摘要
柠檬苦素是一种在柑橘属植物中含量较丰富的化合物，具有较广泛的生物活性，但因其水溶性较差，限制了其实际应用。本研究以柠檬苦素为起始原料，在其7位羰基处引入苯甲酰腙，设计、合成了8个新化合物7a～7h。实验结果表明，所有化合物的水溶性较柠檬苦素均有所提升，其中化合物7a、7d、7e和7f较为明显；此外，在苯环间位和对位上有取代羟基的化合物7d和7e对大肠埃希菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（S.aureus）具有较强的抗菌活性，化合物7e活性最好，其最低抑菌浓度分别为0.31 mg/mL和1.25 mg/mL，且化合物7e的抗E.coli效果优于苯甲酸钠。
酰腙类化合物是由酰肼类化合物与羰基类化合物经过脱水而成的一种席夫碱，具有较好的生物活性［1］，如抗结核［2］、抗菌［3］、抗虫［4］等，在医学、生物和农药等领域应用较为广泛。
柠檬苦素是一种含有4，4，8-三甲基-17-呋喃甾体骨架的化合物，主要存在于芸香料和楝科植物中［5］，具体结构如图1所示，在D环C-17处连接一个呋喃环，同时在C-3，C-4，C-7，C-16以及C-17连接含氧官能团。研究表明，柠檬苦素及其类似物的A环和B环是其抗菌效果的关键位点［6］，具有潜在的研究价值，但因其水溶性不佳，生物利用率低［7］，因此，影响了其实际的应用。
Figure 1 Chemical structure of limonin
为解决柠檬苦素水溶性较差和提高化合物的抗菌效果，本研究利用药物设计中的拼合原理，在其7位羰基处引入苯甲酰腙，合成了8个柠檬苦素苯甲酰腙衍生物（7a～7h），并进行了水溶性和抗菌活性研究。
目标化合物的7a～7h的制备见路线1。由柠檬苦素（1）为起始原料与苯甲酰肼或取代的苯甲酰肼在甲醇中缩合，可得到相应的酰腙目标产物7a～7h。
MSH-20D型数显磁力加热搅拌器（大韩科学有限公司）；RE-3000型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DLSB-20/40型低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；AM-300型核磁共振仪、AM-400型核磁共振仪器、Esquire LC型质谱仪（德国Bruker公司）；高效液相色谱仪（日本岛津公司）。
Scheme 1 Synthetic route of water-soluble limonin benzoylhydrazone derivatives 7a-7h
Reagents and conditions:a:Ar-CONHNH2, methanol, reflux
所有试剂均为分析纯，柠檬苦素购于成都仪睿生物科技有限公司，其余试剂购于安耐吉化学。供试菌种：金黄色葡萄球菌（S.aureus，ATCC 3101）、大肠埃希菌（E.coli，ATCC 8735）均购于上海沪峥生物科技有限公司。
目标化合物的合成通法：称取取代苯甲酰肼1.5 mmol和柠檬苦素1 mmol置于50 mL圆底烧瓶中，加入甲醇 20 mL，乙酸2 mL，升温至70 ℃，搅拌反应48 h，并用TLC检测反应进度。待反应结束后，将反应液冷却至室温，减压去除溶剂后，用薄层硅胶色谱纯化得到化合物7a～7h，产率为47%～73%。
化合物7a 白色固体，收率47%。mp 240～241 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6） δ：10.92（1H，s，NH-H），7.86（2H，d，J = 7.4 Hz，Ar-H），7.74（2H，s，23-H），7.68（1H，t，J = 1.7 Hz，21-H），7.57（1H，m，Ar-H），7.51（2H，t，J = 7.3 Hz，Ar-H），6.52（1H，s，22-H），5.46（1H，s，17-H），4.85（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.43（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.10（2H，d，J = 5.0 Hz，1-H），2.95（1H，d，J = 14.2 Hz，15-H），2.82（1H，d，J = 16.4 Hz，2-H），2.63（1H，dd，J = 16.5，4.0 Hz，2-H），2.42（1H，d，J = 14.8 Hz，6-H），2.19（1H，d，J = 14.6 Hz，6-H），1.77（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.25（3H，d，J = 4.6 Hz，25-H），1.18（3H，s，26-H），1.04（3H，s，24-H），1.00（s，3H，18-H）。分子式为：C33H36N2O8，HR-ESUMS m/z：589.254 1［M+H］+。
化合物7b 白色固体，收率73%。mp 205～206 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6） δ：10.83（1H，s，NH-H），7.77（2H，d，J = 8.0 Hz，Ar-H），7.74（2H，s，23-H），7.68（1H，t，J = 1.7 Hz，21-H），7.31（2H，d，J = 7.9 Hz，Ar-H），6.51（1H，s，22-H），5.45（1H，s，17-H），4.84（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.43（1H，d，J = 12.8 Hz，19-H），4.09（1H，s，1-H），3.83（3H，s，OCH3-H），2.82（1H，d，J = 16.5 Hz，2-H），2.62（1H，dd，J = 16.4，4.0 Hz，2-H），2.18（1H，d，J = 14.2 Hz，6-H），1.88 ~ 1.71（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.23（3H，d，J = 3.6 Hz，25-H），1.17（3H，s，26-H），1.03（3H，s，24-H），0.99（3H，s，18-H）。分子式为：C34H38N2O9，HR-ESUMS m/z：641.248 2［M+Na］+。
化合物7c 白色固体，收率51%。mp 242～244 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6） δ：10.77（1H，s，NH-H），7.85（2H，d，J = 8.4 Hz，Ar-H），7.74（3H，d，J = 1.5 Hz，23-H），7.68（1H，t，J = 1.8 Hz，21-H），7.04（2H，d，J = 8.7 Hz，Ar-H），6.51（1H，d，J = 1.6 Hz，22-H），5.45（1H，s，17-H），4.84（1H，d，J = 13.1 Hz，19-H），4.43（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.09（1H，s，1-H），2.62（1H，dd，J = 16.6，4.0 Hz，2-H），2.38（3H，s，CH3-H），2.18（1H，d，J = 14.6 Hz，6-H），1.76（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.22（3H，s，25-H），1.17（3H，s，26-H），1.03（3H，s，24-H），0.99（3H，s，18-H）。分子式为：C34H38N2O8，HR-ESUMS m/z：625.252 6［M+Na］+。
化合物7d 白色固体，收率50%。mp 215～216 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6） δ：10.81（1H，s，NH-H），9.74（1H，s，OH-H），7.74（1H，d，J = 1.4 Hz，23-H），7.68（1H，t，J = 1.7 Hz，21-H），7.29（2H，d，J = 5.5 Hz，Ar-H），7.22（1H，s，Ar-H），6.97 ~ 6.92（1H，m，Ar-H），6.55 ~ 6.49（1H，m，22-H），5.45（1H，s，17-H），4.84（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.43（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.12（1H，s，1-H），2.62（1H，dd，J = 16.4，3.9 Hz，2-H），2.40（1H，d，J = 14.6 Hz，6-H），2.18（1H，d，J = 14.5 Hz，6-H），1.77（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.20（6H，d，J = 14.8 Hz，25-H；26-H），1.01（6H，d，J = 13.7 Hz，24-H；18-H）。分子式为：C33H36N2O9，HR-ESUMS m/z：627.231 9［M+Na］+。
化合物7e 白色固体，收率36%。mp 218～219 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6） δ：10.65（1H，s，NH-H），10.07（1H，s，OH-H），7.76（2H，d，Ar-H），7.74（2H，d，J = 1.6 Hz，23-H），7.68（1H，t，J = 1.7 Hz，21-H），6.85 ~ 6.81（2H，m，Ar-H），6.51（1H，dd，J = 2.0，0.8 Hz，22-H），5.45（1H，s，17-H），4.83（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.42（1H，d，J = 12.9 Hz，19-H），4.09（1H，s，1-H），2.82（1H，d，J = 16.3 Hz，15-H），2.62（1H，dd，J = 16.5，4.0 Hz，2-H），2.38（1H，d，J = 14.7 Hz，6-H），2.22 ~ 2.14（1H，m，6-H），1.76（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.23（3H，d，J = 6.8 Hz，25-H），1.17（3H，s，26-H），1.03（3H，s，24-H），0.99（3H，s，18-H）。分子式为：C33H36N2O9，HR-ESUMS m/z：627.232 2［M+Na］+。
化合物7f 白色固体，收率58%。mp 215～217 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6） δ：10.41（1H，s，NH-H），7.75 ~ 7.72（1H，m，23-H），7.68（1H，t，J = 1.7 Hz，21-H），7.61（2H，d，J = 8.6 Hz，Ar-H），6.57（2H，d，J = 8.6 Hz，Ar-H），6.51（1H，dd，J = 2.0，0.8 Hz，22-H），5.73（2H，s，NH2-H），5.45（1H，s，17-H），4.82（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.42（1H，d，J = 12.9 Hz，19-H），4.13（1H，s，1-H），3.17（1H，d，J = 5.2 Hz，15-H），2.91（1H，d，J = 14.4 Hz，15-H），2.81（1H，d，J = 16.4 Hz，2-H），2.62（1H，dd，J = 16.5，4.0 Hz，2-H），2.36（1H，d，J = 14.7 Hz，6-H），2.17（1H，d，J = 14.5 Hz，6-H），1.91（1H，s，5-H），1.75（4H，d，J = 9.0 Hz，11-H；12-H），1.22（3H，s，25-H），1.17（3H，s，26-H），1.03（3H，s，24-H），0.98（3H，s，18-H）。分子式为：C33H37N3O8，HR-ESUMS m/z：626.248 0［M+Na］+。
化合物7g 白色固体，收率54%。mp 257～259 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6） δ：11.03（1H，s，NH-H），7.90（1H，s，Ar-H），7.83（1H，d，J = 7.4 Hz，Ar-H），7.74（1H，s，23-H），7.68（1H，t，J = 1.7 Hz，21-H），7.64（1H，s，Ar-H），7.55（1H，t，J = 7.8 Hz，Ar-H），6.51（1H，s，22-H），5.45（1H，s，17-H），4.85（1H，d，J = 12.9 Hz，19-H），4.43（1H，d，J = 12.9 Hz，19-H），4.09（1H，s，1-H），2.87（1H，d，J = 15.0 Hz，15-H），2.76（1H，d，J = 16.7 Hz，2-H），2.63（1H，dd，J = 16.5，4.0 Hz，2-H），2.42（1H，d，J = 14.9 Hz，6-H），2.18（1H，d，J = 14.4 Hz，6-H），1.77（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.24 ~ 1.23（3H，m，25-H），1.18（3H，s，26-H），1.04（3H，s，24-H），1.00（3H，s，18-H）. 分子式为：C33H35ClN2O8，HR-ESUMS m/z：645.202 1［M+Na］+。
化合物7h 白色固体，收率51%。mp 210～212 ℃；1H NMR（300 MHz，DMSO-d6） δ：10.99（1H，s，NH-H），7.89（2H，d，J = 8.2 Hz，Ar-H），7.73（1H，s，23-H），7.67（1H，t，J = 1.7 Hz，21-H），7.58（2H，d，J = 8.1 Hz，Ar-H），6.51（1H，s，22-H），5.45（1H，s，17-H），4.85（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.42（1H，d，J = 13.0 Hz，19-H），4.09（1H，s，1-H），2.87（1H，d，J = 15.3 Hz，15-H），2.76（1H，d，J = 16.2 Hz，2-H），2.63（1H，dd，J = 16.5，4.0 Hz，2-H），2.41（1H，d，J = 14.9 Hz，6-H），2.18（1H，d，J = 14.2 Hz，6-H），1.77（5H，m，5-H；11-H；12-H），1.24（3H，d，J = 3.6 Hz，25-H），1.17（3H，s，26-H），1.04（3H，s，24-H），0.99（3H，s，18-H）.分子式为：C33H35ClN2O8，HR-ESUMS m/z：645.198 5［M+Na］+。
将化合物7a～7h精密称量2.0 mg，置于10 mL量瓶中，加入适量甲醇振荡溶解后，加甲醇至刻度摇匀，即得到母液（200 mg/L）。将上述母液进行倍半稀释，待用。
精密称量化合物7a～7h 2.0 mg，加入蒸馏水2 mL超声溶解30 min后，过0.25 μm微孔滤膜除去未溶解的杂质，即得该化合物在室温下的饱和溶液。
精密吸取不同质量浓度的7a～7h对照品溶液20 μL注入液相色谱仪，检测波长选定为230 nm，流动相选用乙腈-水（1∶1），流速控制在1.0 mL/min，柱温选择常温，保留时间为10 min，以对照品的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，进行回归分析，得到相应的回归方程。并取供试品溶液20 μL注入液相色谱仪，在同一色谱条件下，记录峰面积，从而计算得出该化合物在室温下在水中的溶解度。
选用革兰阳性菌S.aureus和革兰阴性菌E.coli为实验菌株。以甲醇为溶剂，将合成的化合物和柠檬苦素分别配成5 mg/mL的溶液，将溶液通过0.22 μm滤膜滤入无菌离心管中，将足量的无菌滤纸片（6 mm）浸泡于溶液中，充分浸泡4 h后备用。取含有1 × 107～1 × 109 CFU/mL的菌液20 μL，均匀涂布在配好的平板牛肉膏固体培养皿中，用涂布棒将菌液分布均匀备用。将浸泡后的无菌滤纸片放置于涂布菌液的平板培养基上，倒置于37 ℃培养箱中培养24 h，观察实验结果，量取抑菌圈直径，记录平均值。根据文献中的评判标准［8］将发现的高敏化合物，采用平皿二倍稀释法，来测定活性化合物的最低抑菌浓度（MIC），并与柠檬苦素和苯甲酸钠进行比较。
酰腙的合成是有由羰基和酰肼反应生成的，一般情况下会选用强酸作催化剂，在醇溶液中进行，但由于柠檬苦素在乙醇中的溶解度低于甲醇，且其结构中A环和B环存在两个内酯环，在酸性过强时会导致其开环，因此在合成中需要选择使用甲醇作溶剂和酸性不强的乙酸做催化剂。此外，反应温度的控制也较为关键，试验表明，当反应温度超过90 ℃时会导致柠檬苦素的内酯环在酸性条件下和溶剂发生醇解，使得副产物增多。反应结束后，用硅胶柱以甲醇-二氯甲烷（1∶200）即可分离得到纯品化合物。
吸取化合物7a～7h供试液20 μL注入高效液相色谱仪，检测波长选定为230 nm，流动相选用乙腈-水（1∶1），流速在1.0 mL/min ，柱温选择常温，保留时间为10 min，记录峰面积，并带入标准曲线即得该化合物在室温下（25 ℃）水中的溶解度。计算结果见表1。
Table 1
Solubility of limonin benzoylhydrazone derivatives 7a-7h at room temperature
| Compd. | Solubility（mg/100 g H2O） |
|---|
|
Limonin |
0.47 |
|
7a |
4.48 |
|
7b |
2.22 |
|
7c |
0.62 |
|
7d |
6.77 |
|
7e |
8.07 |
|
7f |
42.42 |
|
7g |
1.58 |
|
7h |
1.81 |
从表1可以看出，柠檬苦素的7位羰基处引入苯甲酰腙基团后，水溶性显著提升，其中化合物7a，7d，7e，7f较为明显，化合物7f水溶性最强。
采用滤纸片法测定所合成的化合物在5 mg/mL下的抑菌圈直径，实验结果见表2。根据抑菌圈大小进行判断，所合成的化合物7d，7e对两种菌株都有一定的抑制活性，其中化合物7d对S.aureus和E.coli表现为中度敏感，化合物7e对S.aureus和E.coli表现为高度敏感，而化合物7a和7f，仅对S.aureus表现中度敏感。
Table 2
Diameter of bacteriostatic circle for the compounds 7a-7h in 5 mg/mL()
| Compd. | S. aureus | E. coli |
|---|
|
7a |
10 ± 1 |
- |
|
7b |
- |
- |
|
7c |
- |
- |
|
7d |
11 ± 1 |
13 ± 1 |
|
7e |
16 ± 2 |
22 ± 1 |
|
7f |
10 ± 1 |
- |
|
7g |
- |
- |
|
7h |
- |
- |
|
Limonin |
- |
- |
|
Sodium benzoate |
22 ± 1 |
20 ± 1 |
|
CH3OH |
- |
- |
"-" indicates no bacteriostatic activity
用无菌甲醇或无菌水溶解化合物7e、柠檬苦素和苯甲酸钠制得母液，并用LB培养基以二倍稀释法分别稀释，得到终浓度分别为10.00，5.00，2.50，1.25，0.62和0.31 mg/mL的含药平板。在含药平板上接种每毫升含菌数约1 × 107个的S.aureus和E.coli的培养液20 μL，于细菌培养箱中培养18 h，观察生长结果，无菌生长的平板中所含药物最小浓度即为最低抑菌浓度（MIC），其结果见表3。
Table 3
Comparison of MIC between compound 7e and sodium benzoate
| Bacteria | MIC/（mg/mL） |
|---|
| Compound 7e | Sodium benzoate | Limonin |
|---|
|
S. aureus |
1.25 |
0.31 |
>10.00 |
|
E. coli |
0.31 |
0.62 |
>10.00 |
"+" indicates colony growth;"-" indicates the growth of sterile colonies
从表2可以看出，化合物7d、7e对两种菌株有抑制活性，化合物7a、7d、7f仅对S.aureus有抑制活性，结合表3可以得出，化合物7e对E.coli的抑菌效果优于苯甲酸钠，对S.aureus的抑菌效果要弱于苯甲酸钠，但化合物7e相较柠檬苦素在抗S.aureus和E.coli的效果上均有明显的提升。
综上所述，从总体构效关系来看，苯甲酰腙基的引入可以提升柠檬苦素抗S.aureus和E.coli的活性，该结果也与之前相关的报道一致［9］。结合化合物在苯环上的同一位置取代基的种类来看，在苯环间位和对位上的有氯取代的化合物（7g和7h），抗S.aureus和E.coli的活性较差；苯环对位上取代甲基和甲氧基的化合物（7b和7c），在抗S.aureus和E.coli的活性上，未表现出积极的影响；而在苯环间位和对位上取代羟基后的化合物（7d和7e），其抗S.aureus和E.coli的活性有较显著的增强，其中化合物7e在抗E.coli的活性强于苯甲酸钠。结合取代基在苯环上的位置来看，在苯环上间位的氯取代（7g）未改变化合物对S.aureu的抗菌活性；在苯环的间位的羟基取代（7d）则降低了化合物对S.aureus和E.coli的抗菌活性，其深入的构效关系有待进一步研究。
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