摘要
以鬼臼毒素(podophyllotoxin)、N-苄氧羰基甘氨酰-L-脯氨酸为原料,首次合成了10个新型鬼臼毒素衍生物(Ⅲa ~ Ⅲi、Ⅳ),目标化合物结构
关键词
鬼臼毒素(podophyllotoxin)是一种具有显著抗肿瘤活性的天然产物,但因其存在水溶性较差、骨髓抑制、易产生耐药性等缺陷严重制约了临床应

研究表
合成路线如路线1所示。以鬼臼毒素为原料,通过与N-Cbz保护的不同氨基酸进行酯化反应,中间体Ⅰ脱除Cbz保护基得到中间体Ⅱ,最后与N-苄氧羰基甘氨酰-L-脯氨酸(Z-Gly-Pro-OH)进行酰胺化反应制得目标化合物Ⅲ。同时,鬼臼毒素与Z-Gly-Pro-OH直接进行酯化反应得到目标化合物Ⅳ。

Scheme 1 Synthetic route of FAPα-activated podophyllotoxin derivativesa: Different amino acids protected by N-Cbz, DCC, DMAP, Anhydrous CH2Cl2, N2, 0 °C-r.t., 2-3 h; b: Triethylsilane, PdCl2, Anhydrous CH2Cl2, N2, r.t., 30 min; c: Z-Gly-Pro-OH, DCC, DMAP, Anhydrous CH2Cl2, N2, 0 °C-r.t., 3-4 h
Avance NEO 400 MHz、600MHz核磁共振仪(德国Bruker公司,CDCl3为溶剂,TMS为内标);LCMS-8045三重四极杆液质联用仪(日本岛津公司);CKX41倒置光学显微镜(日本奥林巴斯公司); ELx808酶标仪(美国BioTek公司);RE-2000B旋转蒸发仪(巩义瑞德仪器);DFY-10L/80低温恒温反应浴(巩义予华仪器公司);MTT试剂盒(上海碧云天公司);柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂)。所有化学试剂均为市售化学纯或分析纯,未经纯化处理直接使用。
中间体Ⅰa 在50 mL的反应管中,依次加入鬼臼毒素(0.207 g,0.5 mmol)、N-苄氧羰基-L-丙氨酸(0.167 g,0.75 mmol,1.5 eq.)、DMAP(0.183 g,1.50 mmol,3.0 eq.)、无水CH2Cl2(10 mL),搅拌溶解,N2保护下,0 ℃冷却搅拌30 min后,再加入DCC(0.155 g,0.75 mmol,1.5 eq.),自然升温到室温,薄层色谱(TLC)监测,约2 ~ 3 h反应完全,加入乙酸乙酯(50 mL × 2)萃取,依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤,减压浓缩溶剂,得无色油状物,产物未经纯化直接用于下一步反应。中间体Ⅰb ~ Ⅰh按照相同方法合成得到。
中间体Ⅱa 取上一步浓缩至干的油状化合物Ⅰa(0.20 g,0.287 mmol)于100 mL的茄形瓶,N2保护下,依次加入CH2Cl2(10 mL)、PdCl2(5.0 mg,0.29 mmol,0.1 eq.)、三乙胺(0.12 mL,0.86 mmol,3.0 eq.),搅拌溶解,室温下缓慢滴加三乙基硅烷(0.14 mL,0.86 mmol,3.0 eq.)的CH2Cl2溶液(1 mL),薄层色谱(TLC)监测,约20 ~ 40 min反应完全,缓慢滴加三氟乙酸(0.5 mL)终止反应,继续搅拌30 min,加入1 mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH至8,硅藻土过滤,滤液用乙酸乙酯萃取(50 mL × 2),依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤,减压浓缩溶剂,得浅黄色油状物,产物未经纯化直接用于下一步反应。中间体Ⅱb ~ Ⅱh按照相同方法合成得到。
化合物Ⅲa 参照中间体Ⅰa的方法制备,在50 mL的反应管中,依次加入中间体Ⅱa(0.207 g,0.5 mmol)、Z-Gly-Pro-OH(0.75 mmol,1.5 eq.)、DMAP(0.183 g,1.50 mmol,3.0 eq.)、无水CH2Cl2(10 mL),搅拌溶解,N2保护下,0 ℃冷却搅拌30 min后,再加入DCC(0.155 g,0.75 mmol,1.5 eq.),自然升温到室温反应,薄层色谱(TLC)监测,约3 ~ 4 h反应完全,加入乙酸乙酯(50 mL × 2)萃取,依次用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和食盐水洗涤,减压浓缩溶剂,得粗产品,采用硅胶柱色谱分离纯化[洗脱剂:乙酸乙酯-石油醚(2∶1)],得白色固体,即目标化合物Ⅲa。目标化合物Ⅲb ~Ⅲi、Ⅳ按照相同方法合成得到。
化合物Ⅲa 白色固体,总收率38.6%;mp 180 ~ 181 ℃
化合物Ⅲb 白色固体,总收率5.8%;mp 104 ~ 105 ℃
化合物Ⅲc(Ⅲb的C4β异构体) 白色固体,总收率28.5%;mp 187 ~ 188 ℃
化合物Ⅲd 白色固体,收率23.8%;mp 114 ~ 115 ℃
化合物Ⅲe 白色固体,总收率24.2%;mp 100 ~ 101 ℃
化合物Ⅲf 白色固体,总收率21.7%;mp 96 ~ 97 ℃
化合物Ⅲg 白色固体,总收率35.9%;mp 134 ~ 135 ℃
化合物Ⅲh 白色固体,收率25.8%;mp 206 ~ 207 ℃
化合物Ⅲi 白色固体,总收率26.3%;mp 124 ~ 125 ℃
化合物Ⅳ 白色固体,收率56.2%;mp 176 ~ 177 ℃
以鬼臼毒素(podophyllotoxin)和临床使用的抗肿瘤药物依托泊苷为阳性对照,目标化合物设置3.125,6.25,12.5,25,50,100 μmol/L 6个浓度,按文献[
采用ChemBio3D Ultra 14.0绘制目标化合物结构并进行能量最小化,设置Minimum RMS Gradient为0.001,保存为mol2格式。将优化的目标化合物导入AutodockTools1.5.6进行加氢、计算并分配电荷、设置可旋转键后保存为“pdbqt”格式。从PDB数据库下载FAPα蛋白(PDB ID:1Z68),使用PyMoL(2.3.0)去除水分子,将蛋白导入AutoDocktools1.5.6进行加氢、计算并分配电荷、指定原子类型并保存为“pdbqt”格式。采用Autodock Vina1.1.2进行对接,参数设置为:中心坐标(center_x=38.033,center_y=0.39,center_z=69.392);格点盒子大小设定为126 × 126 × 126(格点间距为0.375 Å),其余参数为默认。利用PyMOL 2.3.0对结果进行相互作用分析。
在合成中间体Ⅰ时,尝试了N-叔丁氧羰基(Boc)、N-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的氨基酸与鬼臼毒素反应,但所得产物在进行脱Boc或脱Fmoc时,无法将Boc或Fmoc彻底脱除,产物经MS确认也不是所需中间体Ⅱ,最终选择苄氧羰基(Cbz)保护的氨基酸作为原料,通过两步反应成功制备了中间体Ⅱ。同时,在TLC跟踪第一步反应进度时,发现除原料与缩合剂外有2个新的斑点生成,且这2个新斑点在后续进行第二步和第三步反应时分别转为新产物而消失,由此我们断定这2个斑点为目标中间体Ⅰ的α和β两种异构体。在进行脱Boc或脱Fmoc制备中间体Ⅱ时,采用三乙基硅烷作为氢源、氯化钯催化的条件下,在20 ~ 40 min的时间内得到中间体Ⅱ,且该条件所需试剂相比钯碳-氢气的条件更便捷、更安全。在合成目标产物Ⅲ时,用TLC检测目标产物存在α和β两种异构化产物,但由于β构型产物的量较少,在通过硅胶柱色谱分离时只获得以正缬氨酸为连接臂的Ⅲb和Ⅲc两种异构体,以其他氨基酸为连接臂的β构型产物很遗憾都未通过分离获得,仅获得了它们的α构型产物。
在目标化合物Ⅲa ~ Ⅲi和Ⅳ
为进一步确定目标化合物的C4位置的构型,本研究使用400 MHz核磁共振仪采集了鬼臼毒素
由
初步构效关系分析发现:当作为连接臂的氨基酸具有更小空间体积时,目标产物对HepG2、THP-1、HeLa、MCF-7细胞具有更好的抑制作用。随着氨基酸空间结构增大,形成的目标产物对4种细胞的抑制作用多有减弱趋势,如化合物Ⅲd、Ⅲf、Ⅲg、Ⅲh等,尤其是化合物Ⅲf和Ⅲg,对HeLa细胞的抑制作用相比化合物Ⅲa大大降低。鬼臼毒素与Z-Gly-Pro-OH通过酯化反应直接得到的化合物Ⅳ,对HepG2、THP-1、HeLa、MCF-7细胞显示出良好的活性,也进一步体现了连接臂所占空间较小时有利于发挥抗肿瘤作用。
鉴于Z-Gly-Pro-OH能激活FAPα酶,为进一步探索合成衍生物与FAPα酶是否具有相互作用,采用分子对接模拟分析了化合物Ⅲa与FAPα酶的结合作用(路线2),发现化合物Ⅲa与FAPα酶的Tyr458(A)、Ala459(A)、Arg402(A)、Thr297(A)、Leu296(A)、Trp298(A)残基能形成氢键,其氢键长度分别为3.22 Å、3.74 Å、3.52 Å、2.88 Å、3.20 Å、3.72 Å、3.33 Å、3.77 Å、3.09 Å;化合物Ⅲa与FAPα酶的与Asp457(A)、Pro216(A)、Trp214(A)、Trp213(A)、Phe357(A)、Pro355(A)、Val403(A)、Val356(A)、Val299(A)具有疏水作用。从这些结合位点可看出,鬼臼毒素和Z-Gly-Pro-OH结构均可与FAPα酶产生结合位点,偶联的氨基酸结构几乎没有产生结合位点,这也揭示鬼臼毒素和Z-Gly-Pro-OH进行拼接合成时,连接臂结构过大可能不利于目标分子作用于FAPα酶发挥抗肿瘤作用。而本研究合成的新型衍生物是否通过作用于FAPα酶从而发挥抗肿瘤作用,FAPα酶在本文研究的细胞株中是否也具有高表达,均将通过后期研究进行验证。如合成化合物对FAPα低表达细胞都具有显著抑制作用,则可为研究人员提供新的研究出发点。


Scheme 2 Molecular docking of compound Ⅲa and FAPα enzyme
以天然来源化合物鬼臼毒素为原料,结合前期虚拟筛选结果,首次合成了10个新型的鬼臼毒素衍生物,体外抗肿瘤活性筛选结果表明,大部分目标化合物对HepG2、THP-1、HeLa、MCF-7肿瘤细胞的抑制作用优于依托泊苷和鬼臼毒素,尤以化合物Ⅲa对HepG2细胞的抑制作用最为显著,值得进一步深入研究。
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