摘要
通过建立HPLC柱前衍生化法对不同厂家的聚山梨酯80和聚山梨酯20中甲醛、乙醛进行检测分析，并在不同条件下监测甲醛和乙醛对阿达木单抗聚集的影响，分别从基因毒性杂质控制和对单抗制剂稳定性影响两方面综合考量，初步得出二者的控制限度。HPLC柱前衍生化法采用2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）作为衍生化试剂，以乙腈和水为流动相，在C8（4.6 mm × 150 mm，5 μm）色谱柱上梯度洗脱进行分离，检测波长为 360 nm，用外标法定量。方法学验证结果表明，该方法适用于聚山梨酯80和聚山梨酯20中微量甲醛和乙醛的定量分析。对不同厂家不同批次的聚山梨酯80和聚山梨酯20中甲醛或乙醛的检测分析表明二者含量差异较大，聚山梨酯80中甲醛和乙醛含量明显高于聚山梨酯20；用分子排阻色谱法对经甲醛和乙醛处理的阿达木单抗分子聚集体变化进行监测后发现，甲醛对阿达木聚集的影响显著高于乙醛。按照《人用药品注册技术国际协调会议指南：诱变性杂质评估和控制》（ICH M7）的要求从风险评估的角度计算单抗制剂用聚山梨酯80和聚山梨酯20中甲醛和乙醛的杂质限度，结合对单抗聚集稳定性的影响，给出其中甲醛和乙醛初步的限度建议为：分别不得过7 μg/g和765 μg/g。
在药用辅料中，甲醛和乙醛通常是经降解产生的小分子杂质，尤其在聚氧乙烯类或包含聚氧乙烯链段的药用辅料（如聚山梨酯20、聚山梨酯80等）中可能存在，其降解途径如
Figure 1 Schematic diagram of aldehyde generation in polysorbates
聚山梨酯80和聚山梨酯20作为生物制品中常用的稳定剂，通过竞争机制或分子伴侣机
然而，目前各国药典聚山梨酯80和聚山梨酯20标准中均没有对醛类检查作出相关要求。本研究参考ICH M7的相关要求，对蛋白制剂用聚山梨酯80和聚山梨酯20中甲醛和乙醛的杂质限度进行了合理估算，同时结合甲醛和乙醛对阿达木单抗稳定性的影响对控制限度的制订提出了建议。采用已建立的聚山梨酯80和聚山梨酯20中甲醛和乙醛含量测定的HPLC柱前衍生化法并进行了优
聚山梨酯80分别购自英国禾大Croda公司、Ewnik公司、南京威尔有限公司、江苏保易有限公司、Sigma-Aldrich公司、日本NOF公司和上海弘顺生物科技有限公司。聚山梨酯20分别购自南京威尔有限公司、国药集团化学试剂有限公司、J.T.Baker公司、化夏试剂有限公司和上海一基实业有限公司。阿达木单抗注射液（规格：0.8 mL：40 mg，国内某制药公司）；PBS缓冲液［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；甲醛（中国计量科学研究院，BW3450，9.67 mg/mL）；乙醛（阿拉丁生化科技股份有限公司）；甲醛2，4-二硝基苯腙（甲醛-DNPH，默克化工有限公司）；乙醛2，4-二硝基苯腙（乙醛-DNPH，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；2，4-二硝基苯肼（上海麦克林生化科技有限公司，98%，HPLC级）；盐酸为市售分析纯；乙腈为色谱纯。
称取2，4-二硝基苯肼4 g，置于烧瓶中，加乙腈200 mL，混匀，于90 ℃水浴中加热30 min，趁热过滤至锥形瓶中。滤液自然冷却后用布氏漏斗抽滤，用乙腈冲洗剩余晶体即得纯化后的2，4-二硝基苯肼。如空白干扰仍可检出，需重复该纯化过程。
取纯化后的2，4-二硝基苯肼0.25 g，精密称定，置于50 mL量瓶中，加乙腈40 mL，完全混匀后再加入浓盐酸3 mL，超声至完全溶解，用乙腈稀释至刻度，将溶液转移至棕色瓶中，临用新制。
取甲醛-DNPH和乙醛-DNPH 适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释成每毫升约含30 μg的甲醛-DNPH对照品储备液和每1 mL约含200 μg的乙醛-DNPH对照品储备液。
色谱柱：CAPCELL PAK DD-C8柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；进样量：20 μL；流动相：A（水）-B（乙腈），流速：1.0 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃。流动相梯度：0 ~ 11 min：65% A ~ 20% A；11 ~ 15 min：80% B ~ 100% B； 15 ~ 16 min： 100% B ~ 35% B。
精密称取甲醛和乙醛对照品适量，用乙腈稀释，分别配制成50 μg/mL的甲醛对照品溶液和乙醛对照品溶液，各取1 mL于10 mL量瓶中，按供试品溶液的配制同法处理，照下式分别计算甲醛和乙醛的反应效率：甲醛反应效率 = ；乙醛反应效率 = 。
其中，和分别为样品中甲醛-DNPH和乙醛-DNPH的检出量（μg）。
结果表明，在该反应条件下，甲醛和乙醛的衍生化反应效率分别为100%和98%。
取甲醛-DNPH对照品储备液和乙醛-DNPH对照品储备液用乙腈稀释为每毫升含甲醛-DNPH分别为0.15，3，10，20，24，30 μg，含乙醛-DNPH分别为1，5，60，80，150，200 μg的溶液作为线性标准溶液。
精密量取线性标准溶液20 μL注入液相色谱仪中，记录色谱图，以浓度与对应峰面积计算回归方程；另精密量取供试品溶液20 μL注入液相色谱仪中，记录色谱图，代入回归方程，并按公式（1）和公式（2）计算供试品中甲醛和乙醛的含量。
采用上述方法对来自8个厂家共20批聚山梨酯80样品、5个厂家共11批聚山梨酯20样品中的甲醛和乙醛进行测定，结果如
精密量取3 µg/mL甲醛-DNPH对照品溶液和10 µg/mL乙醛-DNPH对照品溶液各20 µL，连续进样6次，记录色谱图，以峰面积计算RSD。结果表明，甲醛-DNPH和乙醛-DNPH峰面积的RSD分别为0.8%和0.9%，均小于2%，表明仪器进样精密度良好。
将甲醛-DNPH和乙醛-DNPH对照溶液逐级稀释，精密量取各溶液20 μL注入液相色谱仪，以信噪比S/N = 3对应的溶液浓度作为检出限，S/N = 10对应的溶液浓度作为定量限。结果表明，甲醛-DNPH和乙醛-DNPH的检出限均为0.005 µg/mL，定量限均为0.01 µg/mL。
分别取甲醛-DNPH对照品储备液和乙醛-DNPH对照品储备液，用乙腈稀释为每毫升含甲醛-DNPH分别为0.15，3，10，20，24，30 μg，含乙醛-DNPH分别为1，5，60，80，150，200 μg 的溶液作为系列对照品溶液。精密量取上述对照品溶液20 μL注入高效液相色谱仪中，记录色谱图，以对照品溶液浓度（c，μg/mL）与对应的峰面积（A）进行线性回归，得到甲醛-DNPH和乙醛-DNPH线性回归方程分别为A = 101.33c - 1.244 3（r = 0.999 9），A = 99.799c + 65.509（r = 0.998 7）。结果表明甲醛-DNPH在0.14 ~ 28.65 µg/mL，乙醛-DNPH在0.99 ~ 198.45 µg/mL范围内线性良好。
精密量取3 µg/mL甲醛-DNPH对照品溶液和10 µg/mL乙醛-DNPH对照品溶液各20 µL，分别于0，6，12，24 h各进样1次，记录色谱图，以峰面积计算RSD。结果表明，甲醛-DNPH和乙醛-DNPH 4次进样峰面积的RSD分别为1.39%和1.22%，均小于2.0%，表明日内精密度良好。
精密量取3 µg/mL甲醛-DNPH对照品溶液和10 µg/mL乙醛-DNPH对照品溶液各20 µL，分别于1，2，3，4，5，6 d各进样1次，记录色谱图，以峰面积计算RSD。结果表明，甲醛-DNPH和乙醛-DNPH 6次进样峰面积的RSD分别为1.10%和0.81%，均小于2.0%，表明日间精密度良好。
用PBS配制甲醛和乙醛母液，分别加入到5 mg/mL经PBS稀释的阿达木单抗注射液中，使终浓度分别为0，0.6，6和60 µg/g。分别在4 ℃和40 ℃条件下静置孵育，于2，4，7 d时将溶液直接进样，用分子排阻色谱法（size exclusion chromatography， SEC）测定阿达木单抗的聚集体含量。
分别在0.6，6，60 μg/g 3个浓度条件下、于4 ℃和40 ℃考察了甲醛和乙醛对阿达木单抗聚集的影响。如
Figure 2 Aggregate assay of adalimumab treated by formaldehyde or acetaldehyde respectively at 4 °C (A) and 40 °C (B) using size exclusion chromatography (SEC) ()
*P < 0.05,
Figure 3 Typical SEC chromatogram of adalimumab respectively treated by formaldehyde (A) and acetaldehyde (B)
由辅料聚山梨酯80和聚山梨酯20引入的甲醛和乙醛杂质不仅经人体摄入时存在安全性风险，而且会对蛋白类药物的稳定性造成影响。本研究采用两种方法对蛋白制剂中聚山梨酯80和聚山梨酯20的甲醛、乙醛含量限度进行了评估。
参考美国非活性物质数据库（IIG）注射剂中聚山梨酯80和聚山梨酯20的处方使用量分别为0.000 2 ~ 0.585 g/mL和0.01 ~ 0.02 g/mL，将0.02 g/mL作为常用处方用量；以国家药品监督管理局网站公布的市售单抗注射液（11个品规）的规格为参考，将每日给药量10 mL作为每日摄入体积，按照美国食品药品管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）规定的毒理学关注阈值（TTc）：长期用药时，潜在毒性杂质每日摄入量不能超过1.5 μg/d。因此计算得出甲醛和乙醛的限度（估算）均为7.5 μg/g。另外，按照ICH M7的要求，采用基于化合物特异性风险评估的可接受摄入量可计算可摄入量（AI）。根据CPDB（Carcinogenic Potency Database）数据库所报道的甲醛TD50：1.35 mg/（kg·d）（大鼠）和乙醛TD50：153 mg/（kg·d）（大鼠），得到聚山梨酯80和聚山梨酯20中甲醛和乙醛限度（估算）分别为6.75和765 μg/g。需要说明的是，以上仅是本研究从杂质安全性评估的角度对注射用单抗制剂中聚山梨酯80和聚山梨酯20的甲醛和乙醛含量限度的粗略估算，是否准确、全面和合理仍有待更进一步的毒理学风险评估。
结合本研究中甲醛和乙醛对阿达木单抗稳定性的实验结果，当甲醛浓度为60 μg/g时已经可以对单抗聚集产生很大影响，而6 μg/g时对单抗聚集的影响并不显著，因此可以推断，按照以上过程估算得出的甲醛杂质限度（约7 μg/g）条件下对保证单抗稳定性是有利的。而乙醛在本研究实验条件下对阿达木单抗的聚集效应并不显著，因此限度设定应首先考虑其安全性。
此外，在本研究中为了说明小分子杂质对单抗稳定性的影响，给制定单抗中聚山梨酯80和聚山梨酯20中醛类小分子检查提供依据，本研究只关注了两个杂质本身对阿达木单抗稳定性的影响，而未对辅料本身对单抗聚集的直接作用作出考察，将在以后的研究中进一步完善。
本研究不仅建立了适用于聚山梨酯80和聚山梨酯20中甲醛和乙醛微量杂质检测的HPLC柱前衍生化检测方法，而且从基因毒性杂质控制和对生物制剂稳定性影响两方面综合考量，初步得出二者的控制限度，并根据实测多批次样品的甲醛乙醛残留量，对辅料质量进行总体评价，对其中甲醛和乙醛限度控制策略进行建议，为辅料质量标准的提高提供了理论支撑。
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