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花生五烯酸与透明质酸接枝物的合成及其抗肝癌活性

  • 崔杰 1
  • 夏一帆 1
  • 张文典 2 ✉
  • 段少峰 1
1. 河南大学药学院，开封 457001； 2. 广东省人民医院(广东省医学科学院)，广州 510080

中图分类号： R914； R965

最近更新：2022-03-09

DOI：10.11665/j.issn.1000-5048.20220107

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EN 引
目录contents

摘要

合成花生五烯酸（EPA）与透明质酸（HA）耦合物，初步评价其体外抗肝癌活性。通过胱胺将花生五烯酸与透明质酸连接，合成了一种透明质酸-花生五烯酸接枝物（HA-EPA），利用核磁共振仪（1H NMR）和傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）对其结构进行了表征，利用激光粒度及Zeta电位分析仪检测了其粒径与电位。采用MTT法检测了HA-EPA对肝癌细胞HepG2，Huh-7和正常肝细胞LX-2的体外抗细胞增殖作用。利用EdU染色与TUNEL染色法，考察了HA-EPA对HepG2细胞体外增殖与凋亡的影响。流式细胞术进一步验证了凋亡情况。通过迁移和侵袭实验考察了HA-EPA对HepG2细胞迁移和侵袭能力的影响。1H NMR结果显示，HA-EPA被成功合成，且EPA在HA上的接枝率约（40 ± 5）%；FT-IR结果进一步确证了HA-EPA的结构；粒径为（162.5 ± 10.2） nm，电位为-（4.47 ± 0.31） mV；MTT结果表明，随着药物处理时间延长，相同EPA含量下HA-EPA表现出优于EPA的对HepG2与Huh-7细胞活性抑制能力。当作用48 h，HA-EPA对正常肝细胞LX-2的毒性小于EPA。HepG2的24 h增殖、凋亡、迁移与侵袭实验结果显示，透明质酸的接枝提高了EPA抑制HepG2细胞增殖，促进凋亡，抑制迁移与侵袭的能力（P < 0.001），说明HA的接枝可以明显增强EPA的肝癌抑制效果并起到一定的减毒作用。

不饱和脂肪酸是一类人体生长发育所必须的脂肪酸，根据链长和不饱和程度分为单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸两种［

1-3］。食用多不饱和脂肪酸可以预防或减缓疾病的发生［4-6］。有研究表明，花生五烯酸和花生六烯酸可以增加肿瘤对放射治疗的敏感性，减少放疗导致的黏膜和上皮损伤［7-9］。体内试验还证实，ω-3多不饱和脂肪酸与ω-6多不饱和脂肪酸相比有更显著的抑癌优势［10］。ω-3多不饱和脂肪酸可以与化疗或放疗产生协同作用，从而通过增加氧化应激来杀死肿瘤细胞。在此过程中，ω-3脂肪酸可以减少肿瘤血管生成［11-13］、减轻炎症［14-16］、避免肿瘤转移［17-18］。

肝癌是全球第4大肿瘤，与总体肿瘤病死率的下降趋势相反，在过去的几十年中，肝癌的发病率和病死率逐年上升［

19］。虽然传统的治疗手段收效甚微，但是随着纳米医学的兴起，利用纳米材料靶向递送药物为肝癌的治疗带来了新的解决方法［20-21］。

本研究所用花生五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）是一种广泛存在于海洋动植物中的ω-3不饱和脂肪酸。目前大量药理研究表明EPA对肝癌具有抑制作用，但是其作为一种常见的食用补剂，虽有一定的效果，但相对化疗药物而言还有很大的差距。透明质酸（hyaluronic acid， HA）由于其优秀的亲水性、长循环和安全性被广泛用于脂溶性化合物的药物递送［

22］。庞鑫等［23］通过HA接枝槲皮素，发现HA作为载体，在同等药物浓度水平下，能向肿瘤细胞内释放更多的药物，从而产生更强的细胞杀伤作用。赖华禄等［24］制备了前药结合物HA-ADH-Cur，带有负电性的HA外壳，导致纳米颗粒倾向于聚集在肿瘤组织中，全身毒性较低。于是本研究通过化学接枝的方法将HA和EPA偶联，以期提高EPA的肝癌抑制作用与安全性，增加其临床应用的可能性。实验最终合成了一种EPA接枝物，利用核磁共振（1H NMR）和傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）进行了结构表征；DLS法测量了粒径与电位；对其进行了肝癌细胞HepG2、Huh-7和正常肝细胞LX-2体外活性评价，并通过EdU染色法评价了对HepG2的增殖抑制作用，通过TUNEL和流式细胞仪评价对HepG2的凋亡促进作用，通过Transwell和Invasion评价了对肝癌细胞的迁移和侵袭能力的影响。

1 材 料

1.1　药品与试剂

胱胺二盐酸盐（cystamine dihydrochloride，上海萨恩化学技术有限公司）；EPA（江苏艾康医药科技有限公司）；HA（Mr 8 000，山东福瑞达生物医药有限公司）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）、N-羟基丁二酰亚胺（NHS）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，浙江天杭生物科技股份有限公司）；多聚甲醛固定液、结晶紫染色液（上海碧云天生物技术有限公司）；DMEM培养基、DAPI染色液、AnnexinV Alexa Fluor488/PI凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；EdU/Apollo567细胞增殖检测试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（广州锐博生物科技有限公司）；Transwell小室、Invasion小室（美国Corning公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2　仪 器

ZEN3690激光粒度仪（英国马尔文公司）；is50 FT-IR红外分光光度计（美国热电有限公司）；Avance Ⅲ 全数字化超导核磁共振谱仪（瑞士布鲁克有限公司）；IX53倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯股份公司）；FACS Verse型流式细胞仪（美国BD生物科技有限公司）；酶联免疫检测仪（美国赛默飞世公司）。

1.3　细 胞

人肝癌细胞Huh-7、HepG2与人肝星形细胞LX-2均由河南大学医学院提供。

2 方 法

2.1　HA-EPA的合成

2.1.1　透明质酸-胺(HA-amine)的合成

精密称取透明质酸20 mmol溶于去离子水中，依次加入EDC·HCl 24 mmol、胱胺二盐酸盐60 mmol，用2 mol/L HCl将溶液pH调至4.75，室温搅拌反应2 h后，加入1 mol/L NaOH将溶液pH调至7，然后终止反应。取反应液于截留分子量为8 000透析袋中，去离子水透析48 h，每4小时换一次透析水。透析完液体冷冻干燥24 h，得乳白色蓬松固体。

2.1.2　二十碳五烯酸琥珀酸单酯活化物(EPA-NHS)的合成

将0.5 mmol EPA溶于干燥的二氯甲烷中，先后加入0.6 mmol NHS，1 mmol EDC·HCl，室温搅拌6 h；薄层色谱法监测反应结束后，旋干溶剂得粗产物黄色固体，直接用于下一步反应。

2.1.3　HA-EPA的合成

取HA-amine 1 mmol与EPA-NHS粗产品1.2 mmol共溶于二甲基甲酰胺10 mL，于室温反应过夜；待反应结束后，将反应液装入截留分子量为3 500的透析袋，于去离子水中透析48 h除去小分子量副产物，每4小时换一次透析水；透析后的产物置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥24 h，得产品为淡黄色蓬松固体。

2.2　HA-EPA的表征

2.2.1　1H NMR表征

称取HA-EPA 15 mg，以DMSO-d6为溶剂将产物溶解，利用核磁共振仪测定产物的核磁共振氢谱（1H NMR）。

2.2.2　FT-IR表征

取适量HA-EPA，用FT-IR系统分析产物，对终产物进行结构佐证。

2.2.3　平均粒径、多分散系数(PDI)和Zeta电位的测定

取适量HA-EPA固体，用蒸馏水稀释后，采用马尔文ZEN3690激光粒度仪测定粒径、分散系数和Zeta电位。

2.3　HA-EPA对于HepG2的增殖、凋亡、迁移与侵袭能力的影响

通过MTT法验证了HA-EPA对正常肝细胞LX-2的毒性，并测得了不同浓度与时间下HepG2和Huh-7的细胞存活率；通过EdU、TUNEL、流式凋亡、Transwell与Invasion实验检测250 μmol/L HA、EPA和HA-EPA给药后HepG2的增殖、凋亡、迁移与侵袭相关能力的影响。

2.3.1　HepG2、Huh-7、LX-2细胞的培养

HepG2、Huh-7、LX-2细胞用含有1%青霉素链霉素和10% FBS的DMEM培养基培养。待细胞生长稳定后，取处于对数生长期的细胞用于体外细胞实验。

2.3.2　细胞毒活性实验

采用MTT法测试EPA与HA-EPA对人肝癌细胞 HepG2、Huh-7及正常肝细胞LX-2的体外活性实验。于96孔板每孔加100 μL含细胞培养液，每孔1 × 104 ~ 2 × 104个细胞，贴壁稳定后，每孔加入含药培养液100 μL，终浓度为0，25，50，100，200，400 μmol/L，每组5个复孔，分别培育24，48，72 h。0.5 % PBS配制的MTT溶液加入细胞孔，每孔20 μL，培养箱中孵育4 h。弃上清液，每孔DMSO 150 μL，用酶联免疫检测仪孵育10 min测定每孔在波长为570 nm处的吸收度，计算细胞活力。

2.3.3　细胞增殖实验

96孔板每孔2 × 104个HepG2细胞，配制空白对照，250 μmol/L HA、EPA和HA-EPA培养基溶液给药24 h，每组3个复孔。EdU孵育，多聚甲醛固定液固定，Apollo567染色，DAPI染色，荧光显微镜进行成像，计算细胞增殖率。

2.3.4　细胞凋亡实验

铺板给药同细胞增殖实验，给药24 h后弃培养液，固定细胞，加TUNEL检测液，DAPI染色，荧光显微镜成像，计算细胞凋亡率。HepG2细胞以每孔1 × 105个细胞的密度接种于12孔板，贴壁给药24 h后，收集细胞，AnnexinV Alexa Fluor488与PI染色，流式细胞仪检测。

2.3.5　细胞迁移与侵袭实验

准备Transwell小室，下室为20% FBS培养基，上室为4 × 104个HepG2细胞和上述不同组药物无血清培养液，培养24 h后，将穿过小室的细胞固定、结晶紫染色液染色，于显微镜（100 × ）下拍照并计算细胞迁移数。准备侵袭小室，加入完全培养基200 µL并置于培养箱中活化30 min，其余操作同上，计算细胞侵袭数。

2.4　统计分析

采用GraphPad Prism 5软件对实验数据进行描述性统计，计量资料结果以x¯ ± s表示，两组之间比较选用t检验和方差分析，P < 0.05表明差异有统计学意义。

3 结 果

3.1　HA-EPA的合成

HA和EPA都含有羧基，胱胺两端为氨基。本研究以酰胺反应为合成手段，以EDC和NHS为催化剂，先合成氨基化的透明质酸（HA-amine），再将活化的EPA与之反应，将HA与EPA通过胱胺相连，将EPA成功与HA相连，合成了HA-EPA，合成路线如图1所示。

Figure 1 Synthesis of hyaluronic acid (HA)- eicosapentaenoic acid (EPA)

3.2　1H NMR图谱解析

HA、EPA和HA-EPA的1H NMR图谱如图2所示。图2-A为HA的1H NMR图谱，δ 4.79为溶剂（D2O）峰，δ 4.50，4.40两个双重峰为HA的半缩醛的两个质子峰，δ 1.96的峰为HA的甲基质子峰，δ 3.78 ~ 3.29为HA的剩余质子峰。图2-B为EPA核磁氢谱图，δ 7.26为溶剂（CDCl3）峰，δ 5.56 ~ 5.22的多重峰为烯烃的10个质子峰，δ 2.83为二烯间亚甲基的8个质子峰，δ2.36 ~ 1.71为剩余亚甲基的8个质子峰，δ 0.97的三重峰为末端甲基质子峰。图2-C中HA-EPA接枝物1H NMR结果显示除了δ 3.54 ~ 3.67处出现了较强的HA的峰外，在δ 5.56 ~ 5.22、δ 2.83、δ 0.97处出现了EPA结构上的质子信号峰，此为EPA的特征信号峰，由此推断HA-EPA已成功合成，且由HA在δ 4.50 ~ 4.40的积分值1.00（两个质子峰）与EPA在δ 5.56 ~ 5.22的积分值2.01（10个质子峰）和δ 0.94 ~ 0.89的积分值0.60（3个质子峰）的比值推算，EPA在HA上的接枝率约40%。

Figure 2 1H NMR spectra of HA in D2O (A); EPA in CDCl3 (B);HA-EPA in DMSO-d6 (C)

3.3　FT-IR图谱解析

如图3所示，EPA的红外特征峰有3 011 cm-1不饱和烯烃的伸缩振动峰，2 963 cm-1饱和C-H的伸缩振动峰，1 413 cm-1为-CH2-的弯曲振动峰，1 705 cm-1为羰基的伸缩振动，1 239 cm-1为C-O-C的伸缩振动；HA的红外特征峰有3 385 cm-1的-OH伸缩振动峰，2 895 cm-1的C-H伸缩振动峰，1 046 cm-1的C-O-C伸缩振动峰；HA-EPA中1 553 cm-1的 -NH的弯曲振动，1 375 cm-1的C-N的伸缩振动证明了新的酰胺键的存在，3 312 cm-1，2 934 cm-1，1 077 cm-1的峰为HA的特征峰，1 737 cm-1，1 648 cm-1的峰为EPA羰基和顺式双键的伸缩振动，从而证实所合成的接枝物为所需要的目标化合物。

Figure 3 IR spectra of EPA (A), HA (B) and HA-EPA (C)

3.4　平均粒径、多分散系数(PDI)和Zeta电位

采用激光粒度仪测定各项指标。测得HA-EPA的平均粒径为（162.5 ± 10.2） nm，PDI为0.188 ± 0.09。经电位分析测试接枝物的Zeta电位为-（4.47 ± 0.31） mV。

3.5　细胞毒活性实验

如图4所示，HepG2与Huh-7的细胞活力随着EPA与HA-EPA的浓度增大而减小，作用时间越长，细胞活力也相应减小。相同EPA含量下的HA-EPA较于单体有更强的抑制效果。本研究进一步考察了EPA与HA-EPA对人正常肝细胞LX-2的影响。如图5所示，对于LX-2而言，同样浓度的HA-EPA相较于单体EPA处理48 h细胞存活率更高。

Figure 4 Cell viability of HepG2 cells (A) and Huh-7 cells (B) treated by EPA or HA-EPA for 24, 48, 72 h (x¯±s, n=3)

Figure 5 Cell viability of LX-2 cells treated by EPA or HA-EPA for 48 h (x¯±s, n=3)

3.6　细胞增殖实验

如图6所示，染色后，荧光显微镜可见经HA-EPA处理后，该组HepG2增殖数量远远低于对照组与HA组，显著优于EPA组。

Figure 6 EdU proliferation assay analysis of the effect of HA, EPA and HA-EPA on the growth of HepG2 cells (x¯±s, n=3)

A: Typical photos; B: Quantitation of cell proliferation ****P < 0.000 1 vs control group; ++++P < 0.000 1 vs HA group; &&&&P < 0.000 1 vs EPA group

3.7　细胞凋亡实验

如图7所示，TUNEL实验结果表明，HA-EPA处理过的HepG2细胞，被标记的凋亡细胞相对其余组增多明显，HA-EPA组显著多于EPA组。

Figure 7 Analysis of apoptosis by TUNEL labeling in HepG2 cells (A-B) and apoptosis cells detected by flow cytometry (C) (x¯±s, n=3)

****P < 0.000 1 vs control group; ++++P < 0.000 1 vs HA group; &&&&P < 0.000 1 vs EPA group

进一步采用流式细胞术对细胞凋亡进行检测，HA-EPA组Annexin V阳性细胞最多，这与TUNEL结果一致，表明HA-EPA相较于EPA，具有显著的促进HepG2凋亡作用。3.8　细胞迁移与侵袭实验

实验结果如图8所示，Transwell 小室底部的细胞数，HA-EPA组明显低于其余3组。侵袭小室底部HepG2细胞的侵袭数量远远小于对照组，且 HA-EPA与EPA组相比，其抑制作用同样存在显著性差异。综上，HA-EPA可抑制人肝癌HepG2细胞的迁移、侵袭能力，且其作用显著优于EPA单体。

Figure 8 Effects of HA-EPA on the migration and invasion of HepG2 cells. The migration (A) and invasion (C) abilities of HepG2 cells were measured by Transwell and invasion assay; and the numbers of the migrated cells (B) and the invasive cells (D) were calculated (x¯±s, n=3)

***P < 0.001, ****P < 0.000 1 vs control group; +++P < 0.001, ++++P < 0.000 1 vs HA group; &&&&P < 0.000 1 vs EPA group

4 讨 论

本研究将HA与EPA通过化学反应接枝在一起得到HA-EPA接枝物，通过1H NMR和FT-IR确定了目标产物的成功合成，且通过1H NMR确定了EPA在HA上的接枝率约40%；测定了产物的粒径及电位，结果分别为（162.5 ± 10.2） nm和-（4.47 ± 0.31） mV。

接下来，通过MTT实验检测了HA-EPA对肝癌细胞HepG2和Huh-7的毒性实验，HA-EPA与EPA单体相比，HA-EPA能更好地抑制肿瘤增长，且具有时间与剂量依赖性。对正常细胞LX-2的MTT结果表明，HA的负载有效减少了EPA对正常细胞的毒性作用。

本研究通过对肝母细胞瘤细胞HepG2的增殖、凋亡、迁移、侵袭实验，初步探究了HA-EPA对肝癌细胞的体外抑制作用，相较于EPA单体，HA-EPA能显著抑制HepG2的增殖、迁移与侵袭，促进HepG2的凋亡。

综合以上结果，HA-EPA具有出色的生物安全性以及抗肝癌效果，具有较好的应用前景，未来可进一步用于肿瘤治疗与药物递送，HA-EPA的抗肝癌分子机制研究将在后期研究中进行。

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