使用Chrome浏览器效果最佳,继续浏览,你可能不会看到最佳的展示效果,

确定继续浏览么?

复制成功,请在其他浏览器进行阅读

齐多夫定对小鼠糖脂代谢平衡的影响及作用机制

  • 成丽媛 1
  • 刘薇 2
  • 郭笑言 1
  • 戈晓爱 1
  • 王丁丁 1
  • 王涛 1
1. 中国药科大学药物科学研究院新药筛选中心,南京 210009; 2. 南京市职业病防治院,南京 210042

中图分类号: R965

最近更新:2022-06-28

DOI:10.11665/j.issn.1000-5048.20220312

  • 全文
  • 图表
  • 参考文献
  • 作者
  • 出版信息
EN
目录contents

摘要

研究核苷类抗病毒药物齐多夫定(zidovudine,AZT)对小鼠整体代谢及肝脏糖脂代谢平衡的影响。雄性ICR小鼠连续灌胃齐多夫定12周,每天记录小鼠的饮水量及摄食量。检测给药12周后不同禁食时间血清葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)水平以及血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平,进行糖耐量实验(OGTT)和胰岛素耐量实验(ITT);HE染色观察肝脏病理学变化;RT-PCR检测葡萄糖转运蛋白(Glut2)、肉碱棕榈酸转移酶(Cpt1α)、中链酰基辅酶A脱氢酶(Mcad)以及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6pase)的基因水平;Western blot检测肝脏胰岛素信号Akt、P-Akt及Glut2、Mcad、Cpt1α的蛋白水平。结果显示,齐多夫定导致禁食后脂代谢能力显著下降,糖耐量受损,肝细胞体积增大,显著增加肝脏TG、非酯化脂肪酸(NEFA)含量,提高Glut2基因表达,下调脂肪酸氧化代谢基因Cpt1α、Mcad和糖异生相关基因水平,以及下调Cpt1α的蛋白表达。实验结果提示齐多夫定能够引起禁食后糖脂代谢紊乱,且呈一定的剂量依赖性。

艾滋病,即获得性免疫缺陷综合征(AIDS),是世界范围内的重大感染性疾病,感染人数还在不断上

1。当前,各种抗病毒药物的合理治疗可获得良好的病毒抑制,多数艾滋病患的生活质量和存活时间均得到改2。然而,现有抗病毒药物尚不能完全清除患者体内病毒,随着药物使用时间的延长,药物相关不良症状日益显著,如代谢综合征、糖尿病、慢性肝肾及骨骼疾病3-4,已成为影响艾滋病患者生存质量和预后的主要原因。

齐多夫定(AZT)是第一个被批准用于治疗AIDS的核苷类逆转录酶抑制

5,也是抗人类免疫缺陷病毒感染的一线药物之一,但是长期用药所引起的机体代谢紊乱限制了其临床疗效发6-7。目前AZT的不良反应研究主要集中在线粒体毒性方8-10,AZT可干扰线粒体DNA的复制或抑制线粒体相关蛋白的合成而造成线粒体损11,这可能是其诱发糖脂代谢的障碍和失衡的潜在机制。AZT对于整体糖脂代谢平衡的作用特征及其靶器官目前尚不明确。

正常情况下,机体组织细胞可以利用葡萄糖、脂肪酸等多种能量物质代谢供能,可根据组织环境和能量物质的供应情况,在不同能量代谢底物之间切

12,而线粒体则是维持和调节代谢平衡的核心细胞13。基于AZT诱发的临床代谢失衡症状和潜在的线粒体毒性特征,本研究采用正常小鼠长期给药,考察AZT对整体糖脂代谢平衡的作用特征,同时探讨肝脏在AZT所致线粒体毒性和糖脂代谢失衡中的靶器官角色,为其临床安全精准用药及不良反应防治提供实验依据。

1 材 料

1.1 药品与试剂

齐多夫定(CAS:A122924,纯度大于98%,阿拉丁试剂有限公司);胰岛素注射液(诺和灵30R,丹麦诺和诺德公司);RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术研究所);总RNA提取试剂,HiScript® Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)逆转录试剂盒,AceQ® qPCR SYBR® Green Master Mix DNA扩增试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司);β-actin、葡萄糖转运蛋白(Glut2)、肉碱棕榈酸转移酶(Cpt1α)、中链酰基辅酶A脱氢酶(Mcad)抗体(美国Proteintech公司);Akt、P-Akt抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。葡萄糖、甘油三脂检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司);丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)血生化试剂盒(南京威特曼生物科技有限公司);非酯化脂肪酸检测试剂盒(日本Wako公司)。所用引物由上海英潍捷基公司合成。

1.2 仪 器

Legend Micro 21R低温离心机,Varioskan Lux多功能微孔板读数仪,Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪,Applied Biosystems StepOneTM实时荧光定量PCR仪(美国Thermo公司);TL系列中高通量组织细胞研磨破碎仪(北京鼎昊源科技有限公司);D1100-230V恒温金属浴(美国Labnet公司);PowerPac™ HC电泳仪电源,Gel Doc XR+凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司);BX53生物显微镜(日本Olympus公司)。

1.3 动 物

SPF级雄性ICR小鼠,6~8周龄,体重18~22 g,购自河南斯克贝斯生物科技有限公司,生产许可证号SCXK(豫)2020-0005。所有动物实验均符合中国药科大学动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 剂量设置及分组

24只雄性ICR小鼠随机分为3组,每组8只,分别为溶剂对照组(CON)、齐多夫定低、高剂量组(AZT-L、AZT-H)。齐多夫定给药组每天灌胃给予AZT 100,300 mg/kg,溶剂对照组灌胃给予相应体积的蒸馏水,连续12周。给药结束后禁食12 h摘眼球采血,颈椎脱臼处死小鼠,分离肝脏。

2.2 血清生化指标检测

12周给药结束后,分别在禁食6 h和12 h后进行眼眶取血,将全血于200 μL离心管中常温静置30 min后,4 ℃,3 000 r/min离心15 min,吸取上层血清至200 μL EP管中,按血生化试剂盒说明测定血清葡萄糖(GLU)和甘油三酯(TG)水平。

2.3 糖耐量实验

给药结束前7天,小鼠禁食不禁水12 h后,灌胃给予2 g/kg葡萄糖溶液。分别测定给予葡萄糖0,15,30,60,120 min后小鼠的血糖,计算血糖浓度-时间曲线下面积(AUC)。

2.4 胰岛素耐量实验

给药结束前4天,小鼠禁食不禁水6 h后,腹腔注射0.75 U/kg 胰岛素注射液。分别测定给予胰岛素0,15,30,60,120 min后小鼠的血糖,计算血糖浓度-时间AUC。

2.5 肝脏指数及肝脂检测

小鼠肝脏用生理盐水漂洗干净,滤纸吸干称重,计算肝脏指数,即肝脏占体重的质量分数。称取肝组织30 mg,加入磷酸盐缓冲液(PBS)研磨,使用BCA法测定蛋白浓度,吸取肝匀浆上清液测定肝脏组织TG、非酯化脂肪酸(NEFA)水平。

2.6 肝脏病理学检测

取小鼠肝脏左叶中间部分,在4%中性甲醛中固定48 h,然后进行石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木精-伊红(HE)染色,最后在显微镜下观察肝组织病理学形态变化。

2.7 Western blot检测相关蛋白表达

称取肝组织30 mg,加入RIPA裂解液提取肝总蛋白,使用BCA法定蛋白,金属浴煮蛋白,-20 ℃保存变性蛋白。取等体积蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,在冰上恒流模式下进行转膜,5% BSA封闭2 h,4 ℃孵育一抗过夜,一抗为Cpt1α、Mcad、Glut2、Akt、P-Akt抗体。第2天用TBST洗膜,孵育二抗羊抗兔IgG抗体1 h,再洗膜,采用化学发光法曝光。使用Image J进行蛋白条带的灰度分析。

2.8 RT-PCR检测相关基因表达

称取肝组织30 mg,加Trizol裂解液1 mL提取总RNA。使用超微量核酸蛋白测定仪检测RNA浓度,在逆转录仪上将RNA逆转录成cDNA。运用实时荧光定量PCR法测定cDNA样品中的Cpt1αMcadPepckG6paseGlut2的基因水平。选用β-actin作为内参基因,引物序列如表1所示。

Table 1  Primer sequences for real-time quantitative PCR assay
GenePrimer sequence (5′→3′)
β-actin F:CATTGCTGACAGGATGCAGAAGG
R:TGCTGGAAGGTGGACAGTGAGG
Cpt1α F:TCGAAACATCTACCATGCAGCA
R:CAGCATTCTTCGTGACGTTGG
Mcad F:GATCGCAATGGGTGCTTTTGATAGAA
R:AGCTGATTGGCAATGTCTCCAGCAAA
Glut2 F:CCTCAAGAGGTAATAATATCCC
R:CCATCAAGAGGGCTCCAGTC
Pepck F:CTTCTCTGCCAAGGTCATCC
R:TTTTGGGGATGGGCAC
G6pase F:GCTGAAACTTTCAGCCACATCC
R:TCCAAGCGGGAAACCAAAC

2.9 统计分析

使用GraphPad Prism 6.01软件进行数据统计处理,实验结果以x¯±s表示。组间数据统计分析采用One-Way ANOVA检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 齐多夫定对小鼠体重及肝脏系数的影响

图1所示,各组小鼠在给药期间体重均有所上升,而各组间体重及肝脏指数均无明显差异。

  

Figure 1  Effect of zidovudine (AZT) on the body weight (A) and liver index (B) in mice (x¯±s, n=8)

CON: Solvent control; AZT-L: Zidovudine(100 mg/kg); AZT-H: Zidovudine(300 mg/kg)

3.2 齐多夫定对小鼠血糖、血脂的影响

图2血清生化结果显示,随着禁食时间的延长,对照组小鼠血清葡萄糖和甘油三酯水平都显著降低;与溶剂对照组相比,AZT给药对于禁食6 h与禁食12 h血糖水平无明显影响(图2-A),但却显著抑制禁食12 h血清甘油三酯的降低(图2-B)。

  

Figure 2  Effect of AZT on serum glucose(A) and triglyceride (TG)(B) in mice after fasting for 6 h or 12 h (x¯±s, n=8)

*P < 0.05

3.3 齐多夫定对小鼠糖耐量及胰岛素耐量的影响

图3口服糖耐量(OGTT)结果显示,溶剂对照组小鼠灌胃葡萄糖后,血糖在15 min时达到最大值,之后逐渐下降,120 min时恢复到基础水平。与对照组相比,低剂量组小鼠血糖无明显变化,而高剂量组小鼠在15 min和30 min的血糖明显高于对照组(图3-A)。计算AUC发现,AZT高剂量组可明显降低糖耐量水平(图3-B)。

  

Figure 3  Effect of AZT in oral glucose tolerance test (OGTT) (A) and insulin tolerance test (ITT) (B) (x¯±s, n=8)

*P < 0.05, ***P < 0.001

胰岛素耐量(ITT)结果显示,溶剂对照组小鼠注射胰岛素后,血糖急速下降,在30 min时降到最低,随后90 min内肝脏糖异生增加使血糖恢复至基础水平。与对照组相比,AZT给药组可以剂量依赖性的增加胰岛素注射后30 min内的降糖速率,然而,AZT各剂量组血糖上升趋势明显被抑制,提示小鼠肝脏糖异生能力受损(图3-C)。结果显示AZT明显降低AUC水平(图3-D)。

3.4 齐多夫定对小鼠肝组织病理学的影响

肝脏HE染色结果如图4所示,溶剂对照组小鼠肝细胞结构完整,肝索排列整齐,AZT高剂量组小鼠表现出肝细胞体积增大,胞浆淡染,而低剂量组对小鼠肝脏无明显影响。

  

Figure 4  Effect of AZT on liver histopathology of mice (HE staining, × 200)

A: CON; B: AZT-L; C: AZT-H

3.5 齐多夫定对小鼠肝脏的影响

血清生化结果显示,AZT给药组呈剂量相关性的增加ALT、AST水平,说明AZT可导致肝脏受损(图5-A、B);肝脏组织TG、NEFA指标明显升高,说明肝脏脂质蓄积(图5-C、D)。

  

Figure 5  Effect of AZT on liver of mice (x¯±s, n=8)

A: Alanine aminotransferase (ALT);B: Aspartate aminotransferase (AST);C: TG D: Non-esterified fatty acids (NEFA) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001

3.6 齐多夫定对小鼠肝脏糖脂代谢基因表达的影响

PCR结果如图6所示,与溶剂对照组相比,AZT给药后参与脂肪酸转运的关键酶Cpt1α及脂肪酸β氧化反应第一步的中链酰基辅酶A脱氢酶(Mcad)基因表达剂量依赖性的下调。而糖代谢相关基因结果显示葡萄糖转运蛋白(Glut2)的基因表达上调,糖异生基因PepckG6pase表达呈剂量相关性的下调。结果表明AZT导致肝脏脂肪酸氧化被抑制,能量缺乏导致糖酵解增强,同时糖异生过程被抑制。

  

Figure 6  Effects of AZT on gene expression of glycolipid metabolism in mice (x¯±s, n=6)

*P < 0.05, ***P < 0.001 vs CON group

3.7 齐多夫定对肝脏糖脂代谢相关蛋白表达的影响

图7所示,与溶剂对照组相比,AZT给药组脂肪酸转运蛋白Cpt1α表达明显下调,与基因结果一致;Glut2、Mcad及胰岛素信号通路相关蛋白表达无明显变化。

  

Figure 7  Effect of AZT on the expression of protein relative to glucose and lipid metabolism in mice (x¯±s, n=3)

A: Glut2; B: Mcad; C: Cpt1α; D: P-Akt/Akt *P < 0.05 vs CON group

4 讨 论

新陈代谢是生命体的基本要素,既有整体的特征,也有组织细胞层面的机制。当疾病、损伤、药物等外界因素作用于机体代谢的某个过程,如果超过了机体自身调节能力,即表现为某些代谢失衡特征,甚至诱发多种代谢性疾

14-15

葡萄糖是机体多数组织主要的能量代谢底物,也是多数代谢失衡病症的主要易损指

17。本实验中口服糖耐量结果显示,AZT高剂量组出现明显的糖耐量受损,提示机体对于外源性葡萄糖处置能力显著下降。胰岛素耐量结果显示,正常组小鼠血糖曲线先是经历30 min的快速下降相,再出现90 min的缓慢上升相,前者是外源性胰岛素的降糖作用,后者则是血糖降低继发的肝糖输出所致,其中肝糖异生发挥主要贡献。与正常小鼠相比,AZT给药可使得血糖下降相的斜率更大,提示给药组胰岛素的血糖处置能力增强或者敏感性增加;同时血糖上升相接近消失,提示给药组肝脏糖异生作用被抑制。由此可见,AZT长期给药一方面使得机体处置外源性葡萄糖能力(糖耐量实验)受损,另一方面却又使得胰岛素敏感性增强(胰岛素耐量实验)和肝脏糖异生减弱,表明AZT可损害机体葡萄糖代谢,但是对胰岛素介导的内源性糖代谢无不良影响。

脂肪酸作为另一种主要的能量物质,可与葡萄糖共同参与能量代谢供应,这即是机体代谢灵活性特征之

18。本实验中,通过检测禁食(能量匮乏)状态下小鼠血糖、血脂的水平,观察AZT对糖脂代谢选择性的影响。随着禁食时间的延长,正常小鼠血清葡萄糖和甘油三酯水平都显著降低,表明机体在利用内源性的糖和脂代谢供能;AZT长期给药对于内源性葡萄糖利用无明显影响,但却显著抑制甘油三酯的代谢利用,表明AZT损害小鼠对能量代谢底物的选择,影响了糖脂代谢平衡。

线粒体是糖、脂等能量物质转化的主要场所,在糖脂代谢调节中发挥关键作

19-20。在富含碳水化合物的餐后,葡萄糖和胰岛素高时,葡萄糖摄取、糖酵解和丙酮酸氧化增加,脂肪酸氧化受到抑制。在禁食期间, Cpt1α的活性增加,脂肪酸进入线粒体进行β氧21-22,脂肪酸利用率的增加会抑制葡萄糖转运蛋白,阻碍葡萄糖的摄取和使用。肝脏是协调全身代谢的的主要器官,也是线粒体含量丰富的器官,在机体代谢调节中具有重要作23。本实验中,AZT给药组血清转氨酶水平升高,肝脏脂质含量(TG、NEFA)增加,提示肝细胞损害和脂质代谢障碍。AZT给药组肝脏糖代谢基因表达明显上调,而脂肪酸氧化基因及糖异生基因表达明显下降。AZT明显抑制Cpt1α的蛋白水平,但对于糖代谢相关蛋白(Glut2、Mcad及胰岛素信号通路)表达未见明显影响,提示AZT长期给药导致肝脏脂肪酸转运受阻,不能通过脂肪酸β氧化来提供能量。由此可见,肝脏是AZT诱发代谢失衡的潜在靶器官,而肝脏线粒体脂肪酸代谢障碍是其影响代谢平衡的潜在机制。

总之,AZT长期给药可导致小鼠代谢失衡,主要表现为糖耐量受损和脂肪酸代谢障碍,肝脏是其重要的靶器官,其可能作用机制是通过下调脂肪酸氧化代谢及糖异生基因表达,从而导致肝脏脂质蓄积和糖脂代谢紊乱。机体糖脂代谢的调节是由多器官参与的,器官之间的交叉对话在能量稳态调节中也至关重要,后续研究可继续从代谢平衡调节着手,通过肌肉、脂肪、胰腺等多器官探讨,进一步阐释AZT导致代谢紊乱的机制。

References

1

Chen XZWang RZhang YJet al. Changes in epidemiological profiles of AIDS in China:a systematic analysis[J]. Lancet2019394S8. [百度学术] 

2

AIDS and Hepatitis C Professional GroupSociety of Infectious DiseasesChinese Medical Association. Chinese guidelines for diagnosis and treatment of HIV/AIDS (2021 edition)[J]. Chin J Intern Med(中华内科杂志)20216012):1106-1128. [百度学术] 

3

Sapuła MSuchacz MZałęski Aet al. Impact of combined antiretroviral therapy on metabolic syndrome components in adult people living with HIV:a literature review[J]. Viruses2022141):122. [百度学术] 

4

Tsai FJHo MWLai CHet al. Evaluation of oral antiretroviral drugs in mice with metabolic and neurologic complications[J]. Front Pharmacol201891004. [百度学术] 

5

Yarchoan RKlecker RWWeinhold KJet al. Administration of 3'-azido-3'-deoxythymidine,an inhibitor of HTLV-III/LAV replication,to patients with AIDS or AIDS-related complex[J]. Lancet198618481):575-580. [百度学术] 

6

Clumeck Nde Wit S. Update on highly active antiretroviral therapy:progress and strategies[J]. Biomed Pharmacother2000541):7-12. [百度学术] 

7

Günthard HFSaag MSBenson CAet al. Antiretroviral drugs for treatment and prevention of HIV infection in adults:2016 recommendations of the international antiviral society-USA panel[J]. JAMA20163162):191-210. [百度学术] 

8

Igoudjil AMassart JBegriche Ket al. High concentrations of stavudine impair fatty acid oxidation without depleting mitochondrial DNA in cultured rat hepatocytes[J]. Toxicol In Vitro2008224):887-898. [百度学术] 

9

Lin HStankov MVHegermann Jet al. Zidovudine-mediated autophagy inhibition enhances mitochondrial toxicity in muscle cells[J]. Antimicrob Agents Chemother2018631):e01443-e01418. [百度学术] 

10

Santos-Llamas AMonte MJMarin JJGet al. Dysregulation of autophagy in rat liver with mitochondrial DNA depletion induced by the nucleoside analogue zidovudine[J]. Arch Toxicol2018926):2109-2118. [百度学术] 

11

Bañó MMorén CBarroso Set al. Mitochondrial toxicogenomics for antiretroviral management:HIV post-exposure prophylaxis in uninfected patients[J]. Front Genet202011497. [百度学术] 

12

Goodpaster BHSparks LM. Metabolic flexibility in health and disease[J]. Cell Metab2017255):1027-1036. [百度学术] 

13

Morio BPanthu BBassot Aet al. Role of mitochondria in liver metabolic health and diseases[J]. Cell Calcium202194102336. [百度学术] 

14

Ruocco MRAvagliano AGranato Get al. Metabolic flexibility in melanoma:a potential therapeutic target[J]. Semin Cancer Biol201959187-207. [百度学术] 

15

Smith RLSoeters MRWüst RCIet al. Metabolic flexibility as an adaptation to energy resources and requirements in health and disease[J]. Endocr Rev2018394):489-517. [百度学术] 

16

Lagathu CBéréziat VGorwood Jet al. Metabolic complications affecting adipose tissue,lipid and glucose metabolism associated with HIV antiretroviral treatment[J]. Expert Opin Drug Saf2019189):829-840. [百度学术] 

17

Xiao JQXu JShu FRet al. Effect of Artemisia Argyi Folium ethanolic extract on blood glucose and blood lipids in diabetic mice[J]. J China Pharm Univ(中国药科大学学报)2021521):71-76. [百度学术] 

18

Soeters MRSoeters PBSchooneman MGet al. Adaptive reciprocity of lipid and glucose metabolism in human short-term starvation[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab201230312):E1397-E1407. [百度学术] 

19

Gambardella JLombardi ASantulli G. Metabolic flexibility of mitochondria plays a key role in balancing glucose and fatty acid metabolism in the diabetic heart[J]. Diabetes20206910):2054-2057. [百度学术] 

20

Tucci SAlatibi KIWehbe Z. Altered metabolic flexibility in inherited metabolic diseases of mitochondrial fatty acid metabolism[J]. Int J Mol Sci2021227):3799. [百度学术] 

21

Tomašić NKotarsky Hde Oliveira Figueiredo Ret al. Fasting reveals largely intact systemic lipid mobilization mechanisms in respiratory chain complex III deficient mice[J]. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis202018661):165573. [百度学术] 

22

Qiu XCLi JLv SHet al. HDAC5 integrates ER stress and fasting signals to regulate hepatic fatty acid oxidation[J]. J Lipid Res2018592):330-338. [百度学术] 

23

Bideyan LNagari RTontonoz P. Hepatic transcriptional responses to fasting and feeding[J]. Genes Dev2021359/10):635-657. [百度学术]