摘要
以葡萄糖基-β-环糊精（Glu-β-CD）作为手性选择剂，N-丁基-N-甲基吡咯烷十二烷基硫酸盐（［C4MP］［C12SO4］）离子液体表面活性剂形成胶束作为准固定相，在低pH条件下构建胶束电动毛细管色谱（MEKC）用于4种酸性药物萘普生、华法令、酮洛芬和布洛芬的手性拆分。在相同条件下，与基于传统表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）的MEKC体系相比，［C4MP］［C12SO4］体系能大大提高药物的分离度，且使得一些原本不能拆分的药物得到部分分离。本研究考察了有机溶剂种类和比例、运行缓冲溶液浓度与pH、手性选择剂浓度、离子液体表面活性剂浓度、运行电压等影响手性拆分的因素，探索了离子液体表面活性剂在MEKC体系中的分离潜能，为手性药物的分离提供参考。
手性药物的对映异构体往往表现出不同的生物活性和不良反应，部分对映异构体对人体及环境伤害巨大。自“反应停”等诸多重大事件后，关于手性药物毒副作用的认识及高效简便的识别检测技术已成为药物分析专业领域研究及教学的重要内
在MEKC模式下，溶质不仅可以因为表观淌度差异而分离，还可以基于在水相和在电场中的胶束相之间的分配系数不同而被分离，从而使在毛细管区带电泳（CZE）模式下不能被分离的中性分子得到分离。因此，MEKC的分离能力很大程度上依赖于形成胶束的表面活性剂的结
离子液体是一类在室温附近或低于100 ℃呈现液态状态的盐类的统称，具有较低的熔点、可忽略的蒸汽压、高的热稳定性、良好的溶解性和环境友好等特点，被广泛应用于多个领
本研究依据文献［
Figure 1 Stucture of [C4MP][C12SO4]
Figure 2 Chemical structure of naproxen,warfarin,ketoprofen and ibuprofen
N-丁基-N-甲基吡咯烷氯盐（［C4MP］Cl，上海成捷化学有限公司）；Glu-β-CD（≥ 98%，山东淄博千汇精细化工有限公司）；萘普生和华法令（四川西亚试剂有限公司）；酮洛芬和布洛芬（美国Sigma-Aldrich公司）。所有的手性药物都是消旋体混合物。甲醇、乙醇、乙腈和异丙醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司）；磷酸二氢钠（≥ 99.0%）、磷酸（上海凌峰化学试剂有限公司）；实验用水为二次蒸馏水。
未涂层石英毛细管柱（33 cm × 50 μm，有效长度24.5 cm）。运行缓冲液为pH 3.0（萘普生、华法令、酮洛芬）、pH 3.3（布洛芬）的50 mmol/L磷酸盐（含30 mmol/L Glu-β-CD、40 mmol/L ［C4MP］［C12SO4］和20%甲醇）；运行电压：-15 kV或-20 kV；检测波长：萘普生（235 nm）、华法林（210 nm）、酮洛芬和布洛芬（225 nm）；压力进样，30 mbar（1 bar = 6.895 kPa），4 s；运行温度，25 ℃。
缓冲盐溶液为50 mmol/L磷酸缓冲盐（含有一定量的有机溶剂）。运行缓冲盐全部当时配制，将Glu-β-CD和阴离子型表面活性剂溶于包含有机溶剂的缓冲盐溶液（特定pH）中，用极少量的10%磷酸溶液调节至所需的pH。
［C4MP］［C12SO4］作为一种新型离子液体表面活性剂，在298 K下的水溶液中的临界胶束浓度（CMC）为2.7 mmol/L，同条件下SDS的CMC为8.1 mmol/L。［C4MP］［C12SO4］拥有优越的表面活性，且由于其阳离子为吡咯烷阳离子，紫外吸收极弱，作为背景添加剂，对样品干扰少，基线平稳。本研究使用的表面活性剂浓度均在其CMC以上。
实验中首先考察了CZE模式和MEKC模式下，Glu-β-CD手性选择剂对4种酸性药物（萘普生、华法令、酮洛芬和布洛芬）的拆分效果。结果表明，在低pH条件的CZE下，酸性药物均不带电，中性环糊精不能实现对4种药物的手性分离；当缓冲液pH大于药物的pKa时，萘普生和华法令可实现部分分离，酮洛芬和布洛芬不能被分离。因此，本研究建立低pH条件下的MEKC体系，低pH条件下，酸性药物呈电中性，药物根据其在含环糊精的缓冲液相中和胶束相中的分配不同而实现分离，环糊精对手性药物的识别效果较好。如采用正电压模式，由于胶束带负电向正极迁移，样品不能出峰，而采用反向电压，样品在带负电的胶束带动下出峰。因此采用负电压模式构建CD-MEKC分离体系。
在MEKC模式下，分别采用SDS和［C4MP］［C12SO4］作为表面活性剂，其中基于SDS的体系除了可对萘普生实现分离，其余药物无法分离，而基于［C4MP］［C12SO4］的体系能大大提高萘普生的分离结果，而对华法令、酮洛芬和布洛芬均可实现部分分离，MEKC体系电泳对比如
Figure 3 Typical electropherograms of micellar electrokinetic chromatography （MEKC） systems based on SDS and [C4MP] [C12SO4]
Conditions: fused-silica capillary, 33 cm (24.5 cm effective length) × 50 µm; 50 mmol/L phosphate buffer (20% of methanol included) containing 30 mmol/L Glu-β-CD and (a) 40 mmol/L SDS; (b) 40 mmol/L [C4MP][C12SO4]; (A) and (B) pH 3.0, applied voltage -15 kV; (C) pH 3.0, applied voltage -20 kV and (D) pH 3.3,applied voltage -20 kV; capillary temperature, 25 °C
由电泳图谱可看出，基于［C4MP］［C12SO4］的CD-MEKC体系相比于基于SDS的体系，对萘普生的分离效果大大改善，其中选择性因子（α）从1.14提高到1.20，分离度从2.05提高到6.75；对华法令、酮洛芬和布洛芬则从不能分离到部分分离。这可能是由于［C4MP］［C12SO4］和SDS在水相中的聚集行为以及胶束排列都有所不同，有研究表明［C4MP］［C12SO4］具有比传统表面活性剂SDS更优的胶束特
本研究重点考察了甲醇、乙醇、乙腈和异丙醇这4种有机溶剂对酸性药物分离的影响。在不添加有机溶剂或有机溶剂比例在低于20%时，手性药物在长分析时间（大于60 min）内不能出峰。固定比例为20%，4种有机溶剂中，甲醇为更适合该CD-MEKC体系的有机溶剂。进一步考察甲醇的比例对分离的影响，发现甲醇比例增大后，手性药物的迁移时间均大大延长，而分离度也呈现下降的趋势，可能是因为迁移时间较长，分离效率下降，峰展宽导致分离结果变差。因此，选择20%甲醇作为该系统的有机溶剂。
通常，缓冲盐种类及浓度会影响缓冲液离子强度、电渗流大小及溶质在毛细管壁的吸附等。当缓冲系统浓度增加时，离子强度增大，会使电渗流减小，有利于减少溶质和管壁的相互作用，改善分离；但浓度过大则会使电流过大，焦尔热影响更为严重，峰展宽进而不利于分离。
选择在低pH范围内有较好缓冲能力的磷酸盐作为缓冲体系，考察了不同磷酸盐浓度（30、50和70 mmol/L）对药物手性分离的影响。结果发现，随着磷酸盐浓度从30 mmol/L增至50 mmol/L药物的分离得到改善；而当磷酸盐浓度由50 mmol/L进一步增至70 mmol/L时，电流较大，峰展宽，药物的分离度呈下降趋势。因此，选择50 mmol/L的磷酸盐作为CD-MEKC拆分的缓冲盐体系。
在50 mmol/L的磷酸盐（包含体积分数20% 的甲醇）缓冲溶液中加入30 mmol/L Glu-β-CD并在40 mmol/L ［C4MP］［C12SO4］条件下，考察了不同缓冲溶液pH（2.7、3.0、3.3、3.6和3.9）对手性药物分离的影响，结果见
| pH | Naproxen | Warfarin | Ketoprofen | Ibuprofen | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| tR2/tR1 | Rs | α | tR2/tR1 | Rs | α | tR2/tR1 | Rs | α | tR2/tR1 | Rs | α | |
| 2.7 | 28.733/24.832 | 6.31 | 1.16 | 17.096/16.729 | 0.57 | 1.02 | 14.805 | 0.00 | 1.00 | 15.911/15.634 | 0.44 | 1.02 |
| 3.0 | 34.616/28.873 | 6.75 | 1.20 | 16.639/16.295 | 0.72 | 1.02 | 14.345/14.092 | 0.58 | 1.02 | 18.370/17.931 | 0.43 | 1.02 |
| 3.3 | 34.979/29.39 | 6.52 | 1.19 | 18.250/17.792 | 0.55 | 1.03 | 19.415/19.411 | < 0.40 | 1.01 | 23.449/22.871 | 0.53 | 1.03 |
| 3.6 | 37.278/31.24 | 5.99 | 1.19 | 18.933/18.599 | 0.57 | 1.02 | 22.825/22.417 | 0.51 | 1.02 | 23.394/22.770 | 0.45 | 1.03 |
| 3.9 | > 60 min | - | - | 29.971/29.966 | < 0.40 | 1.01 | 34.248/34.240 | < 0.40 | 1.01 | 39.889/38.625 | 0.40 | 1.03 |
Conditions:50 mmol/L phosphate buffer (20% of methanol included) containing 30 mmol/L Glu-β-CD and 40 mmol/L [C4MP][C12SO4]; other conditions as in Figure 3 Rs: Resolution; α: Selectivity factor; -: No separation
本研究采用Glu-β-CD作为手性选择剂建立基于离子液体表面活性剂的CD-MEKC手性分离体系，为考察环糊精浓度对手性分离的影响，设定其浓度范围为10 ~ 40 mmol/L。考察结果如
| c(Glu-β-CD)/（mmol/L） | Naproxen | Warfarin | Ketoprofen | Ibuprofen | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| tR2/tR1 | Rs | α | tR2/tR1 | Rs | α | tR2/tR1 | Rs | α | tR2/tR1 | Rs | α | |
| 10 | 14.516/13.989 | 1.12 | 1.04 | 13.268 | 0.00 | 1.00 | 12.999 | 0.00 | 1.00 | 9.712 | 0.00 | 1.00 |
| 20 | 18.463/17.015 | 2.87 | 1.09 | 15.192/15.183 | < 0.40 | 1.01 | 13.221/13.214 | < 0.40 | 1.01 | 15.046/14.830 | < 0.40 | 1.01 |
| 30 | 34.616/28.873 | 6.75 | 1.20 | 16.639/16.295 | 0.72 | 1.02 | 14.345/14.092 | 0.58 | 1.02 | 23.449/22.871 | 0.53 | 1.03 |
| 40 | > 60 min | - | - | > 60 min | - | - | > 60 min | - | - | > 60 min | - | - |
Conditions:50 mmol/L phosphate buffer with 20% methanol containing 10-40 mmol/L Glu-β-CD and 40 mmol/L [C4MP][C12SO4]; other conditions as in Figure 3
当环糊精浓度在10 mmol/L时，除了萘普生有部分分离外，其余手性药物均不能实现分离，说明环糊精浓度过低时不能充分发挥其手性识别能力。当环糊精浓度增大时，可以看出药物的迁移时间延长，分离度和选择性因子（α）提高。而当Glu-β-CD浓度增大至40 mmol/L时，手性药物在60 min内均未出峰，可能是由于此时缓冲溶液黏度升高，药物在环糊精中的分配增加，在胶束相中的分配减小，胶束不足以将药物较快带至出口端。考虑到分离度和α达到最佳时，选择30 mmol/L作为该体系的Glu-β-CD浓度。
因为华法令、酮洛芬和布洛芬的分离度在较低的水平，故选择萘普生这一手性药物考察离子液体表面活性剂［C4MP］［C12SO4］的浓度，考察范围为35 ~ 60 mmol/L，实验结果见
| c([C4MP][C12SO4])/(mmol/L) | Naproxen | |||
|---|---|---|---|---|
| tR1/min | tR2/min | Rs | α | |
| 35 | > 60 | - | - | |
| 40 | 28.873 | 34.616 | 6.75 | 1.20 |
| 45 | 24.717 | 30.895 | 4.00 | 1.25 |
| 50 | 22.075 | 26.088 | 3.23 | 1.18 |
| 55 | 43.139 | 48.534 | 2.60 | 1.13 |
| 60 | > 60 | - | - | |
Conditions:50 mmol/L phosphate buffer with 20% methanol containing 30 mmol/L Glu-β-CD and 35-60 mmol/L [C4MP][C12SO4]; pH 3.0,applied voltage -15 kV; other conditions as in Figure 3
在考察的浓度范围内，当离子液体［C4MP］［C12SO4］浓度低于40 mmol/L时，萘普生样品峰在较长分析时间内仍未可见。推测可能是因为形成的胶束相浓度太低，在负压模式下胶束无法快速地将萘普生带至检测端。随着［C4MP］［C12SO4］浓度升至40 mmol/L时，样品能够出峰，且分离效果极佳。当浓度进一步增大到45 ~ 50 mmol/L，萘普生迁移时间在逐渐缩短，分离度也在降低，可能是因为胶束浓度增大，反而对对映体的区分作用减弱导致的。随着离子液体浓度上升至55 ~ 60 mmol/L，样品的迁移时间突然大大延长，可能是由于阳离子浓度也在增大，使得对毛细管壁的吸附增强，对电渗流产生影响所致。另外则可能是阳离子大量存在中和了负电性胶束表面部分负电荷使胶束粒子表面电荷密度变小，胶束粒子变大，从而影响了胶束相的迁移速度。
本工作合成了阴离子型离子液体表面活性剂［C4MP］［C12SO4］，并将其与中性手性选择剂Glu-β-CD用于胶束电动毛细管色谱手性分离体系的构建，首次在低pH条件下分离4种酸性药物（萘普生、华法令、酮洛芬和布洛芬）。相比于同条件下的SDS体系，基于［C4MP］［C12SO4］的MEKC体系大大提高了萘普生的分离效果，并使其余3种在SDS体系中无法分离的药物实现部分分离。这一研究扩展了Glu-β-CD在CE手性拆分中的应用范围，探索了离子液体表面活性剂在MEKC体系中的分离潜力。同时本团队以文章内容设计“药学拔尖学生培养计划”示教实验，结合健康中国战略，阐述了手性药物研发风险及最新研究进展。
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