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阿魏酸衍生物的合成及其抗胆碱酯酶活性

- ORCID：
关丽 ¹
- ORCID：
宋旭超 ¹
- ORCID：
王小库 ¹
- ORCID：
赵宁 ¹
- ORCID：
李伟泽 ¹
✉
- ORCID：
汪洋 ^2,3
✉

1. 西安医学院药学院，西安 710021； 2. 西安医学院基础医学部，西安 710021； 3. 西安市病原微生物与肿瘤免疫重点实验室，西安 710021

中图分类号： R914

最近更新：2022-09-02

DOI：10.11665/j.issn.1000-5048.20220406

摘要

阿魏酸（ferulic acid，FA）是一种含酚羟基的苯丙素类天然产物，药理活性广泛，对于阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）具有一定疗效。以FA为原料，通过甲酯化对羧基进行保护，拼接氨基甲酸酯活性官能团，水解反应以及酰胺缩合等4步反应首次合成一系列阿魏酸氨基甲酸酯苯胺衍生物，采用Ellman法对FA衍生物进行体外抑制胆碱酯酶活性评价。共设计合成15个新颖的FA衍生物，结构经¹H NMR、¹³C NMR、ESI-MS 确证；体外胆碱酯酶活性测试显示，化合物5c，5f，5j，5g，5m 5个化合物对乙酰胆碱酯酶具有抑制作用，除化合物5l，5m以外，几乎所有化合物都对丁酰胆碱酯酶具有抑制活性，且远高于乙酰胆碱酯酶抑制活性。化合物5c，5f，5j，5g可以作为潜在的靶向胆碱酯酶的AD治疗药物。

关键词

阿魏酸; 衍生物; 合成; 阿尔茨海默病; 胆碱酯酶抑制剂; Ellman法

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）作为最常见的老年痴呆类型，目前还没有特效药。尽管关于AD发病机制有多种学说，但其治疗药物仍以乙酰胆碱酯酶抑制剂（ACEI）为主，但是，由于ACEI类药物对肝脏具有毒性，对心血管和胃肠道不良反应，因此，从天然产物中寻找抗AD新药是近年来药学研究的热点。

在神经系统中发现了两种类型的胆碱酯酶，即乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BuChE）。在相同条件下，AChE的乙酰胆碱水解活性比BuChE高1 × 10¹³倍^［

1］。有数据表明，增加对脑BuChE的抑制可能成为AD治疗的重要治疗策略。据报道，BuChE有一个关键作用，它可以部分补偿AChE的作用。此外，研究表明平衡抑制 AChE 和 BuChE 可能有益于治疗认知缺陷^{［参考文献 2

百度学术}2］。

阿魏酸（ferulic acid，FA）是一种含酚羟基的苯丙素类天然产物，药理活性广泛，具有抗炎、抗氧化、抑制Aβ聚集等功能^［

3-5］。利斯的明（rivastigmine）是美国FDA批准的用于治疗AD的药物，它是N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂，其结构中的N-乙基-N-甲基氨基甲酸酯基团为活性官能团区域^{［参考文献 6

百度学术}6］。Chen等^{［参考文献 7

百度学术}7］在2017年报道了3个阿魏酸-利斯的明骨架衍生物，它们表现出了不同程度的抗氧化活性和胆碱酯酶抑制活性。Lan等^{［参考文献 8

百度学术}8］在2019年报道了一个阿魏酸氨基甲酸酯衍生物，靶向胆碱酯酶的同时也可以起到神经保护和抗氧化功能，是一种多功能的抗AD化合物。

Figure 1 Structure of ferulic acid(FA) and ristigmine

FA由于其血脑屏障（BBB）渗透性差和生物利用度低，在治疗AD方面受到了限制。Puris等^［

9］应用L型氨基酸转运蛋白（LAT1）介导的前药方法，将FA递送到小鼠大脑中，并合成了3种新颖的利用LAT1的FA前药。结果证明，具有芳香环的酰胺基前药可有效结合至LAT1，利用转运蛋白进行体外细胞摄取，并在小鼠体内进行原位灌注后穿过BBB。

针对AD的药物在开发上的主要障碍是几乎所有的大分子药物和98％以上的小分子药物不能穿过BBB^［

10］。因此，增加脂溶性被认为是提高其血脑屏障通透性的最有效方法。对于化合物的设计考虑增加脂溶性可能有望成为治疗AD的潜在药物。

本课题以FA为底物，其结构中具有酚羟基和羧基两个活泼位点，针对这两个位点进行结构改造设计了一系列阿魏酸衍生物，将氨基甲酸酯基团拼接在FA酚羟基端，各类苯胺基团拼接在羧基端，这类化合物可能解决了FA血脑屏障渗透性差和生物利用度低的缺点，并可能提高抗胆碱酯酶活性。

1 合成路线

FA衍生物的制备如路线1所示。首先将FA羧基甲酯化以保护羧基，然后将不同的氨基甲酸基团接合在酚羟基端，随后水解暴露羧基，最终羧基与苯胺缩合形成15个新化合物5a ~ 5o。

Scheme 1 Synthesis of FA derivatives

a: CH₃OH, H₂SO₄, reflux, 3 h; b: K₂CO₃, aceton, reflux, 3 h; c: LiOH·H₂O, THF, CH₃OH, H₂O, r.t., 24 h; d: HATU, DIPEA, r.t., 2 h

2 实验部分

2.1　仪器与试剂

NMR Avance-300MHz核磁共振仪（德国Bruker公司）；ESI-MS质谱仪（美国Angilent公司）；RT-6000全自动酶标仪（深圳雷杜医疗器械有限公司）。

乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BuChE）、5，5'-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、碘化乙酰胆碱（ATCI）、碘化硫代丁酰胆碱（BTCI）以及阳性药多奈哌齐（Donepezil）均购自美国Sigma-Aldrich公司；DMSO（国药集团化学试剂有限公司）；硅胶GF₂₅₄薄层预制板（青岛海洋化工厂）；柱色谱硅胶（上海谱振生物科技有限公司）。其余所有试剂均为市售化学或分析纯，一般均不经纯化处理直接使用。

缓冲液A：Tris-HCl缓冲液；缓冲液B：PBS缓冲液；现配现用。

2.2　化学合成

2.2.1　阿魏酸甲酯的合成^[

11]

（E）-3-（4-羟基-3-乙氧基苯基）丙烯酸甲酯（2）在100 mL茄形瓶中加入FA 3 g（15.5 mmol），用甲醇30 mL溶解，缓慢加入浓硫酸1.2 mL（22.5 mmol），加毕，体系升温至70 ℃反应3 h。反应完毕，减压浓缩后用10% NaOH调节pH至7，加入乙酸乙酯萃取，用水洗涤，有机相用无水Na₂SO₄干燥后减压浓缩得到黄色油状物3.1 g，产率97%；¹H NMR （400 MHz，CDCl₃） δ：7.64（1H，d，J = 16.0 Hz，H-7），7.08（1H，d，J = 8.2 Hz，H-5），7.04（1H，s，H-3），6.93（1H，d，J = 8.0 Hz，H-6），6.31（1H，d，J = 16.0 Hz，H-8），6.07（1H，br.s，OH），3.93（3H，s，OCH₃），3.82（3H，s，OCH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：166.5，149.1，147.9，143.5，127.6，122.9，116.8，115.1，111.9，56.1，52.0；ESI-MS m/z：208.21［M + H］⁺。

2.2.2　阿魏酸甲酯氨基甲酸酯(3a ~ 3c)的合成^[

12]

化合物2（1 g，4.8 mmol）加入适量丙酮溶解后加入相应酰氯和K₂CO₃，反应体系升温至60 ℃，搅拌回流7 h，冷却至室温后过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤．滤液减压浓缩至干后加入乙酸乙酯溶解，用水洗涤，合并有机相，无水Na₂SO₄干燥后减压浓缩得到化合物。

（E）-3-（4-（（二甲基氨基甲酰基）氧基）-3-甲氧基苯基）丙烯酸甲酯（3a）黄色晶体；产率64.9%；mp：127 ~ 129 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：7.65（1H，d，J = 16.0 Hz，H-7），7.26（1H，s，H-3），7.10（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5），7.08（1H，d，J = 8.0 Hz，H-6），6.37（1H，d，J = 16.0 Hz，H-8），3.86（3H，s，OCH₃），3.81（3H，s，OCH₃），3.12（3H，s， -CH₃），3.01（3H，s，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：166.4，154.4，151.1，143.6，136.5，131.8，124.4，121.9，115.1，111.7，55.8，52.0，37.6；ESI-MS m/z：280.1［M + H］⁺。

（E）-3-（4-（（乙基（甲基）氨基甲酰基）氧基）-3-甲氧基苯基）丙烯酸甲酯（3b）白色固体；产率62.3%；mp：83 ~ 85 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：7.65（1H，d，J = 16.0 Hz，H-7），7.11，7.08（3H，m，H-3，5，6），6.38（1H，d，J = 16.0 Hz，H-8），3.86（3H，s，OCH₃），3.81（3H，s，OCH₃），3.05（5H，m， -CH₂CH₃），1.20（3H，t，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：166.6，154.3，151.5，143.6，136.5，131.8，124.4，121.9，115.1，110.9，55.8，52.0，47.5，36.0，12.4；ESI-MS m/z：294.1［M + H］⁺。

（E）-3-（4-（（二乙基氨基甲酰基）氧基）-3-甲氧基苯基）丙烯酸甲酯（3c）黄色晶体；产率63.4%；mp：59 ~ 61 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：7.65（1H，d，J = 16.0 Hz，H-7），7.11，7.08（3H，d，J = 12 Hz，H-3，5，6），6.37（1H，d，J = 16.0 Hz，H-8），3.86（3H，s，OCH₃），3.81（3H，s，OCH₃），3.45（4H，q，-CH₂），1.24（6H，t，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：166.5，154.8，151.5，143.6，136.5，131.8，124.4，121.9，115.1，110.9，55.8，52.1，45.0，12.7；ESI-MS m/z：308.1［M + H］⁺。

2.2.3　阿魏酸氨基甲酸酯(4a ~ 4c)的合成^[

13]

在THF-MeOH-H₂O（15∶5∶5） 25 mL的混合溶液中，加入化合物（3a ~ 3c）以及3倍当量LiOH·H₂O，室温搅拌24 h，减压去除溶剂后，用水30 mL稀释残渣，再用10%的HCl调节pH至4，用乙酸乙酯萃取（3 × 15 mL），将有机层合并，用无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩得到相应的产物（4a ~ 4c）。

（E）-3-（4-（（二甲基氨基甲酰基）氧基）-3-甲氧基苯基）丙烯酸（4a）白色粉末；产率75.5%；mp：201 ~ 202 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：12.39（1H，s，COOH），7.60（1H，d，J = 16.0 Hz，H-7），7.46（1H，s，H-3），7.25（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5），7.11（1H，d，J = 8.0 Hz，H-6），6.58（1H，d，J = 16.0 Hz，H-8），3.83（3H，s，OCH₃），3.05（3H，s，-CH₃），2.91（3H，s，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：171.5，154.4，151.5，144.9，136.5，131.8，124.4，121.9，116.5，110.9，55.8，37.6；ESI-MS m/z：266.1［M + H］⁺。

（E）-3-（4-（（乙基（甲基）氨基甲酰基）氧基）-3-甲氧基苯基）丙烯酸（4b）白色固体；产率78%；mp：126 ~ 128 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：12.41（1H，s，COOH），7.59（1H，d，J = 16.0 Hz，H-7），7.47（1H，s，H-3），7.25（1H，d，J = 8.0 Hz，H-5），7.11（1H，d，J = 8.0 Hz，H-6），6.59（1H，d，J = 16.0 Hz，H-8），3.83（3H，s，OCH₃），3.01（5H，m， -CH₂，CH₃），1.19（3H，t，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：171.5，154.1，151.5，144.9，136.5，131.8，124.4，121.9，116.5，110.9，55.8，47.5，36.0，12.4；ESI-MS m/z：280.1［M + H］⁺。

（E）-3-（4-（（二乙基氨基甲酰基）氧基）-3-甲氧基苯基）丙烯酸（4c）白色固体；产率76%；mp：126 ~ 127 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：7.72（1H，d，J = 16.0 Hz，H-7），7.13，7.10（3H，d，J = 12 Hz，H-3，5，6），6.36（1H，d，J = 16.0 Hz，H-8），3.87（3H，s，OCH₃），3.40（4H，dd，-CH₂），1.24（6H，t，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：171.5，154.8，151.5，144.9，136.5，131.8，124.4，121.9，116.5，110.9，55.8，45.0，12.7；ESI-MS m/z：294.1［M + H］⁺。

2.2.4　阿魏酸氨基甲酸酯苯胺衍生物的合成(5a~ 5o)

在50 mL茄型瓶中加入化合物（4a ~ 4c） 0.2 mol、2-（7-氮杂苯并三氮唑）-N，N，N'，N'-四甲基脲六氟磷酸酯（HATU）（1.2 eq）和N，N-二异丙基乙胺（DIEPA）（2 eq），搅拌15 min后加入相应苯胺（0.2 mol），室温下反应2 h，点板检测反应完毕后，用石油醚-丙酮（105∶30）进行柱色谱分离纯化。

（E）-2-甲氧基-4-（3-氧代-3-（苯基氨基）-1-丙烯基）苯基二甲基氨基甲酸酯（5a）白色固体；产率46.2%；mp：178 ~ 180 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.34（1H，s，H-9），7.65（2H，d，J = 8.0 Hz，H-11，15），7.47（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.32（2H，t，H- 12，14），7.09（1H，t，H-13），7.04（1H，d，J = 8.0 Hz，H-4），6.96（1H，d，J = 8.0 Hz，H-3）， 6.89（1H，s，H-6），6.00（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.66（3H，s，OCH₃），3.19（3H，s，-CH₃），3.10（3H，s，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：165.5，154.4，151.5，141.7，140.3，136.5，135.3，128.9，128.0，124.4，121.9，121.6，116.5，110.9，55.8，37.6；ESI-MS m/z：341.1［M + H］⁺。

（E）-4-（3-（（（4-氯苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基二甲基氨基甲酸酯（5b）白色固体；产率60.7%；mp：164 ~ 166 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.52（1H，s，H-9），7.62（2H，d，J = 8.0 Hz，H-11，15），7.42（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.28（2H，d，H-12，14），7.04（1H，d，J= 8.0 Hz，H-4），6.93（1H，d，J = 8.0 Hz，H-3），6.84（1H，s，H-6），5.82（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.62（3H，s，OCH₃），3.20（3H，s，-CH₃），3.11（3H，s，-CH₃）； ¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：165.5，154.4，151.5，141.7，136.5，135.7，135.3，133.3，129.0，124.4，121.9，121.7，118.8，110.9，55.8，37.6；ESI-MS m/z：375.0［M + H］⁺。

（E）-2-甲氧基-4-（3-（（（4-硝基苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）苯基二甲基氨基甲酸（5c）黄色粉末；产率44.8%；mp：168 ~ 169 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.74（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-12），8.45（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-14），8.22（1H，d，J = 8.0 Hz，H-11），8.04（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.83（2H，d，J = 8.0 Hz，H-15），7.45（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-11），7.24（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-4）7.19（1H，s，H-6），7.18（2H，d，J = 8.0 Hz，H-3），6.72（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.91（3H，s，OCH₃），3.15（3H，s，-CH₃），3.04（3H，s，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：165.5，154.4，151.5，143.7，143.5，141.7，136.5，135.3，124.4，124.1，121.9，119.9，118.8，110.9，55.8，37.6；ESI-MS m/z：386.0［M + H］⁺。

（E）-4-（3-（（（2-溴苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基二甲基氨基甲酸酯（5d）白色粉末；产率37.5%；mp：175 ~ 176 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.75（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-11），8.45（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-14），8.04（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.45（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-12），7.25（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-4）7.19（1H，s，H-6），7.18（2H，d，J = 8.0 Hz，H-3），6.72（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.91（3H，s，OCH₃），3.14（3H，s，-CH₃），3.03（3H，s，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：168.0，154.4，151.5，141.7，136.5，136.0，135.3，131.8，127.9，125.6，124.4，121.9，118.8，117.5，110.9，55.8，37.6；ESI-MS m/z：420.9［M + H］⁺。

（E）-4-（3-（（（2-氟苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基二甲基氨基甲酸酯（5e）白色粉末；产率74.1%；mp：174 ~ 175 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.45（1H，t，H-9），7.97（1H，s，H-11），7.59（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.16（1H，d，J = 8.0 Hz，H-12），7.12（1H，d，J = 8.0 Hz，H-14），7.07（1H，d，J = 8.0 Hz，H-13），7.05（2H，s，H-3，6），6.99（1H，s，H-4），6.40（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.80（3H，s，OCH₃），3.15（3H，s，-CH₃），3.04（3H，s，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：168.0，158.3，154.4，151.5，144.4，141.7，136.5，135.3，129.0，124.4，123.2，121.9，118.8，115.7，110.9，55.8，37.6；ESI-MS m/z：359.1［M + H］⁺。

（E）-2-甲氧基-4-（3-氧代-3-（苯基氨基）-1-丙烯基）苯基乙基（甲基）氨基甲酸酯（5f）白色油状；产率64%；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃），δ：8.48（1H，s，H-9），7.65（2H，d，J = 8.0 Hz，H-11，15），7.44（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.32（2H，t，H-12，14），7.08（1H，d，J = 8.0 Hz，H-13），7.04（1H，d，J = 8.0 Hz，H-4），6.94（1H，d，J = 8.0 Hz，H-3）， 6.85（1H，s，H-6），5.93（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.62（3H，s，OCH₃），3.55（2H，q，-CH₂），3.12（3H，d，-CH₃），1.29（3H，t，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：165.5，154.1，151.5，141.7，140.3，136.5，135.3，128.9，128.0，124.4，121.9，121.6，118.8，110.9，55.8，47.5，36.0，12.4；ESI-MS m/z：355.1［M + H］⁺。

（E）-4-（3-（（（2-氟苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基乙基（甲基）氨基甲酸酯（5g）白色油状；产率55.6%；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.43（1H，s，H-9），7.92（1H，d，H-11），7.60（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.16（1H，d，J = 8.0 Hz，H-4），7.12（1H，d，J = 8.0 Hz，H-12），7.07（3H，d，J = 8.0 Hz，H-3，6，14），7.00（1H，d，H-13），6.40（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.80（3H，s，OCH₃），3.55（2H，q，-CH₂），3.12（3H，d，-CH₃），1.25（3H，t，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：168.0，158.3，154.1，151.5，144.4，141.7，136.5，135.3，129.9，129.0，124.4，123.2，121.9，118.8，115.7，110.9，55.8，47.5，36.0，12.4；ESI-MS m/z：373.1［M + H］⁺。

（E）-4-（3-（（（2-溴苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基乙基（甲基）氨基甲酸酯（5h）白色粉末；产率77.4%；mp：141 ~ 142 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.75（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-11），8.45（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-14），8.05（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.45（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-12），7.26（1H，s，H-6，），7.19（2H，s，H-3），6.72（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.91（3H，s，OCH₃），3.46（2H，q，-CH₂），3.15（3H，d，-CH₃），1.25（3H，t， -CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：168.0，154.1，151.5，141.7，136.5，136.0，135.3，131.8，127.9，125.6，124.4，121.9，118.8，117.5，110.9，55.8，47.5，36.0，12.4；ESI-MS m/z：434.1［M + H］⁺。

（E）-4-（3-（（（2-氯苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基乙基（甲基）氨基甲酸酯（5i）白色油状；产率64.2%；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.75（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-11），8.45（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-14），7.72（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.45（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-12），7.26（1H，s，H-4，），7.19（1H，s，H-6），6.53（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.89（3H，s，OCH₃），3.45（2H，dd， -CH₂），3.05（3H，d，-CH₃），1.24（3H，t，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：168.0，154.1，151.5，141.7，136.5，135.3，134.7，131.0，130.1，129.0，125.3，124.4，124.2，118.8，55.8，47.5，36.0，12.4；ESI-MS m/z：389.1［M + H］⁺。

（E）-2-甲氧基-4-（3-（（（4-硝基苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）苯基乙基（甲基）氨基甲酸酯（5j）黄色粉末；产率57.1%；mp：77 ~ 79 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.90（1H，s，H-9），8.22（2H，d，J = 9.2 Hz，H-12，14），8.04（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.84（2H，d，J = 9.2 Hz，H-11，15），7.19（1H，d，J = 8.0 Hz，H-4），7.09（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-6），6.97（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-3），6.73（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.90（3H，s，OCH₃），3.45（2H，q，-CH₂），3.12（3H，t，-CH₃），1.28（3H，t， -CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：165.5，154.1，151.5，143.7，143.5，141.7，136.5，135.3，124.4，124.1，121.9，119.9，110.9，55.8，47.5，36.0，12.4；ESI-MS m/z：398.1［M + H］⁺。

（E）-2-甲氧基-4-（3-氧代-3-（苯基氨基）-1-丙烯基）苯基二乙基氨基甲酸酯（5k）淡黄色固体；产率88%；mp：140 ~ 142 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.41（1H，s，H-9），7.65（2H，d，J = 8.0 Hz，H-11，15），7.45（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.32（2H，t，H-12，14），7.08（1H，d，J = 8.0 Hz，H-13），7.05（1H，d，J = 8.0 Hz，H-4），6.97（1H，d，J = 8.0 Hz，H-3），6.86（1H，s，H-6），5.92（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.63（3H，s，OCH₃），3.50（4H，q，2 × -CH₂），1.30（6H，t，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：165.5，154.8，151.5，141.7，140.3，136.5，135.3，128.9，128.0，124.4，121.9，121.6，118.8，110.9，55.8，45.0，12.7；ESI-MS m/z：369.1［M + H］⁺。

（E）-4-（3-（（（2-氯苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基二乙基氨基甲酸酯（5l）白色粉末；产率51.9%；mp：124 ~ 125 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.74（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-11），8.45（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-14），8.05（1H，d，J = 16.0 Hz，H-7），7.45（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-12），7.23（1H，d，J = 12.0 Hz，H-4），7.19（1H，s，H-6），6.72（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.91（3H，s，OCH₃），3.43（4H，q，2 × -CH₂），1.24（6H，t， -CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：168.0，154.8，151.5，141.7，140.3，136.5，135.3，134.7，131.0，129.0，125.3，124.4，124.2，121.9，118.8，110.9，55.8，45.0，12.7；ESI-MS m/z：403.1［M + H］⁺。

（E）-2-甲氧基-4-（3-（（4-硝基苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）苯基二乙基氨基甲酸酯（5m）黄色粉末；产率42.9%；mp：125 ~ 126 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.74（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-11），8.45（1H，dd，J= 8.0，1.8 Hz，H-14），8.05（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.46（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-12），7.22（1H，d，J = 12 Hz，H-3），7.19（1H，s，H-6），6.72（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.91（3H，s，OCH₃），3.43（4H，q，2 × -CH₂），1.24（6H，t，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：165.5，154.8，151.5，143.7，143.5，141.7，136.5，135.3，124.4，124.1，121.9，119.9，118.8，110.9，55.8，45.0，12.7；ESI-MS m/z：412.1［M + H］⁺。

（E）-4-（3-（（（2-溴苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基二乙基氨基甲酸酯（5n）白色固体；产率58.1%；mp：100 ~ 102 ℃；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.75（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-11），8.45（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-14），8.04（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.45（1H，dd，J = 8.0，1.8 Hz，H-12），7.25（1H，d，H-6，），7.20（2H，d，H-4，13），7.09（1H，d，H-3），6.72（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.90（3H，s，OCH₃），3.43（4H，q，2 × -CH₂），1.25（6H，t，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：168.0，154.8，151.5，141.7，136.5，136.0，135.3，131.8，127.9，125.6，124.4，118.8，117.5，110.9，55.8，45.0，12.7；ESI-MS m/z：448.1［M + H］⁺。

（E）-4-（3-（（（2-氟苯基）氨基）-3-氧代-1-丙烯基）-2-甲氧基苯基二乙基氨基甲酸酯（5o）白色油状；产率50%；¹H NMR（400 MHz，CDCl₃） δ：8.43（1H，s，H-9），7.93（1H，s，H-11），7.60（1H，d，J = 16 Hz，H-7），7.15（1H，d，J = 8.0 Hz，H-6），7.09（1H，d，J = 8.0 Hz，H-12），7.07（2H，d，J = 8.0 Hz，H-3，14），7.01（1H，s，H-13），6.40（1H，d，J = 16 Hz，H-8），3.81（3H，s，OCH₃），3.45（4H，q，2 × -CH₂），1.23（6H，t，-CH₃）；¹³C NMR（100 MHz，CDCl₃） δ：168.0，158.3，154.8，151.5，144.4，141.7，136.5，135.3，129.9，129.0，124.4，118.8，115.7，110.9，55.8，45.0，12.7；ESI-MS m/z：387.1［M + H］⁺。

2.3　抗胆碱酯酶活性测试

采用Ellman法对化合物进行乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性测试，基本原理如下：AChE催化人工合成底物碘化硫代乙酰胆碱水解生成含巯基的化合物，含巯基化合物可与5-5′-二硫代（2-硝基苯甲酸）（DTNB）反应，导致其二硫键断裂而使无色DTNB转变成黄色的5-硫基-2-硝基苯甲酸（TNB）。TNB在波长412 nm左右最大吸收，而DTNB在此处无吸收，因此可通过测定TNB在412 nm处的吸收度来计算巯基化合物的量，其含量与AChE的活力在一定范围内成正比。因此，测定酶反应后于412 nm 处即可测定酶的活力。丁酰胆碱酯酶原理同乙酰胆碱酯酶，底物由碘化硫代乙酰胆碱替换为碘化硫代丁酰胆碱。

乙酰胆碱酯酶抑制活性测试方法如下：将化合物溶解于DMSO中，配制成初浓度为10 mmol/L的母液，用缓冲液B稀释至所需浓度，控制所配制溶液中DMSO含量低于1%。依次在96孔板中加入：PBS 120 μL，AChE（0.1 U/mL，缓冲液A配制） 20 μL和不同浓度的化合物20 μL；37 ℃下孵育6 min，快速加入DTNB 20 μL和ATCI（缓冲液B配制） 20 μL，37 ℃下孵育30 min。在412 nm下测定吸收度。

丁酰胆碱酯酶测试方法类似于乙酰胆碱酯酶，依次在96孔板中加入：PBS 120 μL，BuChE（0.1 U/mL） 20 μL和不同浓度的化合物20 μL；37 ℃下孵育6 min，快速加入DTNB 20 μL和BTCI（缓冲液B配制） 20 μL，37 ℃下孵育30 min。在412 nm下测定吸收度。

3 结果与讨论

本研究以FA为原料，先通过甲酯化对羧基进行保护，在酚羟基一侧引入3种不同的氨基甲酸酯基团后，水解掉甲基，再在FA的酚羟基处引入脂溶性的苯胺，共设计合成15个FA衍生物5a ~ 5o。

对这15个化合物进行乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶活性测试，5a ~ 5o表现出不同程度的胆碱酯酶抑制作用。通过表1可以看出化合物5c、5f、5g、5j、5m 5个化合物表现出了对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，构效关系研究表明，3个对硝基取代苯胺化合物5c、5j、5m均表现出较好的乙酰胆碱酯酶抑制活性，化合物5f的苯胺端未被任何杂原子取代，而化合物5g是对氟取代的苯胺。此外从表1中还可以看出，除化合物5k、5l、5m、5n、5o以外几乎所有化合物均表现出对丁酰胆碱酯酶很好的抑制作用，且化合物5c、5d、5e、5f表现出了远高于阳性药多奈哌齐的抑制率，100 μmol/L浓度下抑制率均高于90%。构效关系研究显示，化合物5k、5l、5m、5n、5o均为N，N-二乙基取代的FA衍生物，而其他有活性的化合物均为N，N-二甲基或N-甲基-N-乙基取代的化合物，进一步说明N，N-二乙基取代的FA衍生物没有丁酰胆碱酯酶抑制活性。综上所述，化合物5c、5f、5j、5g可以作为潜在的乙酰胆碱酯酶和丁酰胆碱酯酶抑制剂。

Table 1 Inhibition of FA derivatives 5a-5o on AChE and BuChE inhibitory activity

Compd.	AChE inhibition/%					AChE IC₅₀/ (μmol/L)	BuChE inhibition /%					BuChE IC₅₀/ (μmol/L)
Compd.	50 μmol/L	25 μmol/L	10 μmol/L	2.5 μmol/L	1.25 μmol/L	AChE IC₅₀/ (μmol/L)	100 μmol/L	50 μmol/L	25 μmol/L	5 μmol/L	1 μmol/L	BuChE IC₅₀/ (μmol/L)
5a	31.07	21.91	19.00	6.01	3.02	>50	63.54	53.56	43.70	22.69	15.19	38.77
5b	32.72	24.47	16.39	13.35	5.54	>50	83.25	72.91	20.42	18.96	2.90	29.41
5c	67.85	46.35	32.98	25.95	0.24	22.43	94.28	93.80	92.22	71.12	44.07	1.26
5d	23.90	13.92	5.23	5.15	0.15	>50	91.81	88.36	86.09	49.50	28.13	3.65
5e	27.81	21.43	10.75	8.97	3.15	>50	91.44	90.55	88.48	74.90	48.33	0.85
5f	61.19	48.98	28.22	9.66	5.80	28.39	90.80	88.00	81.18	63.90	34.90	2.39
5g	64.15	30.80	14.47	6.92	0.46	35.22	75.97	72.24	63.70	35.04	13.79	13.51
5h	20.51	13.60	10.61	7.38	2.24	>50	71.22	61.16	58.84	24.59	4.30	25.73
5i	29.40	24.00	17.61	2.27	4.01	>50	77.61	67.32	57.54	45.22	5.77	17.24
5j	66.78	46.20	41.26	32.02	21.44	18.56	68.34	63.08	49.01	37.64	13.23	21.59
5k	30.80	28.88	16.79	11.62	7.26	>50	47.54	22.78	20.29	11.87	13.90	>100
5l	34.92	22.45	7.30	6.82	1.20	>50	22.85	19.32	17.02	15.93	5.07	>100
5m	64.11	44.34	21.62	21.33	8.66	31.30	17.35	12.32	8.65	3.45	0.40	>100
5n	37.89	13.93	11.66	6.84	5.72	>50	43.23	22.41	18.90	18.60	14.20	>100
5o	19.18	13.57	11.80	9.73	3.85	>50	59.80	29.63	28.24	24.39	9.65	>100
Donepezil	88.71	88.92	88.58	89.72	89.56	<1.00	77.52	73.68	69.12	56.40	20.28	6.99

本研究为FA衍生物的合成提供了理论基础，有关活性化合物的抗AD机制研究正在进行中。

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