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一株藤壶内生真菌的次生代谢产物

- ORCID：
蔡彩虹 ^1,2
- ORCID：
郑浩 ^1,2
- ORCID：
盖翠娟 ^1,2
- ORCID：
戴好富 ^1,2
- ORCID：
梅文莉 ^1,2
- ORCID：
陈惠琴 ^1,2
✉

1. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南省黎药资源天然产物研究与利用重点实验室，海口 571101； 2. 海南热带农业资源研究院，海口 571101

中图分类号： R284

最近更新：2023-03-13

DOI：10.11665/j.issn.1000-5048.20220531001

摘要

采用硅胶、Sephadex LH-20、C₁₈反相硅胶和重结晶等分离技术从藤壶内生真菌Aspergillus sp.Dq-25的大米固体发酵产物的乙酸乙酯提取物中分离得到6个化合物，并通过理化性质和波谱学方法对单体化合物进行结构鉴定，分别为：demethyldihydropenicillic acid（1）、dihydropenicillic acid（2）、penicillic acid（3）、fortisterol（4）、22E，24R-3P，5a-dihydroxyerogosta-7，22-diene-6-one（5）和（22E，24R）-麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，9α-三醇-6-酮（6）。其中化合物1为一新的丁内酯类化合物。通过MTT法测试化合物的细胞毒活性，结果显示化合物3对人慢性髓原白血病细胞K562、人宫颈癌细胞HeLa、人胃癌细胞SGC-7901、人肺癌细胞A549和人肝癌细胞BEL-7402均有一定的抑制作用，其IC₅₀范围为38.0 ~ 105.0 μmol/L。

关键词

藤壶; 内生真菌; Aspergillus sp.; γ-丁内酯; 化学成分; 分离鉴定; 细胞毒

海洋微生物为适应海洋独特的高湿、高压、高盐的环境产生了不同于陆地微生物的代谢途径和防御体系，使其成为产生大量结构新颖活性化合物的重要来源^［

1-2］。藤壶是附着在海水中固定或浮动硬物上的甲壳动物，靠过滤海水中的有机物生存，由于特殊的生理特征，在通过长期的自然选择进化，与体内的微生物已经达成了合作关系。由于环境和宿主共生的相互作用，海洋微生物的沉默基因被激活从而能够产生结构特殊、活性显著的次生代谢产物^{［参考文献 3

百度学术}3］。近年来从海洋动物内生真菌中发现了数量相当的具有抗肿瘤^{［参考文献 4

百度学术}4］、抗菌^{［参考文献 5

百度学术}5］、抗炎^{［参考文献 6

百度学术}6］等活性的新颖结构，已成为活性天然产物的重要来源之一。

前期研究发现藤壶内生真菌Aspergillus sp. Dq-25的大米固体发酵产物具有较好的抗肿瘤活性，而目前对于藤壶内生真菌的报道尚不多见，故本研究开展了对该菌株大米固体发酵产物乙酸乙酯提取物的化学成分研究，从中共分离得到了6个化合物，其中包括3个丁内酯类化合物demethyldihydropenicillic acid（1）、dihydropenicillic acid（2）、penicillic acid（3），和3个甾体类化合物fortisterol（4）、22E，24R-3P，5a-dihydroxyerogosta-7，22-diene-6-one（5）和（22E， 24R）-麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，9α-三醇-6-酮（6）（图1）。其中化合物1是新化合物。对化合物1 ~ 3进行细胞毒活性筛选，结果发现化合物3对多种肿瘤细胞株均有一定的生长抑制作用，包括K562、HeLa、SGC-7901、A549和BEL-7402，其IC₅₀为38.0 ~ 105.0 μmol/L。

Figure 1 Structures of compounds 1-6 from Aspergillus sp. Dq-25

1 材料

1.1　试剂

Sephadex LH-20（德国Sigma-Aldrich公司）；C₁₈反相硅胶（日本Fuji公司）；柱色谱硅胶G（200～300、60～80目）、薄层色谱硅胶H（青岛海洋化工厂）；顺铂（德国Sigma-Aldrich公司）；MTT（北京索莱宝科技有限公司）；氘代试剂（天津市科密欧有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2　仪器

Compact质谱仪，Avance III 500核磁共振波谱仪（TMS为内标）（德国Bruker公司）；Autopol Ⅲ旋光仪（美国Rudolph公司）；J-815圆二色谱仪（日本Jasco公司）；SB-1100旋转蒸发仪（日本Eyela公司）； 1260分析型HPLC，配置1260 Infinity Ⅱ四元泵和Agilent DAD G1315D检测器（美国Agilent公司）；SUMMIT p680A半制备型HPLC，配置P680A四元泵和PDA-100紫外/可见二级管阵列检测器（美国Dionex公司）；分析性和半制备型C₁₈色谱柱（日本Nacalai Tesque公司）；Multiskan FC酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；BSA224S万分之一天平（北京赛多利斯天平有限公司）。

1.3　菌株和细胞株

本实验菌株Aspergillus sp. Dq-25于2018年8月从三沙采集的藤壶中分离获得，现保藏于中国热带农业科学院热带生物技术研究所，标本编号为20180825Dq-25。

细胞株人慢性髓原白血病细胞K562、人宫颈癌细胞HeLa、人胃癌细胞SGC-7901、人肺癌细胞A549和人肝癌细胞BEL-7402均购自中国科学院细胞库。

2 方法

2.1　菌株发酵

菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基中活化后，接种到装有PDA液体培养基的三角瓶中，置于28 ℃、200 r/min的摇床中振荡培养2 d作为种子液。1 L三角瓶中装入大米100.0 g、NaCl 3.3 g和水110 mL，在121 ℃条件下灭菌20 min，放凉至室温后，每瓶接入种子液10 mL，室温下静置培养30 d。

2.2　提取和分离

菌株发酵结束后，用乙酸乙酯提取3遍，回收合并乙酸乙酯相，减压浓缩，获得乙酸乙酯提取物132.6 g。

将提取物经过减压硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（100∶1→1∶1）和二氯甲烷-甲醇（50∶1→0∶1）梯度洗脱，得到15个流份（Fr.1 ~ Fr.15）。Fr.6［1.5 g，石油醚-乙酸乙酯（2∶1）洗脱流份］经过C₁₈反相硅胶柱色谱，以甲醇-水（4∶1→1∶0）为流动相洗脱得到8个流份（Fr.6.1 ~ Fr.6.8），其中Fr.6.3［833.5 mg，甲醇-水（3∶1）洗脱流份］）经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（100∶1→1∶1）为流动相）得到7个流份（Fr.6.3.1 ~ Fr.6.3.7），Fr.6.3.1［113.6 mg，石油醚-乙酸乙酯（100∶1）洗脱流份］再经硅胶柱色谱，以石油醚-丙酮（100∶1→30∶1）为流动相，分离纯化得到化合物5（1.3 mg）。Fr.6.4［940.8 mg，甲醇-水（3∶1）洗脱流份］经Sephadex LH-20柱色谱，以氯仿-甲醇（1∶1）为流动相，分离得到12个流份，Fr.6.4.4（97.4 mg）经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（30∶1→ 10∶1）为流动相，梯度洗脱得到化合物6（19.0 mg）。

Fr.8［3.2 g，石油醚-乙酸乙酯（1∶1）洗脱流份］经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇为流动相）分离得到10个流份（Fr.8.1 ~ Fr.8.10）。其中，Fr.8.4经重结晶（甲醇）纯化获得白色晶体即化合物3（420.6 mg）。Fr.8.2（763.5 mg）经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（80∶1→10∶1）梯度洗脱，得到10个流份（Fr.8.2.1 ~ Fr.8.2.10）。化合物2（20.9 mg）由流份Fr.8.2.3［87.7 mg，石油醚-乙酸乙酯（60∶1）洗脱流份］经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（60∶1→1∶1）梯度洗脱纯化后得到。Fr.8.3（258.8 mg）经硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯（80∶1→10∶1）梯度洗脱得到8个流份，Fr.8.3.5［98.8 mg，石油醚-乙酸乙酯（40∶1）洗脱流份］经反复硅胶柱色谱，分别以二氯甲烷-丙酮（200∶1）和石油醚-二氯甲烷-异丙醇（7∶5∶0.4）为流动相，得到化合物1（1.2 mg）。

Fr.9［1.8 g，石油醚-乙酸乙酯（1∶1）洗脱流份］经Sephadex LH-20柱色谱（甲醇为流动相）分离得到14个流份（Fr.9.1 ~ Fr.9.14）。Fr.9.2（392.5 mg）用硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯（80∶1→10∶1）梯度洗脱，得到10个流份（Fr.9.2.1 ~ Fr.9.2.10）。Fr.9.2.1［78.3 mg，石油醚-乙酸乙酯（80∶1）洗脱流份］经反复硅胶柱色谱，分别以二氯甲烷-丙酮（200∶1）和石油醚-二氯甲烷-异丙醇（7∶5∶0.4）为流动相，得到化合物4（1.4 mg）。

2.3　细胞毒活性测试

采用MTT法^［

7］对分离得到的化合物进行细胞毒活性测试。细胞株包括：人慢性髓原白血病细胞K562、人宫颈癌细胞HeLa、人胃癌细胞SGC-7901、人肺癌细胞A549和人肝癌细胞BEL-7402。供试细胞均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。

3 结果与分析

3.1　菌株鉴定

菌株ITS序列与BLAST数据库进行同源比对鉴定该菌株Dq-25为真菌Aspergillus sp.。将ITS序列提交GenBank，获得编录号：ON357962。

3.2　结构鉴定

化合物1 无色结晶； ${[α]}_{D}^{25}$ + 25.6（c 0.1，MeOH）；HR-ESI-MS m/z 181.049 1［M + Na］⁺ （Calcd.for C₇H₉O₄Na，181.047 1），确定其分子式为C₇H₉O₄，不饱和度为3。¹³C NMR和DEPT（CD₃OD，125 MHz）谱图（表1）共显示出7个碳信号，结合¹H NMR（CD₃OD，500 MHz）谱图（表1）和HSQC谱图分析发现，结构中具有1个甲基信号［δ_C7.54/δ_H 0.88（3H，t，J = 7.5 Hz，H-6）］、1个甲氧基信号［δ_C60.4/ δ_H 3.93（3H，s，OCH₃）］、1个亚甲基信号［δ_C29.9/ δ_H 1.94（1H，dq，J = 15.0，7.4 Hz，H-5α），δ_H 1.86（1H，dq，J = 14.7，7.4 Hz，H-5β）］、1个季碳信号［δ_C105.8（C-4）］、1组三取代双键信号［δ_C181.7（C-3）； δ_C 89.9/ δ_H 5.22（1H，s，H-2）］和1个羰基信号［δ_C173.2（C-1）］。将化合物1的波谱数据与已知丁内酯类化合物dihydropenicillic acid^［

8-9］对照，两者的信号非常相似，主要区别在于该化合物中少了1个甲基信号和1个次甲基信号，多了1个亚甲基信号［δ_C29.9/ δ_H 1.94（1H，dq，J = 15.0，7.5 Hz，H-5α）； δ_H 1.86（1H，dq，J = 14.7，7.5 Hz，H-5β）］，并且甲基峰由原来的双峰变为三重峰［δ_C7.54/ δ_H 0.88（3H，t，J = 7.5 Hz，H-6）］。提示化合物1为已知化合物dihydropenicillic acid 4位的异丙基被乙基所替代的衍生物。在HMBC谱中（图2）观察到甲基信号δ_H 0.88（H₃-6）与δ_C105.8（C-4）和δ_C29.9（C-5）有相关信号，δ_H 1.94（H-5α）和δ_H 1.86（H-5β）与δ_C181.7（C-3）、δ_C105.8（C-4）和δ_C7.54（C-6）有相关信号，δ_H 5.22（H-2）与δ_C173.2（C-1）和δ_C105.8（C-4）有相关信号，甲氧基δ_H 3.93（OCH₃）与δ_C181.7（C-3）有相关信号，结合¹H-¹H COSY中δ_H 1.94（H-5α）和δ_H 1.86（H-5β）与δ_H 0.88（H₃-6）有相关信号，证明该化合物与已知化合物比较少了1个甲基，结构如图2。

Table 1 ¹H and ¹³C NMR spectroscopic data of compound 1 (CD₃OD,MHz 500/125 MHz)

No.	δ_C	δ_H
1	173.2	-
2	89.9	5.22(1H,s)
3	181.7	-
4	105.8	-
5	29.9	1.94(1H, dq, J = 15.0, 7.5 Hz) 1.86(1H, dq, J = 14.7, 7.5 Hz)
6	7.54	0.88(3H, t, J = 7.5 Hz)
OCH₃	60.4	3.93(3H, s)

Figure 2 Key HMBC and ¹H-¹H COSY correlations of compound 1

根据测试CD数据在210 nm出现正的Cotton效应（Δε = 1.46，c = 6.4×10^-3 mol/L），与5，6-dihydro-6-hydroxypenicillic acid^［

5］一致，故推断4位的绝对构型为S。综上所述，化合物1的结构鉴定为demethyldihydropenicillic acid，经查阅文献，该化合物为一新化合物。

化合物2 无色结晶（CH₃OH）；ESI-MS m/z 195.3［M + Na］⁺； ¹H NMR（CD₃OD，500 MHz） δ_H： 5.20（1H，s，H-2），3.92（3H，s，H-OCH₃），2.12（1H，m，H-5），1.04（3H，d，J = 6.8，H-6），0.88（3H，d，J = 6.9，H-7）；¹³C NMR（CD₃OD，125 MHz） δ_C：173.5（C-1），90.0（C-2），182.2（C-3），107.2（C-4），34.7（C-5），16.1（C-6），16.8（C-7），60.3（C-OCH₃）。以上数据与文献［

8-9］报道基本一致，故鉴定化合物2为dihydropenicillic acid。

化合物3 无色结晶（CH₃OH）；ESI-MS m/z 193.2［M + Na］⁺；¹H NMR（CD₃OD，500 MHz） δ_H：5.39（1H，s，H-6a），5.27（1H，s，H-2），5.14（1H，s，H-6b），3.92（3H，s，H-OCH₃），1.74（3H，s，C-7）；¹³C NMR（CDOD₃，125 MHz） δ_C：173.3（C-1），89.9（C-2），181.8（C-3），104.6（C-4），141.6（C-5），116.1（C-6），17.6（C-7），60.6（C-OCH₃）。以上数据与文献［

8-9］报道基本一致，故鉴定化合物3为penicillic acid。

化合物4 无色晶体（CH₃OH）；ESI-MS m/z 425.1［M + H］⁺；¹H NMR（DMSO-d₆，500 MHz） δ_H：5.65（1H，s，H-4），5.57（1H，s，H-7），5.25（1H，dd，J = 15.3，7.5 Hz，H-23），5.16（1H，dd，J = 15.3，8.3 Hz，H-22），2.82（1H，m，H-9），2.69（1H，ddd，J = 18.5，14.7，5.0 Hz，H-2a），2.31（1H，dd，J = 12.0，6.4 Hz，H-14），2.14 ~ 2.24（2H，m，H-1a，2b），2.02（1H，m，H-20），1.94（1H，m，H-12a），1.91 ~ 1.83（2H，m，H-1b，15a，24），1.64 ~ 1.72（1H，m，H-16a），1.43 ~ 1.56（4H，m，H-11a，12b，15b，25），1.34 ~ 1.40（2H，m，H-11b，17），1.20 ~ 1.31（1H，m，H-16b），1.10（3H，s，H-19），1.00（3H，d，J = 6.6 Hz，H-21），0.88（3H，d，J = 6.8 Hz，H-28），0.81（3H，d，J = 7.0 Hz，H-26），0.79（3H，d，J = 7.0 Hz，H-27），0.57（3H，s，H-18）；¹³C NMR（DMSO-d₆，500 MHz） δ_C：33.4（C-1），32.9（C-2），198.4（C-3），113.8（C-4），173.6（C-5），161.9（C-6），111.8（C-7），161.1（C-8），46.0（C-9），39.9（C-10），21.9（C-11），37.9（C-12），46.7（C-13），56.7（C-14），24.9（C-15），27.5（C-16），56.3（C-17），12.1（C-18），19.4（C-19），39.7（C-20），20.9（C-21），135.0（C-22），131.8（C-23），42.0（C-24），32.5（C-25），19.4（C-26），19.8（C-27），17.3（C-28）。以上数据与文献报道基本一致^［

10］，故鉴定化合物4为fortisterol。

化合物5 白色固体（CH₃OH）；ESI-MS m/z 451.3［M + Na］⁺；¹H NMR（actone-d₆，500 MHz） δ_H：5.47（1H，br s，H-7），5.29（1H，dd，J = 15.3，7.4 Hz，H-23），5.23（2H，dd，J = 15.3，8.1 Hz，H-22），3.95（1H，m，H-3），2.60（1H，m，H-9），2.06 ~ 2.19（4H，m，H-4a，12a，14，20），1.88（1H，m，H-24），1.72 ~ 1.84（4H，m，H-1a，1b，11a，16a），1.55 ~ 1.68（4H，m，H-2a，4b，11b，15a），1.45 ~ 1.53（3H，m，H-12b，15b，25），1.36 ~ 1.43（3H，m，H-2b，16b，17），1.06（3H，d，J = 6.6 Hz，H-21），0.94（3H，d，J = 6.8 Hz，H-28），0.91（3H，s，H-19），0.86（3H，d，J = 6.9 Hz，H-26），0.84（3H，d，J = 6.9 Hz，H-27），0.65（3H，s，H-18）；¹³C NMR（actone-d₆，125 MHz） δ_C：31.5（C-1），31.3（C-2），67.1（C-3），37.1（C-4），77.7（C-5），198.9（C-6），120.5（C-7），164.0（C-8），44.6（C-9），41.2（C-10），22.5（C-11），39.7（C-12），45.2（C-13），56.2（C-14），23.2（C-15），28.7（C-16），56.8（C-17），12.9（C-18），16.6（C-19），41.2（C-20），21.5（C-21），136.3（C-22），133.0（C-23），43.7（C-24），33.8（C-25），20.3（C-26），20.0（C-27），18.0（C-28）。以上数据与文献报道基本一致^［

11］，故鉴定化合物5为22E，24R-3P，5a-dihydroxyerogosta-7，22-diene-6-one。

化合物6 白色粉末（CH₃OH）；ESI-MS m/z 445.3［M + H］⁺；¹H NMR（CD₃OD，500 MHz） δ_H：5.58（1H，d，J = 2.0 Hz，H-7），5.21（1H，dd，J = 15.3，7.5 Hz，H-23），5.14（1H，dd，J = 15.3，8.1 Hz，H-22），3.93（1H，m，H-3），2.72（1H，ddd，J = 11.9，6.8，2.1 Hz，H-14），2.28（1H，td，J = 13.9，4.00 Hz，H-1a），1.98 ~ 2.04（2H，m，H-4a，20），1.77 ~ 1.93（5H，m，H-2a，11a，11b，12a，16a，24），1.71（1H，m，H-12b），1.63（1H，dd，J = 14.1，11.5 Hz，H-4b），1.58（1H，m，H-15a），1.38 ~ 1.50（5H，m，H-1b，2b，15b，17，25），1.33（1H，m，H-16b），1.00（3H，d，J = 6.6 Hz，H-21），0.96（3H，s，H-19），0.89（3H，d，J = 6.8 Hz，H-28），0.81（3H，d，J = 6.7 Hz，H-26），0.80（3H，d，J = 6.7 Hz，H-27），0.60（3H，s，H-18）；¹³C NMR（CD₃OD，125 MHz） δ_C：26.0（C-1），30.1（C-2），67.1（C-3），36.4（C-4），79.5（C-5），199.8（C-6），120.3（C-7），164.8（C-8），75.4（C-9） 42.1（C-10），28.8（C-11），35.8（C-12），45.6（C-13），52.2（C-14），22.9（C-15），28.4（C-16），56.6（C-17），12.6（C-18），20.4（C-19），40.8（C-20），21.4（C-21），135.7（C-22），133.0（C-23），43.4（C-24），33.6（C-25），20.2（C-26），19.9（C-27），17.9（C-28）。以上数据与文献［

12］报道基本一致，故鉴定化合物6为（22E，24R）-麦角甾-7，22-二烯-3β，5α，9α-三醇-6-酮。

3.3　细胞毒活性筛选结果

对分离得到的化合物1 ~ 3进行细胞毒活性筛选，发现化合物3对K562、HeLa、SGC-7901、A549和BEL-7402均有一定的抑制作用，结果表2所示。

Table 2 Cytotoxicity of compound 3 (

\bar{x} \pm s, n = 3

)

Compd.	IC₅₀/(μmol/L)
Compd.	K562	HeLa	SGC-7901	A549	BEL-7402
3	38.78 ± 0.11	104.77 ± 0.36	45.78 ± 0.55	56.01 ± 0.36	65.56 ± 0.55
Cisplatin	3.08 ± 0.05	4.02 ± 0.06	4.11 ± 0.02	1.93 ± 0.02	4.02 ± 0.06
Taxol	1.04 ± 0.13	1.02 ± 0.09	1.44 ± 0.48	3.81 ± 0.26	0.76 ± 0.04

4 讨论

本研究从藤壶内生真菌Aspergillus sp.Dq-25中共分离得到了6个化合物，包括3个丁内酯类化合物和3个甾体类化合物，其中化合物1为新化合物。通过细胞毒活性筛选发现丁内酯类化合物3具有一定的细胞毒活性，但1和2未筛选到活性。通过结构对比，发现区别仅在于4位链接的脂肪链，推测可能脂肪链上的双键对该类化合物的细胞毒活性具有一定的促进作用，但还需更多实验进行验证。丁内酯类化合物是具有五元不饱和内酯环，具有广泛的生物活性，包括抗菌^［

13］、抗肿瘤^{［参考文献 14

百度学术}14］和抗病毒^{［参考文献 15

百度学术}15］等，是天然产物中一类重要的次生代谢产物，也是药物研发的热点关注结构之一^{［参考文献 16

百度学术}16］。本研究为丁内酯类化合物的进一步开发利用提供了科学参考。

本研究中尚未对甾体类化合物4 ~ 6进行细胞毒活性筛选，但文献报道化合物5和6均有细胞毒活性^［

11-12］，所以该菌株代谢产物中的细胞毒活性成分的化学结构具有多样性，后续有必要对不同类型结构进行深入研究。

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一株藤壶内生真菌的次生代谢产物

摘要

关键词

1 材 料

1.1 试 剂

1.2 仪 器

1.3 菌株和细胞株

2 方 法

2.1 菌株发酵

2.2 提取和分离

2.3 细胞毒活性测试