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羧甲司坦L-精氨酸盐的合成及其对支气管上皮细胞的保护作用

  • 贾健
  • 吴建兵
  • 张奕华
  • 黄张建
中国药科大学新药研究中心,南京 210009

中图分类号: R914

最近更新:2022-04-28

DOI:10.11665/j.issn.1000-5048.20220206

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摘要

羧甲司坦(CMC)是治疗慢性阻塞性肺病的常用药,长期服用对胃肠道产生严重刺激。L-精氨酸是一氧化氮(NO)合酶(NOS)的底物,在体内可转化为对心血管及胃肠道等有益的NO。L-精氨酸属碱性氨基酸,能与某些含羧酸基团的化合物成盐以改善原药的水溶性,并可能由于促进NO的释放带来活性的提高或毒副作用的缓解。因此,本文设计、合成了CMC的L-精氨酸盐(CMCA),并测试其理化性质以及在香烟烟雾诱导的人支气管上皮细胞损伤模型中清除活性氧(ROS)、抗细胞凋亡和NO释放的能力。结果表明,CMCA能有效捕获ROS,释放NO,并抑制细胞凋亡,效果优于CMC或L-精氨酸,提示该化合物值得深入研究和开发。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)是一种常见的慢性气道疾病,具有高发病率、致残率和致死率的特

1-4。据报道我国20岁及以上成人COPD患病率为8.6%,40岁以上人群患病率高达13.7%,提示我国COPD发病率呈现高态5-7。吸烟是造成COPD最主要的原因,80% ~ 90%的COPD患者都与吸烟密切相8-10

羧甲司坦(carboxymethylcysteine,CMC)是临床常用的黏痰溶解药。临床研究发现,应用CMC可明显减少COPD患者病情急性加重并延长发作间

11-12。CMC治疗COPD的疗效不仅与其黏液溶解性有关,更多地与其抗氧化、抗炎作用相13。CMC还可通过抑制促炎因子白细胞介素1β、白细胞介素6及肿瘤坏死因子α等的生成,减少炎性介质的释放,减轻体内的炎性反14-16。遗憾的是,CMC化学结构中的两个羧酸基导致该药物对消化道有刺激作用,可引起胃部不适、恶心、呕吐、肠胃道出血等不良反应。

L-精氨酸(L-arginine,L-Arg)是一种半必需氨基酸,可被内源性NOS代谢为NO和瓜氨酸,在维持气道张力和功能方面起着重要作用。值得一提的是,只有L-精氨酸才能作为NOS的底物释放NO,而D-精氨酸不具有产生NO的能

17-18。NO缺乏也被证明是COPD、哮喘和囊性肺纤维化患者肺功能恶化的原因之19-21。在胃肠道系统中,NO可通过抑制胃酸分泌、促进胃黏液分泌、调节黏膜血流量等发挥胃肠道保护作22-27。传统非甾体抗炎药(NSAIDs)具有严重胃肠道不良反应,而NO供体型NSAIDs(NO-NSAIDs)如阿司匹林L-精氨酸盐、NO-阿司匹林、NO-布洛芬等不仅具有强效的抗炎、镇痛作用而且具有NO介导的胃肠道和心血管保护作28-33

基于上述背景,本研究设计、合成了一种CMC的L-精氨酸盐化合物(CMCA),并测试了CMCA的理化性质及其在人支气管上皮细胞(16-HBE)中抗氧化、抗凋亡和NO释放的作用。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

羧甲司坦(成都西亚化工股份有限公司,Lot:20200710);L-精氨酸[梯希爱(上海)化成工业发展有限公司,Lot:22RPO];商用卷烟(万宝路红标);16-HBE细胞系、DCFH-DA活性氧检测试剂盒、Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒、DAF-FM DA一氧化氮检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司);6孔培养板(美国Corning Costar公司);AV-500核磁共振仪(德国Bruker公司);MAT95XP型高分辨质谱仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司];X-4精密显微熔点测定仪(北京福凯仪器有限公司);pH计[梅特勒-托利多(中国)有限公司];FACS Calibur流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)。

1.2 CMCA的制备与表征

CMCA的合成途径如路线1所示,将L-精氨酸(1.74 g,10 mmol)溶于蒸馏水5 mL中,逐量加入CMC(1.79 g,10 mmol)始终保持反应液为澄清状,于室温25 ℃下搅拌2 h,向反应液中滴加无水乙醇50 mL,开始时滴速稍快,至有白色晶体析出时减慢滴速,滴毕,搅拌0.5 h,抽滤,用少量乙醇洗涤滤饼,40 ℃真空干燥,得白色CMCA结晶3.20 g,收率约90.7%。mp 203.8 ~ 205.2 ℃;UV(H2O) λmax 211.5(lg ε 3.717) nm;IR(KBr,ν):918.6,1 223.9,1 380.0,1 690.7,3 336.9,3 438.0 cm-1;MS(m/z):175 [M2+H+,178 [M1–H1H NMR(500 MHz,D2O):δ 1.86 ~1.66(2H,m),2.04 ~1.91(2H,m),3.11(1H,dd,J1 = 14.6,J2 = 8.5 Hz),3.23(1H,d,J = 14.8 Hz),3.31(2H,t,J = 6.6 Hz),3.39(2H,s),3.84(1H,t,J = 5.7 Hz),3.98(1H,d,J = 6.6 Hz)13C NMR(125 MHz,D2O):δ 175.38,172.13,170.66,52.20,51.61,38.37,34.83,31.33,25.39,21.75。

  

Scheme 1  Synthetic route of carboxymethylcysteine L-arginate (CMCA)

1.3 香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)的制备及模型的建立

香烟烟雾溶液的制备方法如文献所

34。在真空烧瓶中每25 mL PBS使用一支香烟燃烧5 min以生成CSE-PBS溶液。再使用0.22 μm孔径的过滤器过滤CSE溶液,以去除细菌和大颗粒。然后将烟雾溶液的pH调节至7.4,其溶液设为100% CSE,并在每次实验中稀释至所需浓度。

本研究采用16-HBE细胞系建立CSE模型,参照文献方

35所述,将受试药物与16-HBE细胞预孵育1 h后,加入10% CSE继续孵育18 h。每组实验重复进行3次。

1.4 DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧含量

DCFH-DA是一种被广泛用于检测ROS的荧光探针。用PBS洗涤细胞1次(离心200 r/min,5 min)收集并调整细胞浓度为每毫升1 × 106个细胞,按照1∶1 000用无血清培养液稀释DCFH-DA,使终浓度为10 μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中,37 ℃细胞培养箱内孵育20 min。每3 ~ 5分钟颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触,用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。用流式细胞仪检测(λEx = 488 nm;λEm = 530 nm)细胞内的活性氧。

1.5 Annexin-V APC/7-AAD双染法检测细胞凋亡

将对数生长期的16-HBE细胞接种到6孔板中,次日,待细胞贴壁后,根据组别设置相应的含药培养基,同时设立阴性对照组。药物作用18 h后,用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集细胞,用PBS洗涤细胞两次(离心200 r/min,5 min)调整细胞浓度为每毫升5 ×105个,加入结合缓冲液500 μL悬浮细胞,加入Annexin V-APC 5 μL混匀后,再加入7-AAD 5 μL混匀,室温、避光、反应5 ~ 15 min。使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6 DAF-FM DA荧光探针检测细胞内NO含量

DAF-FM DA是一种可用于检测细胞内低浓度NO的荧光探针。将细胞消化、计数、配制成浓度为每毫升5 × 104个细胞的细胞悬液,接种到六孔板中,次日,待细胞贴壁后,根据组别设置加入相应的含药培养基,同时设立阴性对照组。加药18 h后,用0.25%胰酶消化收集细胞,用PBS洗涤细胞1次(离心200 r/min ,5 min)收集并调整细胞浓度为每毫升1 × 106个。按照1∶1 000用无血清培养液稀释DAF-FM DA,使终浓度为5 μmol/L,细胞收集后悬浮于稀释好的DAF-FM DA中,37 ℃细胞培养箱内孵育20 min,每3 ~ 5分钟颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次,以充分去除未进入细胞内的DAF-FM DA;用流式细胞仪检测(λEx = 495 nm;λEm = 515 nm)细胞内NO的情况。

1.7 统计学处理

计量数据以平均数 ± 标准差(x¯±s)表示,P < 0.05认为有显著性差异。两组间统计学差异采用Tukey's检验,多组间数据使用单因素方差分析(One-Way ANOVA)分析检验。所有分析和绘图均使用统计软件GraphPad Prism 8。

2 结 果

2.1 CMCA改善CMC的理化性质

将CMC与CMCA配制成为1 mg/mL的水溶液,使用pH计测试二者pH,结果如表1所示,CMCA改善了CMC自身的强酸性。以脂水分配系数lg P作为评价指标,采用分配系数(正辛醇-水)摇瓶法试验,结果如表1所示,CMCA的亲水性较CMC好。

Table 1  pH and lg P of CMC and CMCA (x¯±s, n=3)
Compd.pHRSDlg PRSD
CMC 2.18 ± 0.67 30.47 -1.47 ± 0.09 -6.05
CMCA 4.22 ± 0.25 5.92 -2.03 ± 0.31 -15.05

CMC: Carboxymethylcysteine; CMCA: Carboxymethylcysteine L-arginate

2.2 CMCA抑制CSE引起的16-HBE细胞内的ROS积聚

首先,本研究测试了CMCA清除CSE诱导16-HBE细胞内ROS的能力,以证明其抗氧化作用。如图1所示,10% CSE刺激18 h后,16-HBE细胞内产生大量ROS(P < 0.001)。通过给予1 × 10-4 mol/L CMC或L-精氨酸治疗后,与模型组相比ROS的生成明显减少。采用不同浓度的CMCA治疗后ROS的生成也显著降低,并呈现剂量依赖性关系,其中1 × 10-4 mol/L的CMCA组ROS蓄积程度最低,且低于等摩尔浓度的CMC组(P < 0.001),与1 × 10-4 mol/L L-精氨酸组相比无显著性差异。

  

Figure 1  Effect of CMCA on cigarette smoke extract (CSE)-induced reactive oxygen species (ROS) generation in 16-HBE cells (x¯±s, n=3)

###P < 0.001 vs control group; ***P < 0.001 vs 1 × 10-4 mol/L CMCA group or 1 × 10-4 mol/L L-Arg group

2.3 CMCA抑制CSE引起的16-HBE细胞凋亡

CMCA抑制CSE引起的16-HBE细胞凋亡情况见图2,10% CSE刺激18 h后,导致16-HBE细胞大量凋亡(P <0.001)。通过给予1 × 10-4 mol/L CMC或1 × 10-4 mol/L L-精氨酸治疗后,与模型组相比细胞凋亡情况明显好转。采用不同浓度的CMCA治疗后能剂量依赖性的抑制细胞凋亡,其中1 × 10-4 mol/L CMCA治疗效果最佳,优于1 × 10-4 mol/L CMC组(P < 0.001)和1 × 10-4 mol/L L-精氨酸组(P < 0.001)。

  

Figure 2  Effect of CMCA on CSE-induced 16-HBE cells apoptosis (x¯±s, n=3)

###P < 0.001 vs control group; ***P < 0.001 vs 1 × 10-4 mol/L CMCA group

2.4 CMCA促进16-HBE细胞内NO的生成

为了验证NO在16-HBE细胞中发挥的作用,进一步研究了16-HBE细胞内NO的含量情况(图3),10% CSE刺激后,16-HBE细胞内NO含量明显降低(P < 0.001)。通过给予1 × 10-4 mol/L CMC治疗后,细胞内NO含量显著性增加(P < 0.001)。给予1 × 10-4 mol/L CMCA治疗后,细胞内NO含量增加,显著多于模型组和1 × 10-4 mol/L CMC组(P < 0.001)。

  

Figure 3  Effect of CMCA on CSE-induced NO concentration in 16-HBE cells (x¯± s, n = 3)

###P < 0.001 vs control group; ***P < 0.001 vs 1 × 10-4 mol/L CMC group

3 结果与讨论

香烟烟雾中含有醛类、尼古丁类、氰化物、氧自由基、焦油等大量有害成分,可直接对气道和肺组织造成损伤,产生并释放TNF-α、IL-8及IL-6等炎症介质,促进气道炎症,是导致COPD最主要的原因。CSE从香烟烟雾中提取并溶于细胞培养基中,被广泛用于体外研究

36-38。支气管上皮细胞在协调COPD病理进程中起着关键作用,刺激物首先与之接触引起气道和肺部的炎症反应,释放各种炎症介质和细胞因子,进而导致疾病加重和各种相关症状的产39。本研究采用10% CSE诱导支气管上皮细胞系16-HBE病变,以模拟体外COPD损伤。结果表明,模型组ROS大量积聚,细胞发生明显凋亡,提示造模成功。

实验结果表明,CMCA显著改善了CMC本身的强酸性,从而可能减轻对消化道的刺激作用。此外,在等物质的量浓度下CMCA较CMC或L-精氨酸有着更好的清除ROS和抗细胞凋亡的能力,并且呈现浓度依赖性关系,提示在体外CSE诱导的细胞损伤模型中CMCA较CMC有着更好的治疗效果。

随后使用DAF-FM DA荧光探针检测细胞内NO的含量,考察CMCA细胞保护作用是否依赖于NO。研究发现,模型组较对照组NO含量显著下降,可能是由于10% CSE的加入,使细胞内自身的NO与CSE刺激产生的ROS进一步反应生成NO2、N2O3和ONOO-等其他活性氮形式,无法被荧光探针所检测。CMC的加入,减轻细胞内炎症和抗氧化应激损伤,恢复细胞内部分NO含量(P < 0.001 vs模型组),而CMCA给药后细胞内NO含量进一步增加(P < 0.001 vs CMC组)。以上提示NO对CSE诱导的细胞损伤可能具有保护作用。

总之,本研究合成的CMCA较CMC具有更优的理化性质,在体外CSE诱导的细胞损伤模型中较CMC有着更好的清除ROS和抗细胞凋亡的作用。此外,CMCA还可能降低应用CMC带来的胃肠道不良反应,改善患者的依从性,较CMC具有更广泛的应用前景,值得深入研究。

References

1

GBD 2015 Disease and Injury Incidence and Prevalence Collaborators. Global,regional,and national incidence,prevalence,and years lived with disability for 310 diseases and injuries,1990-2015:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015[J]. Lancet201638810053):1545-1602. [百度学术] 

2

GBD 2015 Mortality and Causes of Death Collaborators. Global,regional,and national life expectancy,all-cause mortality,and cause-specific mortality for 249 causes of death,1980-2015:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015[J]. Lancet201638810053):1459-1544. [百度学术] 

3

Collaborators GBD2CRD. Globalregionaland national deathsprevalencedisability-adjusted life yearsand years lived with disability for chronic obstructive pulmonary disease and asthma1990-2015:a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015[J]. Lancet Respir Med201759):691-706. [百度学术] 

4

Adeloye DChua SLee Cet al. Global and regional estimates of COPD prevalence:systematic review and meta-analysis[J]. J Glob Health201552):020415. [百度学术] 

5

Chronic Obstructive Pulmonary Disease Group of Chinese Thoracic SocietyChronic Obstructive Pulmonary Disease Committee of Chinese Association of Chest Physician. Guidelines for the diagnosis and management of chronic obstructive pulmonary disease(revised version 2021)[J]. Chin J Tuberc Respir Dis(中华结核和呼吸杂志)2021443):170-205. [百度学术] 

6

ChenYH. Interpretation of global strategy for the diagnosis,management,and prevention of chronic obstructive pulmonary disease 2021 report[J]. Chin J Front Med Sci[中国医学前沿杂志(电子版)]2021131):16-37. [百度学术] 

7

Yan PYe LBChen WQ. Progress in therapeutic targets and development of drugs against chronic obstructive pulmonary disease[J]. J China Pharm Univ(中国药科大学学报)2021522):144-155. [百度学术] 

8

Zhou YMChen RC. Risk factors and intervention for chronic obstructive pulmonary disease in China[J]. Respirology201318Suppl 3):4-9. [百度学术] 

9

van der Toorn MSlebos DJde Bruin HGet al. Critical role of aldehydes in cigarette smoke-induced acute airway inflammation[J]. Respir Res2013141):45. [百度学术] 

10

Zuo LHe FSergakis GGet al. Interrelated role of cigarette smoking,oxidative stress,and immune response in COPD and corresponding treatments[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol20143073):L205-L218. [百度学术] 

11

Ishibashi YTakayama GInouye Yet al. Carbocisteine normalizes the viscous property of mucus through regulation of fucosylated and sialylated sugar chain on airway mucins[J]. Eur J Pharmacol20106412/3):226-228. [百度学术] 

12

Zheng JPKang JHuang SGet al. Effect of carbocisteine on acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease(PEACE Study):a randomised placebo-controlled study[J]. Lancet20083719629):2013-2018. [百度学术] 

13

Rahman IMacNee W. Antioxidant pharmacological therapies for COPD[J]. Curr Opin Pharmacol2012123):256-265. [百度学术] 

14

Yasuda HYamaya MSasaki Tet al. Carbocisteine inhibits rhinovirus infection in human tracheal epithelial cells[J]. Eur Respir J2006281):51-58. [百度学术] 

15

Asada MYoshida MHatachi Yet al. L-carbocisteine inhibits respiratory syncytial virus infection in human tracheal epithelial cells[J]. Respir Physiol Neurobiol20121801):112-118. [百度学术] 

16

Wang WGuan WJHuang RQet al. Carbocisteine attenuates TNF-α-induced inflammation in human alveolar epithelial cells in vitro through suppressing NF-κB and ERK1/2 MAPK signaling pathways[J]. Acta Pharmacol Sin2016375):629-636. [百度学术] 

17

Palmer RMAshton DSMoncada S. Vascular endothelial cells synthesize nitric oxide from L-arginine[J]. Nature19883336174):664-666. [百度学术] 

18

Pernow JWang QD. The role of the L-arginine/nitric oxide pathway in myocardial ischaemic and reperfusion injury[J]. Acta Physiol Scand19991672):151-159. [百度学术] 

19

Aydin MAltintas NCem Mutlu Let al. Asymmetric dimethylarginine contributes to airway nitric oxide deficiency in patients with COPD[J]. Clin Respir J2017113):318-327. [百度学术] 

20

Grasemann HAl-Saleh SScott JAet al. Asymmetric dimethylarginine contributes to airway nitric oxide deficiency in patients with cystic fibrosis[J]. Am J Respir Crit Care Med201118310):1363-1368. [百度学术] 

21

Scott JAGrasemann H. Asymmetric dimethylarginine:a disease marker for asthma[J]?Chest20131442):367-368. [百度学术] 

22

Wallace JL. Nitric oxide in the gastrointestinal tract:opportunities for drug development[J]. Br J Pharmacol20191762):147-154. [百度学术] 

23

Kato SKitamura MKorolkiewicz RPet al. Role of nitric oxide in regulation of gastric acid secretion in rats:effects of NO donors and NO synthase inhibitor[J]. Br J Pharmacol19981235):839-846. [百度学术] 

24

Ichikawa TIshihara KSaigenji Ket al. Lafutidine-induced stimulation of mucin biosynthesis mediated by nitric oxide is limited to the surface mucous cells of rat gastric oxyntic mucosa[J]. Life Sci19986216):PL259-PL264. [百度学术] 

25

Elliott SNWallace JL. Nitric oxide:a regulator of mucosal defense and injury[J]. J Gastroenterol1998336):792-803. [百度学术] 

26

Kurose IKubes PWolf Ret al. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage[J]. Circ Res1993731):164-171. [百度学术] 

27

Elliott SNMcKnight WCirino Get al. A nitric oxide-releasing nonsteroidal anti-inflammatory drug accelerates gastric ulcer healing in rats[J]. Gastroenterology19951092):524-530. [百度学术] 

28

Wallace JLDel SPCirino Get al. Nitric oxide-releasing NSAIDs:GI-safe antithrombotics[J]. Drugs Investig Drugs J199924):321-326. [百度学术] 

29

Arginine acetylsalicylate[J]. Chin Pharm J(中国药学杂志)19821249-50. [百度学术] 

30

Muscará MNLovren FMcKnight Wet al. Vasorelaxant effects of a nitric oxide-releasing aspirin derivative in normotensive and hypertensive rats[J]. Br J Pharmacol20011338):1314-1322. [百度学术] 

31

Geusens P. Naproxcinod,a new cyclooxygenase-inhibiting nitric oxide donator(CINOD)[J]. Expert Opin Biol Ther200995):649-657. [百度学术] 

32

Feng XCJi HZhang YHet al. Effect of ZLR-8 on the healing of gastric ulcer and NO releasing in vitro[J]. J China Pharm Univ(中国药科大学学报)2004354):357-360. [百度学术] 

33

Wang WDZhang YHJi Het al. Synthesis and antiinflammatory activities of NO releasing-flobufen derivatives[J]. Chin J Med Chem(中国药物化学杂志)2004141):1-8. [百度学术] 

34

Su YHan WGiraldo Cet al. Effect of cigarette smoke extract on nitric oxide synthase in pulmonary artery endothelial cells[J]. Am J Respir Cell Mol Biol1998195):819-825. [百度学术] 

35

Pace EFerraro MSiena Let al. Cigarette smoke increases Toll-like receptor 4 and modifies lipopolysaccharide-mediated responses in airway epithelial cells[J]. Immunology20081243):401-411. [百度学术] 

36

Vayssier-Taussat MCamilli TAron Yet al. Effects of tobacco smoke and benzo[a]Pyrene on human endothelial cell and monocyte stress responses[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol20012803):H1293-H1300. [百度学术] 

37

Carnevali SPetruzzelli SLongoni Bet al. Cigarette smoke extract induces oxidative stress and apoptosis in human lung fibroblasts[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol20032846):L955-L963. [百度学术] 

38

van der Toorn MSmit-de Vries MPSlebos DJet al. Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol20072935):L1156-L1162. [百度学术] 

39

Puchelle EZahm JMTournier JMet al. Airway epithelial repair,regeneration,and remodeling after injury in chronic obstructive pulmonary disease[J]. Proc Am Thorac Soc200638):726-733. [百度学术]