摘要
采用化学衍生化-高效液相色谱法分别测定阿嗪米特原料药中潜在基因毒性杂质氯乙酰氯和氯乙酸。以2-硝基苯肼为衍生化试剂，经衍生化后以Thermo syncronis C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以0.1%磷酸水-乙腈为流动相进行梯度洗脱；柱温40 ℃，检测波长226 nm；流速1 mL/min。空白溶剂、衍生化试剂及阿嗪米特均不干扰待测物质出峰；氯乙酰氯和氯乙酸的检测限分别为7.5 ng/mL和15 ng/mL，均在30 ~ 300 ng/mL的范围内与色谱峰面积呈现良好的线性关系；加样回收率在87.37% ~ 109.75%范围内。本研究所建立的两种方法专属性好、精密度好、灵敏度高、操作简便，可用于阿嗪米特原料药中潜在基因毒性杂质氯乙酰氯及氯乙酸的痕量测定。
酰氯类化合物是药物合成过程中重要的酰化剂。其代表性物质氯乙酰氯（chloroacetyl chloride）具有极强的酰化能力，被广泛运用于农药及他达拉非、双氯芬酸钠等的合成
阿嗪米特（azintamide）是一种治疗因胆汁分泌不足或消化酶缺乏而引起的症状的药
本课题组前期建立了阿嗪米特中潜在基因毒性杂质马来酰肼的液相-荧光分析方
Figure 1 Overview of the reaction between 2-nitrophenylhydrazine and chloroacetyl chloride
Figure 2 Overview of the reaction between 2-nitrophenylhydrazine and chloroacetic acid
1260型高效液相色谱仪配紫外检测器、Waters Empower网络版工作站（美国安捷伦科技公司）；XPR10型电子天平（瑞士梅勒特托利多公司）；MSE125P型电子天平（德国Sartorius公司）；PL5242型超纯水仪（美国Pall公司）；Centrivap真空离心浓缩仪（美国Labconco公司）；MixMate涡旋仪（德国Eppendorf公司）；KH-3200DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。
以Thermo syncronis C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以0.1%磷酸水-乙腈（74：26）（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0 ～ 18 min，100%A；18 ～ 19 min，100% A→15% A；19 ～ 29 min，15%A；29 ～ 30 min，15%A→100% A；30 ～ 45 min，100% A）；柱温40 ℃，检测波长226 nm；流速1 mL/min；进样量50 μL。
空白溶剂：取适量二氯甲烷于10 mL量瓶，静置反应40 min后，取500 μL挥干，加入乙腈500 μL复溶，加入水500 μL，涡旋混匀后即得空白溶剂。
衍生化试剂：取2-硝基苯肼20 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加二氯甲烷适量溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含2-硝基苯肼2 mg的2-硝基苯肼溶液。取适量二氯甲烷于10 mL量瓶，加入2-硝基苯肼溶液（2 mg/mL）100 μL，摇匀，加入二氯甲烷定容。静置反应40 min后，取500 μL挥干，加入乙腈500 μL复溶，加入水500 μL，涡旋混匀后即得空白衍生化试剂。
对照品溶液：加适量乙腈于1 mL量瓶中，精密称定氯乙酰氯3 mg于量瓶中，用乙腈定容至刻度，得到每毫升含氯乙酰氯3 mg的溶液。取上述溶液100 μL于20 mL量瓶，用二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含氯乙酰氯15 μg的氯乙酰氯溶液。
限度浓度对照品溶液：取适量二氯甲烷于10 mL量瓶中，加入2-硝基苯肼溶液（2 mg/mL）100 μL，摇匀，加入上述对照品溶液100 μL后，加入二氯甲烷定容。静置反应40 min后，取500 μL挥干，加入乙腈500 μL复溶，加入水500 μL，涡旋混匀后制成每毫升含氯乙酰氯150 ng的限度浓度对照品溶液。
含限度浓度杂质的供试品溶液：取阿嗪米特原料药约500 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加适量二氯甲烷超声溶解，加入上述对照品溶液100 μL，摇匀，加入2-硝基苯肼溶液（2 mg/mL）100 μL后，加入二氯甲烷定容。静置反应40 min后，取500 μL挥干，加入乙腈500 μL复溶，加入水500 μL，涡旋混匀后制成每毫升含氯乙酰氯150 ng的含限度浓度杂质的供试品溶液。
供试品溶液：取阿嗪米特原料药约500 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加适量二氯甲烷超声溶解，加入2-硝基苯肼溶液（2 mg/mL）100 μL，摇匀，加入二氯甲烷定容。静置反应40 min后，取500 μL挥干，加入乙腈500 μL复溶，加入水500 μL，涡旋混匀后即得供试品溶液。
以Thermo syncronis C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）为色谱柱，以0.1%磷酸水-乙腈（72∶28）（A）-乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0 ～ 18 min，100% A；18 ～ 19 min，100% A→15% A；19 ～ 29 min，15% A；29 ～ 30 min，15% A→100% A；30 ～ 40 min，100% A）；柱温40 ℃，检测波长226 nm；流速1 mL/min；进样量20 μL。
空白溶剂：乙腈-水（70∶30）。
衍生化试剂：取2-硝基苯肼约200 mg，精密称定，置20 mL量瓶中，加空白溶剂适量溶解并稀释至刻度，得到每毫升含2-硝基苯肼10 mg的2-硝基苯肼储备液。取EDC·HCl约400 mg，精密称定，置20 mL量瓶中，加空白溶剂适量溶解并稀释至刻度，得到每毫升含EDC·HCl 20 mg的EDC·HCl储备液。取HOBT约400 mg，精密称定，置20 mL量瓶中，加空白溶剂适量溶解并稀释至刻度，得到每毫升含HOBT 20 mg的HOBT储备液。取适量空白溶剂于10 mL量瓶，加入2-硝基苯肼溶液（10 mg/mL）0.8 mL，EDC·HCl溶液（20 mg/mL）0.25 mL，HOBT溶液（20 mg/mL）0.25 mL，摇匀，加入空白溶剂定容，静置反应60 min后制成空白衍生化溶液。
对照品溶液：精密称定氯乙酸20 mg于20 mL量瓶中，用空白溶剂溶解并稀释至刻度，得到每毫升含氯乙酸1 mg的氯乙酸溶液。取上述溶液150 μL于10 mL量瓶，用70%乙腈稀释至刻度，得到每毫升含氯乙酸15 μg的氯乙酸溶液。
限度浓度对照品溶液：取适量空白溶剂于10 mL量瓶中，加入2-硝基苯肼溶液（10 mg/mL）0.8 mL，EDC·HCl溶液（20 mg/mL）0.25 mL，HOBT溶液（20 mg/mL）0.25 mL，摇匀，加入上述对照品溶液100 μL后，加入空白溶剂定容，静置反应60 min制成每毫升含氯乙酸150 ng的限度浓度对照品溶液。
含限度浓度杂质的供试品溶液：取阿嗪米特原料药约500 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加适量空白溶剂超声溶解，加入2-硝基苯肼溶液（10 mg/mL）0.8 mL，EDC·HCl溶液（20 mg/mL）0.25 mL，HOBT溶液（20 mg/mL）0.25 mL，摇匀，加入上述对照品溶液100 μL后，加入空白溶剂定容，混匀后静置反应60 min制成每毫升含氯乙酸150 ng的含限度浓度杂质的供试品溶液。
供试品溶液：取阿嗪米特原料药约500 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加适量空白溶剂超声溶解，加入2-硝基苯肼溶液（10 mg/mL）0.8 mL，EDC·HCl溶液（20 mg/mL）0.25 mL，HOBT溶液（20 mg/mL）0.25 mL，摇匀，加入空白溶剂定容，涡旋混匀后静置反应60 min即得供试品溶液。
根据上述方法分别进行方法学验证，结果显示，空白溶剂、衍生化试剂及阿嗪米特均不干扰待测物质出峰（
Figure 3 HPLC chromatograms of chloroacetyl chloride specificity tests
1: Chloroacetyl chloride.A: Blank solution; B: Blank derivatization solution; C: Limit concentration reference solution; D: Test solution; E: Test solution containing limit concentration impurities
Figure 4 HPLC chromatograms of chloroacetic acid specificity tests
2: Chloroacetic acid.A: Blank solution; B: Blank derivatization solution; C: Limit concentration reference solution; D: Test solution; E: Test solution containing limit concentration impurities
取11批阿嗪米特原料药，分别按“2.1.2”和“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1.1”和“2.2.1”项下色谱条件分别进样测定，记录峰面积并以外标法计算氯乙酰氯和氯乙酸含量。结果显示，11批阿嗪米特原料药中均未检出氯乙酰氯和氯乙酸。
根据ICH M7（R1）中对多个致突变杂质的可接受摄入量提出的规定，毒理学关注阈值（TTC）的可接受摄入量适用于每个单杂，如果有两个2类或3类杂质，应制定各自限度。对于临床研发和已上市的药品，如果原料药质量标准中有3个或更多2类或3类杂质，应按照多个杂质的可接受总摄入量制定总致突变杂质限
预实验中发现，文献中检测氯乙酰氯时选用乙腈作为反应溶
本课题组前期在研究氯乙酸时，采取与氯乙酰氯相同的衍生化方法进行检测未能够得到目标产物；参考文献在衍生化反应中加入缩合剂（EDC·HCl）检测氯乙
本研究建立的两种方法中的两待测物氯乙酰氯和氯乙酸的结构相近，且衍生化反应产物相同，考虑到氯乙酰氯在氯乙酸衍生化的条件下反应并可能产生干扰，笔者曾试过氯乙酰氯在氯乙酸衍生化的条件下的衍生化反应，得到了相同的衍生化产物。原因如下：氯乙酸的衍生化反应体系中含水，氯乙酰氯遇水先迅速转变为氯乙酸后，再与衍生化试剂继续反应，得到相同的衍生化反应产物。因此，反应并不干扰两者的测定。严格来讲，氯乙酸的衍生化测定结果包含了氯乙酰氯和氯乙酸的残留总量，而氯乙酰氯的衍生化方法仅检测氯乙酰氯。
本研究分别建立了两种不同的柱前衍生化HPLC-UV方法检测阿嗪米特原料药中基因毒性杂质氯乙酰氯和氯乙酸，以3 μg/g为限度完成了完整的方法学验证及测样。方法学结果显示，本研究建立的两种方法灵敏度高、专属性好，能够准确测定阿嗪米特原料药中的氯乙酰氯和氯乙酸，可以为阿嗪米特原料药的质量控制提供参考。
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