊抗兔IgG 和GAPDH抗体(杭州联科生物技术股份有限公司);TBST(武汉赛维尔生物科技有限公司);Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(南京建成科技有限公司)RPMI-1640培养基(以色列Biological Industries公司);胎牛血清(以色列Biological Industries公司);CDCl3(北京百灵威科技有限公司);其他试剂均为市售分析纯。

1.2 细 胞

人食管鳞癌细胞(TE-13、KYSE-410、KYSE-450)和人正常食管上皮细胞HEEC由江苏省合成多肽药物发现与评价中心提供

1.3 仪 器

Avance-500M核磁共振光谱仪(德国Bruker公司);1100 ESI/TOF质谱仪(美国Agilent公司);LC-6AD半制备高效液相色谱(日本Shimadzu公司);MACS Quant流式细胞仪(德国Mitenyi公司);Multiskan FC酶标仪(美国Thermo公司);5200全自动化学发光成像系统(上海天能科技有限公司);IX53倒置显微镜(日本Olympus公司)。

2 方 法

2.1 金刚纂木脂素的分离提取

金刚纂地上部分2 kg,室温下95%乙醇提取3次(10 L × 3),得到乙醇提取物300 g。残余成分使用水重悬,上清液分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取。乙酸乙酯部分(92 g)通过MCI凝胶柱以甲醇-水(3∶7 ~ 1∶9)洗脱。90%馏分(12 g)采用硅胶柱色谱(CC),石油醚-乙酸乙酯(30∶1 ~ 1∶1)洗脱,分离得到6个馏分(Fr.1 ~ Fr.6)。Fr.2通过硅胶柱(CHCl3-MeOH,150∶1)和半制备HPLC(CH3CN-H2O,40∶60,3 mL/min)分离,用于制备化合物1(2.1 mg,20.6 min)与化合物2(3.9 mg,19.8 min)。Fr.3c通过硅胶色谱(CHCl3-MeOH,150∶1)分离得到2个组分,Fr.3a和Fr.3b。Fr.3a通过HPLC(CH3CN-H2O,35∶65,3 mL/min)纯化得到化合物4(5.1 mg,40.8 min)。Fr.3c通过Sephadex LH-20(MeOH)凝胶色谱分离得到化合物3(8.9 mg)和化合物5(2.3 mg)。

2.2 细胞毒活性检测

将人食管鳞癌细胞(TE-13、KYSE-410、KYSE-450)和人正常食管上皮细胞HEEC用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,37 ℃,5%CO2环境培养。细胞密度达到70% ~ 90%时,用0.25%胰蛋白酶溶液重悬分离培养,调节密度为每毫升3.0 × 104个细胞,接种于96孔板,每孔100 μL,培育过夜。以紫杉醇作为阳性对照,以不同浓度化合物给予细胞,孵育48 h,每孔终体积200 μL。孵育后,每孔加入5 mg/mL MTT试剂20 μL,37 ℃,5% CO2孵育4 h,设一组不含药物孔为对照孔。除去培养基,每孔用DMSO 100 μL,用Thermo酶标仪在570 nm处检测吸收度,并在630 nm处进行校正。

2.3 细胞凋亡检测

细胞凋亡检测步骤按照试剂盒说明书进行。将KYSE-410细胞接种于6孔板中,培养过夜,第2天加入不同浓度的化合物2(终浓度为1,2,4 μg/mL)。孵育24 h后,收集细胞并使用PBS缓冲液轻柔冲洗,然后加入结合缓冲液500 μL重悬细胞,最终得到浓度为每毫升8 × 106个细胞的重悬液。在细胞悬液中加入Annexin V-Light 650 5 μL和碘化丙啶10 μL,室温避光反应10 min,然后通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.4 Western blot检测

对线粒体凋亡通路相关蛋白,包括Bax、Bcl-2、caspase-3/cleaved caspase-3及caspase-9/cleaved caspase-9进行检测,使用GAPDH作为内参。将KYSE-410细胞接种于6孔板内,培养过夜,并在第2天使用不同浓度的化合物2(终浓度为1,2,4 μg/mL)处理。孵育24 h后,使用冷PBS清洗,并使用含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液在4 ℃裂解30 min,裂解后使用12 000 r/min,4 ℃离心20 min。蛋白质浓度通过BCA定量试剂盒检测。然后进行SDS-PAGE电泳,上样后 80 V恒压电泳,湿转恒流转膜,5%脱脂奶粉封闭2 h后,TBST洗膜3次,每次 10 min,4 ℃孵育一抗过夜;TBST洗膜3次,每次10 min,室温孵育二抗2 h后,TBST 洗膜 3次,每次10 min。采用Tanon 5200图像系统采集发光图像。

2.5 软琼脂细胞集落形成实验

将中、低熔点琼脂糖放入水浴锅中,6孔板中每孔加入含0.8%琼脂糖的培养基0.5 mL,4 ℃冷却固化作为基础层。细胞用不同浓度的化合物2(终浓度为1,2,4 μg/mL)处理48 h,与0.8%琼脂糖混合加入孔内,冷却固化形成中层。最终,每孔加入生长培养基0.5 mL,每孔总体积为1.5 mL。平板在5% CO2,37 ℃环境下培养15 d,每2 ~ 3天更换培养基。培养过程中持续观察细胞集落形成情况。第16天,移除培养基,每孔加入含4%甲醛和0.01%结晶紫的PBS溶液1 mL染色。1 h后,使用PBS冲洗每孔,直到背景清晰,随机选取5个视野,并成像统计计数。

3 结果与讨论

3.1 金刚纂中木脂素成分的鉴定

通过对金刚纂的乙酸乙酯部分进行分离,从中分离并鉴定出5个木脂素类化合物(图1),通过和已有报道和实验光谱数据进行对比,最终确定这5个化合物分别为threo-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-{4-[(E)-3-acetoxypropen-1-yl]-2-methoxyphenoxy} propan-1,3-diol (1),threo-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-{4-[(E)-3-acetoxypropen-1-yl]-2-methoxyphenoxy}propan1,3-diol-3-acetate (2

7,黄花菜木脂素A(38,curcasinlignan D (49和丁香脂素(510。化合物1和2均为首次从大戟属植物中分离得到。

Figure 1 Chemical structures of compounds 1-5

3.2 MTT法检测细胞毒性

MTT检测法是一种快速方便高通量筛选方法,可用于评估药物在细胞增殖的作用和细胞毒

11。食管鳞癌细胞是食管癌的主要类型,具有高发病率和致死率,在近期成为了热点医疗健康问12。本研究中应用了TE-13、KYSE-410、KYSE-450 3种不同的食管鳞癌细胞亚型,以及人正常食管上皮细胞HEEC对目标化合物的细胞毒性进行评估。结果表明化合物2在以上4种细胞内均表现出了中等的细胞毒性,其中在KYSE-410中IC50达到1.920 μg/mL。这些数据表明化合物2可显著抑制3种食管鳞癌细胞的生长,但同时也对人类正常食管上皮细胞HEEC存在毒性。同时,与化合物1相比,C-9'位的乙酰基可增强该类成分的细胞毒性。

Table 1 Cytotoxicity [IC50 (μg/mL)] of compounds 1-5 from the aerial parts of E.neriifolia L.against five esophageal squamous cancer cells and one human normal esophageal epithelial cells (HEEC) (x¯±s, n=5)
CompoundIC50/(μg/mL)
HEECKYSE-410KYSE-450TE-13
1 >20 >20 >20 >20
2 16.600 ± 0.18 1.920 ± 0.21 3.432 ± 0.14 20.045 ± 0.23
3 >20 >20 >20 >20
4 >20 >20 >20 >20
5 >20 >20 >20 >20
Taxol 0.008 ± 0.002 0.0047 ± 0.001 0.005 ± 0.007 0.063 ± 0.008

3.3 化合物2在体外促食管鳞癌细胞凋亡

化合物2对KYSE-410人食管鳞癌细胞系具有高细胞毒性。由于肿瘤细胞凋亡是影响肿瘤生存主要原因,首先测试化合物2对细胞凋亡的影响。使用化合物2处理KYSE-410细胞系,孵育24 h后,采用流式细胞术检测KYSE-410细胞早期和晚期凋亡情况(图2)。与对照组比较,化合物2以剂量依赖方式诱导KYSE-410细胞凋亡,在质量浓度为2 μg/mL时取得最佳效果,凋亡细胞占比达到66.26%,统计学结果如图2-E中所示。

Figure 2 Compound 2 induced KYSE-410 cells apoptosis

A-D:The cells were treated with compound 2 for 24 h at 1, 2 and 4 μg/mL to evaluate the early and late apoptosis respectively; E:Represent histograms for apoptosis rate in KYSE-40 (x¯±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group

3.4 化合物2通过线粒体凋亡通路诱导细胞凋亡

线粒体途径的主要特征是线粒体参与凋亡通路,异常激活的caspase相关蛋白在诱导线粒体凋亡中起到重要作

13。如结果图3所示,给予化合物2后,通过Western blot检测,cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的表达水平均有上调,而caspase 3和caspase 9的表达水平则基本无变化,表明化合物2是通过促进caspase相关蛋白的激活,诱导细胞凋亡。

Figure 3 Compound 2 induced KYSE-410 cells apoptosis through mitochondrial pathway. KYSE-410 cells were treated with compound 2 for 24 h at 1, 2 and 4 μg/mL to detect the expression of related proteins by Western blot (x¯±s, n=3)

A:Expression of Bax, Bcl-2, caspase-3/cleaved caspase-3 and caspase-9/cleaved caspase-9 were detected by Western blot;B:Represent histograms for the fold change of cleaved caspas 3/caspase 3 in KYSE-40 treated with compound 2;C:Represent histograms for the fold change of cleaved caspas 9/caspase 9 in KYSE-40 treated with compound 2;D:Represent histograms for the fold change of Bcl-2 and Bax in KYSE-40 treated with compound 2 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group

Bcl-2蛋白家族通过线粒体应激在细胞凋亡中发挥重要作用。Bax和Bcl-2均属于Bcl-2蛋白家族。Bcl-2是细胞凋亡抑制因子,而Bax则发挥促细胞凋亡功能。Bcl-2和Bax蛋白的表达水平对凋亡有关键影

14。化合物2可以剂量依赖方式显著上调Bax的表达水平,同时下调Bcl-2的表达,结果如图3中所示。但采用流式细胞术检测凋亡实验中,化合物2在2 μg/mL时的效果最好,凋亡细胞占比达到66.26%,综合其对于caspase 3和caspase 9的影响,表明化合物2不仅仅是通过作用于对于Bcl-2蛋白家族而产生的凋亡作用,而是通过影响多个蛋白而产生的综合效果。综上所述,化合物2可激活caspase 3和caspase 9,上调Bax的表达并抑制Bcl-2表达,并进一步以此调节细胞凋亡。

3.5 细胞集落形成实验

肿瘤干细胞被认为在肿瘤的形成、恶化和化疗药物耐药中发挥重要作

15-17。靶向肿瘤干细胞的抗肿瘤疗法被认为具有良好的发展前景。集落形成实验是检测肿瘤细胞干性的常用方15。食管鳞癌细胞KYSE-410按不同分组,提前给予化合物2,孵育48 h。如结果(图4)所示,与对照组相比,当化合物2质量浓度为2 μg/mL时,可显著抑制细胞集落形成。这也进一步证明了流式细胞术检测的结果,即化合物2在2 μg/mL时具有较好的抑制凋亡的作用。

Figure 4 Cells pretreated with the compound 2 exhibited a good inhibition of colony formation capacity in KYSE-410 cells (x¯±s, n=5)

A:Colony formation of KYSE-410 cells pretreated with compound 2 for 48 h at 1, 2 and 4 μg/mL, respectively;B:Quantitation of cell colony numbers *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group

4 结 论

本研究对金刚纂地上部分中分离得到的5个已知木脂素类化合物进行活性研究,发现化合物2对食管鳞癌细胞具有较好的细胞毒活性,并显著抑制细胞集落形成。此外,化合物2可通过调控线粒体凋亡通路促进KYSE-410细胞的凋亡,值得进一步深入研究。

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