摘要
以微管蛋白抑制剂考布他汀A-4（CA-4）为先导化合物，通过骨架变换，以苯并咪唑环取代CA-4结构中的B环，并引入不同的取代基，设计合成了8个新化合物，结构经NMR，HRMS表征。通过MTT法测定其对A549、HepG2、HCT-116、MCF-7、PC-3以及Siha等6种肿瘤细胞的增殖抑制作用，利用划痕实验评价了化合物对细胞迁移作用的影响，运用分子对接法分析了活性化合物与微管蛋白及PI3K激酶各亚型的作用方式。结果表明，化合物4e对6种肿瘤细胞表现出较好的增殖抑制活性，尤其对宫颈癌细胞Siha的抑制作用最强（IC50 = 12.18 ± 1.17 μmol/L），且能有效抑制细胞迁移，具有进一步研究的价值。分子对接结果表明，化合物4e与微管蛋白的结合能强于CA-4，与PI3Kδ激酶蛋白相互作用最强，结合能为-37.2 kJ/mol。本研究为基于PI3K与微管蛋白的抗肿瘤药物研究提供了一定的理论依据。
关键词
癌症是危害人类健康的重大疾病，传统细胞毒类药物多伴随着选择性差、不良反应大、患者耐受性较差以及长期使用易产生耐药性等缺
Figure 1 Chemical structures of PI3K inhibitor LY249002 and BKM120
微管是由α、β两种微管蛋白聚合而成的管状聚合物，在维持细胞形态、细胞运动以及胞内物质运输等发挥重要作用，是抗肿瘤药物研究与开发的重要靶
Figure 2 Chemical structures of combretastatin A-4(CA-4) and its derivatives synthesized in previous works
本文以CA-4为先导化合物，在前期研究基础上，以苯并咪唑环替代其B环，利用拼合原理在该骨架中引入丙烯酰胺（酯）基团，经4步反应合成了8个新型化合物，测定了化合物的抗肿瘤活性，分析化合物与作用靶点的结合方式以及构效关系，为开发具有PI3K激酶和微管蛋白双重抑制作用的小分子化合物提供依据。
合成路线如
Figure 3 Synthetic route of combretastatin A-4 derivatives 4a-4h
a: N-Iodosuccinimide, CH3COOH; b: KOH, CH3OH, DMSO; c: Na2S2O4, H2O, DMSO; d: DMF, Et3N, PdCl2(PPh3)2
CA-4（上海源叶生物科技有限公司）；实验室合成所用试剂及原料药均用市售分析纯商品；培养细胞用DEME、MEM、PBS和胎牛血清均购自以色列Biological Industries公司。
X-4型显微熔点仪（上海精密科学仪器有限公司）；Unity-Inova 600 MHz型核磁共振波谱仪（美国Varian公司）；Scientific Q Exactive型高分辨质谱仪（美国Thermo公司）；SOPTOP型倒置显微镜（宁波舜宇仪器公司）；Multiskan GO型全波长酶标仪（美国Thermo公司）；200 ~ 300目柱色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司）。
人宫颈癌细胞Siha、人结肠癌细胞HCT-116、人前列腺癌细胞PC-3、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞HepG2和人乳腺癌MCF-7均由新疆医科大学药学院张伟怡课题组惠赠。
将2-硝基-4-氯苯胺2.59 g（15 mmol）与NIS 3.37 g（15 mmol）溶解于乙酸中，升温至50 ℃反应8 h，TLC监测（乙酸乙酯-石油醚，1∶1）至反应完全。反应结束后将其冷却至室温，析出沉淀，抽滤，饱和NaHCO3溶液洗涤，蒸馏水洗涤，干燥，得到橘黄色固体粉末（4-氯-5-碘-2-硝基苯胺）4.96 g，收率83.2%，mp：131.1 ~ 132.6 ℃
将KOH 1.40 g（25 mmol）、中间体1 2.98 g（10 mmol）与甲醇15 mL溶解于DMSO溶液5 mL中，升温至60 ℃反应10 h，TLC监测（乙酸乙酯-石油醚，1∶1）至反应完全。反应结束后取出将其冷却至室温，析出针状沉淀，抽滤，蒸馏水洗涤，干燥，得到黄色固体粉末（4-甲氧基-5-碘-2-硝基苯胺）2.35 g，收率 78.9%，mp：178.9 ~ 180.2 ℃
将中间体2 0.58 g（2 mmol）和3，4，5-三甲氧基苯甲醛0.40 g（2 mmol）与连二亚硫酸钠0.52 g（3 mmol）溶解于DMSO 3 mL中，水浴80 ℃回流4 h，TLC监测（乙酸乙酯-石油醚，2∶1）至反应完全。反应结束后将其冷却至室温，加入大量蒸馏水，析出沉淀，抽滤，滤饼烘干，得到米黄色固体粉末（5-甲氧基-6-碘-2-（3，4，5-三甲氧基苯）-1H-苯并咪唑）0.67 g，收率68.4%，mp：170.1 ~ 172.0 ℃
将丙烯酸乙酯0.30 g（3 mmol）、中间体3 0.44 g（1 mmol）、2 mL三乙胺和双（三苯基膦）二氯化钯（Ⅱ） 28.20 mg（0.04 mmol）溶于N，N-二甲基甲酰胺溶液3 mL中，水浴 100 ℃回流12 h，TLC监测（乙酸乙酯-石油醚，5∶1）至反应完全。反应结束后将其冷却至室温，过滤除去钯粉，反应液依次经饱和NaCl溶液与乙酸乙酯萃取3次，合并有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸除溶剂，粗产物经硅胶柱色谱分离纯化（梯度洗脱石油醚-乙酸乙酯，5∶1 ~ 3∶1；乙酸乙酯-甲醇，5∶1），得浅黄色油状物，收率为51.6%，HRMS（m/z）［M+H
按化合物4a类似的方法分别制备了目标化合物4b ~ 4h，理化性质及光谱数据如下。
2.2.5 化合物4b（E）-3-［（5-甲氧基-2-（3，4，5-三甲氧基苯基）-1H-苯并［d］咪唑-6-基）］-1-（吗啉-4-基）-2-丙烯-1-酮的合成
米白色粉末，收率为34.6%，mp：164.8 ~ 165.7 ℃，HRMS（m/z） ［M+H
浅黄色粉末，收率为21.1%，mp：199.2 ~ 201.7 ℃，HRMS（m/z）［M+H
橘黄色粉末，收率为15.0%，mp：182.7 ~ 185.4 ℃，HRMS（m/z）［M+H
米白色粉末，收率为54.1%，mp：188.7 ~ 189.4 ℃，HRMS（m/z）［M+H
黄色粉末，收率为33.8%，mp：135.8 ~ 136.2 ℃，HRMS（m/z）［M+H
橘黄色粉末，收率为24.2%，mp：126.3 ~ 126.6 ℃，HRMS（m/z）［M+H
橘黄色粉末，收率为65.2%，mp：153.4 ~ 154.1 ℃，HRMS（m/z）［M+H
采用MTT法测试目标化合物对6种肿瘤细胞的增殖抑制活性，运用SPSS 25.0软件计算细胞半数抑制浓度（IC50），测试结果见
结果表明，化合物4a、4e和4f对多数肿瘤细胞增殖均表现出较好的抑制作用，化合物4e综合效果最好，对MCF-7、PC-3、HepG2、A549及Siha肿瘤细胞增殖抑制作用强于阳性对照CA-4。
采用划痕实验探究了Siha细胞用化合物4e给药24 h和48 h后细胞的迁移情况，运用ImagJ 1.8.0软件计算划痕区域面积得到细胞迁移率，运用Graphpad prism绘制柱形图，结果见
Figure 4 Effect of compound 4e on Siha cell migration（）
*P < 0.05,
本实验选取化合物4e与Ⅰ类PI3K激酶4个亚型α、β、γ和δ及微管蛋白进行对接研究。蛋白晶体结构主要从RCSB Protein Data Bank数据库中获取。蛋白晶体用Pymol软件去除原文件中的水分子和配体，加上极性氢原子和电荷。小分子由 ChemOffice 18.0绘制成3D格式，经MM-2能量优化后保存为“.pdb”格式备用。用AutoDock程序对化合物4e与准备好的蛋白进行分子对接，结合数据如
Figure 5 Binding of CA-4 or compound 4e with target proteins
A: 4e-PI3Kα; B: 4e-PI3Kβ; C: 4e-PI3Kγ; D: 4e-PI3Kδ; E: 4e-tubulin; F: CA-4-tubulin.The pink parts are small molecule ligands, the blue parts are amino acid residues, and the yellow dotted lines are hydrogen bond interactions
分子对接结果表明，化合物4e与微管蛋白结合能为-33.5 kJ/mol，强于CA-4（-28.0 kJ/mol）；化合物4e与PI3K 4个亚型激酶结合中发现，与PI3Kδ蛋白相互作用最强，结合能为-37.2 kJ/mol。该结果与细胞活性实验相吻合。
化合物4e中三甲氧基苯基在与PI3Kβ、PI3Kγ、PI3Kδ蛋白结合时占据了共同的疏水腔，疏水腔由Phe694、Phe698氨基酸残基构成。化合物4e中咪唑环上的N或-NH均可与PI3K 4种亚型蛋白形成氢键相互作用，苯并咪唑环的存在可能有利于固定3，4，5-三甲氧基苯基占据疏水腔从而产生相互作用。此外，苯并咪唑环还分别与PI3Kβ、PI3Kδ蛋白中的Asp788氨基酸残基形成了π-cation相互作用，进一步增强与激酶的结合作用。化合物4e与微管蛋白的氢键作用数比CA-4多。
分析化合物的构效关系发现，酰胺氮原子上的取代基对活性有较大影响，当叔丁基取代（4e）时，化合物对癌细胞的抑制作用最强；当N，N-二甲基取代（4f）时，化合物活性下降；而羟甲基、羟乙基取代（4g，4h）或未取代（4c，4d）时，化合物活性很弱。吗啉基取代的4b在本次实验中仅对结肠癌细胞表现出一定的活性，其在母核中的取代位置有待于进一步探索。化合物4a在部分肿瘤细胞增殖中亦表现出较好活性。细胞迁移实验初步证实，4e能有效抑制Siha细胞迁移，且呈浓度与时间依赖性。化合物4e与微管蛋白及PI3K激酶的分子对接结果为进一步活性验证实验提供了参考。
本文以微管蛋白抑制剂CA-4为先导化合物，结合前期研究基础，以苯并咪唑取代B环，在5位引入取代丙烯酰胺（酯）基团，设计合成了8个新型CA-4类衍生物。体外抗肿瘤活性筛选表明，以N-叔丁基取代的化合物4e对MCF-7、PC-3、HepG2、A549及Siha 5种肿瘤细胞的抑制作用优于CA-4。划痕实验显示化合物4e可抑制Siha细胞迁移，为CA-4类似物的结构修饰与活性优化提供了思路。
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