摘要
为了探究肝细胞癌中miR-452-5p对患者预后生存的影响及其对肝癌细胞增殖、迁移的作用。采用肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库中肝细胞肝癌数据集对miR-452-5p进行差异表达分析和Kaplan-Meier生存分析。采用TargetscanHuman和miRDB靶基因数据库对miR-452-5p靶基因进行预测；采用基因差异表达分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）的方法对数据集GSE14520进行分析计算。用Lipofectmine-2000将miR-452-5p模拟物、模拟物阴性对照和miR-452-5p抑制剂、抑制剂阴性对照分别转染到Huh7细胞中。分别采用RT-qPCR和Western blot实验，检测4组细胞中RORα在mRNA和蛋白水平上的表达情况。采用CCK-8、Transwell实验，检测4组细胞的增殖活力以及迁移能力。双荧光素酶报告基因实验验证Huh7细胞中miR-452-5p与RORα的调控关系。经TCGA数据分析，miR-452-5p在肝癌组织中高表达且显著影响患者预后总生存期。通过miRNA靶基因预测、基因差异表达分析、WGCNA分析，筛选出关键基因RORα和LAMC1。通过Kaplan-Meier生存分析得知RORα的异常表达显著影响肝癌患者的预后总生存期。肝癌细胞中miR-452-5p的过表达，会降低RORα的mRNA和蛋白表达，同时增强肝癌细胞的增殖能力和迁移能力。双荧光素酶报告基因实验结果证实了miR-452-5p靶向RORα的3′UTR区。在肝细胞癌患者中高表达的miR-452-5p靶向抑制了RORα的表达，促进了肝癌细胞增殖和迁移，进而加剧了肝癌的进展和预后不良。
根据2018年全球癌症统计数据显示，肝癌已经成为世界第二大癌症死亡原
miRNA是非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）家族的成员之一，通常由19 ~ 25个左右的核苷酸组成，其主要通过调节基因转录后水平的表达，进而广泛参与到细胞各个生命过程
本研究将结合靶基因预测数据库TargetscanHuman 和miRDB，组学数据库Gene Expression Omnibus（GEO）、肿瘤基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和The Genotype-Tissue Expression（GTEx），运用miRNA靶基因预测、基因差异表达分析、加权基因共表达网络分析（weight gene co-expression net analysis， WGCNA）等生物信息学方法，分析miR-452-5p在HCC中的差异表达对患者预后生存的影响，进一步筛选出miR-452-5p影响患者预后总生存（overall survival，OS）的靶标基因。并在肝癌细胞中探究miR-452-5p对该靶基因的调控，及其过表达对肝癌细胞增殖、迁移的影响。
GEO 数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/）中筛选并下载带有HCC患者临床信息的数据集GSE14520。GSE14520数据集包括美国国家癌症研究所的445个样本的基因表达数据谱，样本包含225例肝癌组织和220例正常肝组织。在TCGA数据库（http：//portal.gdc.cancer.gov/）中，获取肝癌患者转录组测序（第3级）的表达谱数据集，包括373例肝癌组织和50例正常组织样本。226个健康肝组织样本的mRNA表达数据均来自GTEx V8版本（http：//gtexportal.org/home/datasets）。
DMEM高糖培养基和胎牛血清（美国Gibco公司）；青霉素-链霉素双抗、Trizol RNA提取试剂、逆转录试剂盒、Hief
二氧化碳培养箱、QuantStudio3实时荧光定量PCR系统（美国Thermo公司）；VersaMax（美国Molecular Devices公司）；电泳仪、转膜仪（美国Bio-Rad公司）；多功能凝胶成像系统（中国Tanon公司）；倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）；Synerg
在TCGA肝细胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）患者数据中剔除miR-452-5p缺失的样本，进行差异表达分析。根据miR-452-5p的表达水平，将具有完整临床信息的HCC患者以三分位点划分为高表达组（前33%）和低表达组（后33%），运用R语言中的Survminer和Survival包，对两组患者的OS进行Kaplan-Meier生存分析（显著标准为P < 0.05）。基于TCGA第三级转录组表达谱数据，纳入具有完整miRNA表达数据的371例肝癌组织样本和50例正常肝组织样本作为分析对象，通过R包ggplot2和ggsignif对miR-452-5p在肝癌组织和正常组织进行差异表达验证分析。
从TargetscanHuma
利用R语言中的edgeR和limma包对GSE14520数据集的基因表达矩阵进行标准化后再进行差异分析。筛选差异表达基因的标准为|log2 （fold change）| >1且P 0.05，在此标准下得到差异表达基因（Differentially Expressed Genes， DEGs）集合。
GSE14520数据集中全部225个肿瘤患者样本，以聚类树上限高度120，下限高度20的标准剔除离群样本后，得到209个具有完整临床信息的肝细胞癌患者样本，以209个患者样本中变异系数前5 000的基因组成新的基因表达矩阵，进行WGCNA分析。运用R语言中WGCNA
运用R语言中intersect函数对上述差异表达基因集合、交集靶基因集合、关键模块基因集合进行交集运算，筛选出异常表达且显著影响临床表征的miR-452-5p靶标基因。通过整合TCGA中LIHC数据集和GTEx中正常肝组织转录组数据，得到具有完整mRNA表达数据的371例肝癌组织与276例正常组织组成的counts矩阵样本，再根据RNAseqDB包的流程计算得到特征counts矩阵，使用combat函数进一步校正批次效应，在校正后的矩阵中对筛选出的关键靶基因进行差异表达验证分析。根据TGCA中LIHC数据集中的关键基因的表达水平，以三分位点为分割点将患者分成高、低表达组进行生存分析。
用含有10%胎牛血清和1%的青霉素和链霉素的DMEM高糖培养基培养Huh7细胞，并置于5% CO2且37 ℃恒温的孵箱中。选择生长对数期细胞进行转染，按照Lipofectmine-2000转染试剂的说明，将miR-452-5p模拟物阴性对照、miR-452-5p模拟物、miR-452-5p抑制剂阴性对照、miR-452-5p抑制剂分别转染Huh7细胞，得到相应的4组转染细胞，以不同的转入物质分组、命名。
收取培养48 h后的4组转染细胞，分别进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和免疫蛋白印迹（Western blot）实验，验证miR-452-5p的转染效率并分析4组转染细胞中靶基因在mRNA水平和蛋白水平表达量的变化。用Trizol试剂提取4组细胞中的总RNA，将总RNA 1 μg逆转录为cDNA，cDNA经过QuantStudio3系统扩增为目的基因片段，分别以U6和GAPDH作为内参，采用
用含有1%PMSF的蛋白裂解液（RIPA）裂解培养48 h后的4组转染细胞，经BCA法蛋白定量后，取蛋白20 μg在10% SDS-PAGE胶上进行分离，湿转法将胶上的蛋白转移到PVDF膜上，封闭液封闭2.5 h，分别用兔抗RORα（1∶3 000稀释）和兔抗β-actin（1∶2 000稀释）一抗4 ℃孵育过夜。次日经TBST洗膜3次，每次10 min，室温孵育二抗（1∶4 000稀释）1 h，再经TBST洗膜3次，每次5 min，使用ECL发光液显色，用Tannon Image J软件对蛋白灰度进行半定量分析。
利用CCK-8法检测4组转染Huh7细胞的增殖能力，将转染后的4组细胞按照每孔3 × 1
Transwell实验中，将4组转染细胞以每孔1 × 1
将miR-452-5p模拟物阴性对照、miR-452-5p模拟物、miR-452-5p抑制剂阴性对照、miR-452-5p抑制剂分别和RORα Wt荧光质粒、RORα Mut荧光质粒共转染到Huh7细胞中，共转染48 h后，按照双荧光素酶报告基因试剂盒的说明书测定荧光强度。
结合TCGA中肝癌患者转录组数据，剔除一例miR-452-5p缺失样本后，观察到miR-452-5p在372例肝癌组织中表达量显著高于50例正常肝组织（
Figure 1 Expression level of miR-452-5p in The Cancer Genome Atlas-Liver Hepatocellular Carcinoma (TCGA-LIHC) dataset and Kaplan-Meier survival analysis
A: Boxplot showed the expression level of miR-452-5p in TCGA-LIHC dataset
基于miRDB数据库中预测的靶标得分，取排名前50%（得分大于75）的miR-452-5p预测靶基因，得到一个包括299个基因的集合。从TargetscanHuman数据库，得到包含342个基因标签的miR-452-5p预测靶基因集合。将两个预测靶基因集进行交集运算，最终得到一个含有99个基因标签的靶基因交集。
通过对比12 399个基因在肝细胞癌组织和正常肝组织中的表达，在|log2 （fold change）| > 1且P < 0.05的标准下，共找到916个异常表达的基因，其中有573个基因表达高于正常组织，343个基因表达低于正常水平（
Figure 2 Volcano plot of differentially expressed genes (DEGs) in GSE14520
从GSE14520数据集中225例肝细胞癌患者样本中，经筛选纳入209例患者的变异系数前5 000的基因组成新的表达矩阵，进行WGCNA分析，确定与患者临床表征相关的基因共表达模块。当无尺度拟合指数
Figure 3 Weight gene co-expression net analysis (WGCNA) of GSE14520
A: Cluster dendrogram confirmed 13 different co-expression modules; B: Heatmap of correlation between 13 modules and clinical traits
Figure 4 Identification of dysregulated and clinical-related miR-452-5p target genes from three gene sets
Figure 5 Validation of abnormally expressed LAMC1 and RORα
A: Boxplot of LAMC1 expression in The Cancer Genome Atlas-The Genotype-Tissue Expression (TCGA-GTEx) dataset; B: Expression of RORα in TCGA-GTEx dataset
Figure 6 Overall survival analysis of LAMC1 and RORα
A: Survival analysis of LAMC1 in TCGA-LIHC dataset; B: Survival analysis of RORα in TCGA-LIHC dataset
分别将miR-452-5p模拟物阴性对照、miR-452-5p模拟物、miR-452-5p抑制剂阴性对照、miR-452-5p抑制剂分别转入Huh7细胞中，根据转染物质将4组转染后Huh7细胞分别命名为mimics NC、mimics-452-5p、inhibitor NC和inhibitor-452-5p。RT-qPCR结果如
Figure 7 RT-qPCR tested the expression level of miR-452-5p and RORα in 4 transfected Huh7 cells （）
A: Relative expression level of miR-452-5p in 4 transfected Huh7 cells; B: Relative expression level of RORα in 4 transfected Huh7 cells
Figure 8 Western blot determined the protein level of RORα in 4 transfected Huh7 cells （）
**P < 0.01
当miR-452-5p过表达或者被沉默后，利用CCK-8法检测Huh7细胞96 h内增殖情况。
Figure 9 CCK-8 assay testified the viability of transfected Huh7 cells （）
A: Cell viability of mimics-452-5p and mimics negative control (NC) groups; B: Cell viability of inhibitor-452-5p and inhibitor NC groups
Transwell实验结果（
Figure 10 Migration capacity were checked by the Transwell assay （）
***P < 0.001
为验证miR-452-5p与RORα的靶向结合关系，通过TargetscanHuman和miRDB数据获得两者结合位点的序列。
Figure 11 miR-452-5p regulated RORα expression by targeting its 3′UTR of mRNA（）
A: miR-452-5p binding sites of RORα 3′UTR; B: Luciferase activities were measured in Wt groups which single transfected or con-transfected with RORα wild type plasmids and Mut groups which single transfected or con-transfected with RORα mutant type plasmids
miRNA在癌症中的异常表达会起到促癌或抑癌的作用，其通过调控相关癌基因或通路影响着癌症的发生、进展、预后和耐药。最新研究表明miRNA在肿瘤免疫逃逸过程中发挥着重要作用，也有研究探讨了miRNA作为癌症治疗新靶标的可
RORα属于维甲酸受体相关孤儿受体家族（Retinoid-related-orphan receptors，RORs）的一员。过往研究表明，RORα在多种肿瘤中可作为肿瘤抑制因子，起到抗癌作用，其过低的表达量与肿瘤进展密切相
本研究发现，miR-452-5p的过表达和RORα的表达量降低都会显著影响肝癌患者的OS；RORα所在的MEturquoise基因共表达模块，与HCC患者的复发状态、TNM分期、BCLC分期和OS都相关；上调的miR-452-5p在mRNA水平和蛋白水平都抑制了RORα的表达，降低了其抑癌作用，从而加剧了肝癌细胞的增殖和迁移。这一发现为HCC中寻找预后标志物和潜在治疗靶点提供了新的视角。
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