摘要
评价盐酸二甲双胍缓释片受试制剂和参比制剂在健康受试者餐后单次给药条件下的生物等效性和安全性。试验采用单中心、随机、开放、单剂量、两周期、两序列、双交叉设计，32例健康受试者在餐后状态下单次服用受试制剂或参比制剂0.5 g，在给药前（0 h）至给药后1、3、4、4.5、5、5.5、6、7、8、9、10、12、15、24、36和48 h采集静脉血4 mL，检测血浆样本中二甲双胍的浓度，用Win Nonlin 7.0 软件计算药代动力学参数，当受试制剂与参比制剂的cmax、AUC0-t、AUC0-∞几何均值比的90%置信区间均在80.00% ~ 125.00%等效区间内，证明两制剂生物等效。有1例受试者因不良事件脱落。受试制剂和参比制剂的主要药代动力学参数：cmax为（0.68 ± 0.14）和（0.65 ± 0.11） mg/L，AUC0-t为（7.33 ± 1.65）和（7.00 ± 1.89） h·mg/L，AUC0-∞为（7.39 ± 1.67）和（7.06 ± 1.91） h·mg/L；二者cmax、AUC0-t和AUC0-∞几何均值比的90%置信区间分别为101.45% ~ 109.14%、100.08% ~ 112.32%和100.24% ~ 112.28%，均在80.00% ~ 125.00%生物等效区间内。试验过程中无严重不良事件和非预期不良事件发生。结果表明，盐酸二甲双胍缓释片受试制剂和参比制剂在健康受试者中餐后单次给药条件下生物等效，二者安全性和耐受性好。
关键词
糖尿病是严重威胁人类健康的慢性疾病，目前全球有5.37亿成年（20 ~ 79岁）糖尿病患者，占人口总数的10%以上，且数量逐年增
盐酸二甲双胍缓释片仿制药（受试制剂，商品名：卜
API 4000三重四极杆串联质谱，Turboionspra
本研究符合世界医学协会《赫尔辛基宣言》的要求，首都医科大学附属北京世纪坛医院伦理委员会批准本项研究（批件号：2017Y95）。在试验开始前，所有受试者在充分知情的前提下签署知情同意书。入选标准：年龄大于18岁的健康受试者；男性体重大于50.0 kg，女性体重大于45.0 kg，体质量指数为19.0 ~ 28.0 kg/
盐酸二甲双胍缓释片cmax个体内变异系数（CV）设为14.3%。受试制剂与参比制剂的几何均值比（GMR）设为0.9 ~ 1.1，把握度为0.90，双侧显著性水平为0.05。用SAS9.2程序估算需要26例受试者可证明生物等效性。考虑到20%的脱落风险，餐后状态下证实试验拟入组32例受试者。
本项试验共筛选109例受试者，纳入32例，均为黄种人，汉族30例，少数民族2例，年龄（31.70 ± 8.49）岁，男性24例（75.00%，24/32），体重（66.07 ± 8.57） kg，身高（167.66 ± 8.00） cm，体重指数（23.50 ± 2.54） kg/
本研究采用单中心、随机、开放、单剂量、两周期、两序列、双交叉设计，使用SAS9.2软件采用区组随机方法产生随机表，每位受试者按照随机结果服用“受试制剂—参比制剂”或“参比制剂—受试制剂”，两周期间清洗期为7 d。
受试者于给药前1天入住研究中心并随机编号，统一进食清淡晚餐。禁食过夜10 h后，在服药前30 min开始进食1份高脂高热量（800 ~ 1 000 kcal，1 kcal = 4.184 kJ）的标准试验餐（
| Material | Edible portion/g | Market goods/g | Heat energy/kcal | Protein/g | Fat/g | Carbohydrate/g |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Standard flour | 80 | 80 | 295.12 | 12.56 | 2 | 56.72 |
| Lettuce | 50 | 53.19 | 7.95 | 0.65 | 0.15 | 1 |
| Chicken | 50 | 50 | 58.95 | 12.3 | 0.95 | 0.3 |
| Milk | 250 | 250 | 136 | 7.5 | 8 | 8.5 |
| Egg | 50 | 56.82 | 68.8 | 7.2 | 3.2 | 2.8 |
| Salad oil | 35 | 35 | 314.47 | 0 | 34.9 | 0.11 |
| Total | 881.29 | 40.21 | 49.2 | 69.43 | ||
| Heat supply ratio (%) | 18.25 | 50.24 | 31.51 |
1 kcal = 4.184 kJ
每周期在给药0 时（给药前10 min内）和给药后第1、3、4、4.5、5、5.5、6、7、8、9、10、12、15、24、36和48 h通过静脉留置针采集静脉血4 mL置于含K2-EDTA抗凝剂真空采血管，轻柔颠倒数次充分混匀。采血后1 h内4 ℃，2 500 r/min，离心10 min，将上层血浆分成2份，其中约1 mL血浆加入检测冻存管中，其余血浆加入备份冻存管中。离心结束后1 h内将血浆样本放置到-20 ± 10 ℃冰箱中暂存，于72 h内转移至-70 ± 10 ℃冰箱中长期储存。血浆样本由专业冷链物流公司干冰寄送至上海方达生物技术有限公司进行样本检测。
色谱柱：Phenomenex Luna Silica（2）（4.6 mm × 50 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%甲酸10 mmol/L甲酸铵水溶液（84∶16）；流速：1.5 mL/min；柱温：室温；进样量：5 μL。
取血浆样品100 μL于96孔板中，加入内标溶液（250 ng/mL二甲双胍-d6）或甲醇-水溶液（20∶80）20 μL。漩涡振荡30 s（1 000 r/min）后加入甲醇500 μL，漩涡振荡10 min（1 000 r/min），离心10 min（6 000 r/min），进样5 μL作LC-MS/MS分析。
取6个不同批次空白血浆，按照“2.4”项下处理，分别进行空白样品和在定量下限（LLOQ）加入二甲双胍及内标溶液的添加实验。在所建立的色谱条件下，所有结果均符合接收标准，表明本方法测定人血浆中二甲双胍的专属性良好，血浆基质对测定无干扰。代表色谱图见
Figure 1 Typical chromatograms of blank samples (A, B) and LLOQ (lower limit of quantification) samples (C, D)
A, C: with metformin; B, D: with internal stardard (IS, metformin-d6)
用空白血浆配制浓度为1，2，10，50，100，500，800和1 000 ng/mL的标准曲线样品，定量下限为1 ng/mL。以分析物（二甲双胍）与内标（二甲双胍-d6）的色谱峰面积比为纵坐标，血浆中分析物的质量浓度（x）与峰面积比（y）进行线性回归，权重因子为1/
用3个独立分析批的4个浓度水平（1，3，60和750 ng/mL）的质控样品的平行6份样品来评估批内和批间准确度和精密度。每一个浓度平行制备6份，按照“2.4”项下处理。质控样品的批内和批间的精密度和准确度均符合生物样品接受标准。在低、中、高质量浓度下，二甲双胍每一浓度的回收率均在99.3% ~ 100.6%之间，相对标准偏差（CV）均不大于15.0%，具体结果见
| c/(ng/mL) | Intra-day/(ng/mL) | Precision/% | Accuracy/% | Inter-day/(ng/mL) | Precision/% | Accuracy/% | Relative recovery/% |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 1.05 ± 0.05 | 4.76 | 5.00 | 1.13 ± 0.07 | 6.19 | 13.00 | - |
| 3 | 3.05 ± 0.05 | 1.64 | 1.67 | 3.12 ± 0.08 | 2.56 | 4.00 | 99.4 |
| 60 | 63.52 ± 0.63 | 0.99 | 5.87 | 63.12 ± 0.97 | 1.54 | 5.20 | 99.3 |
| 750 | 735.24 ± 12.38 | 1.68 | -1.97 | 731.43 ± 13.13 | 1.80 | -2.48 | 100.6 |
分别取6个不同批次的国外购买的空白人血浆及6个不同批次的中国人空白人血浆，每个批次配制一份，按照“2.4”项处理时不加入内标溶液，以相应体积稀释剂代替，经前处理后分别加入与处理后的低、中、高浓度质控样品浓度相当的标准品溶液及内标溶液进行分析。内标的化合物归一化后的基质效应因子将以中浓度质控样品计算。二甲双胍质量浓度为3、60、750 ng/mL时，经内标归一化后的平均基质因子分别为（1.07 ± 0.03）、（1.09 ± 0.02）和（1.11 ± 0.02），相对标准偏差分别为2.8%、1.8%和1.8%。符合基质效应考察的要求，表明样品测定不受基质效应影响。
为考察人血浆质控样品短期稳定性，分别将低、高两个浓度的人血浆质控样品放置于室温条件下（通常为4至24 h），结果表明二甲双胍血浆样品可在室温下稳定至少16 h；为考察样品冻融对实验的影响，分别将低、高两个浓度的人血浆质控样品经过4次冻融循环后进行检测。结果表明，人血浆样品可稳定至少经过4次冷冻（-70 ℃）/解冻循环。为考察人血浆质控样品长期稳定性，分别将低、高两个浓度的人血浆质控样品储存于-20 ℃和-70 ℃低温冷冻冰箱中，按照“血浆样品处理”项下处理，随新鲜配制的标准曲线样品一同测定。结果表明，二甲双胍人血浆样品可在-20 ℃和-70 ℃下稳定至少82 d。
血药浓度数据采用Phoenix WinNolin软件（Pharsight Corporation，7.0）进行非房室模型药代动力学参数估算分析，计算主要药代动力学参数（cmax、AUC0-t、AUC0-∞、tmax、t1/2和λz），以全面反映药物在人体内吸收、分布、代谢和排泄的特点。采用SAS 9.2版本进行统计计算，非正态分布的计量资料用中位数（最小值，最大值）表示，两组间差异采用Wilcoxon秩和检验；正态分布的计量资料用表示，两组间差异采用t检验分析。计数资料：以例数和百分数（n，%）表示，两组间差异采用卡方检验，如果期望值小于5，则采用Fisher精确检验。P > 0.05提示两种间差异无统计学意义。统计学处理由浙江嘉兴泰格数据管理有限公司完成。
健康受试者餐后口服二甲双胍受试制剂和参比制剂0.5 g后的平均血药浓度-时间曲线，见
Figure 2 Mean plasma concentration-time curves of test preparation or reference preparation of metformin hydrochloride sustained-release tablets with single-dose oral administration under fed condition in healthy subjects （）
健康受试者餐后口服二甲双胍受试制剂和参比制剂0.5 g后的主要药代动力学参数，见
| Pharmacokinetic parameter | Test preparation | Reference preparation | t value | P value |
|---|---|---|---|---|
| AUC0-t/(h·mg/L) | 7.33 ± 1.65 | 7.00 ± 1.89 | -0.72 | 0.48 |
| AUC0-∞/(h·mg/L) | 7.39 ± 1.67 | 7.06 ± 1.91 | -0.72 | 0.48 |
| cmax/(mg/L) | 0.68 ± 0.14 | 0.65 ± 0.11 | -1.17 | 0.25 |
|
| 4.50 (4.50, 7.00) | 4.50 (4.50, 8.00) |
-0.7 | 0.44 |
| t1/2/h | 6.11 ± 2.36 | 5.81 ± 1.80 | -0.58 | 0.57 |
|
λz / | 0.12 ± 0.02 | 0.13 ± 0.02 | 0.90 | 0.37 |
*tmax were measurement data of non-normal distribution median, tested by Wilcoxon rank-sum test and expressed by Z value and P value
健康受试者餐后口服二甲双胍受试制剂（T）和参比制剂（R）0.5 g，受试者的AUC0-t、AUC0-∞和cmax几何均值比（T/R）分别为106.02%，106.09%和105.22%，其90%置信区间分别为100.08% ~ 112.32%，102.24% ~ 112.28%和101.45% ~ 109.14%，均落在80.00% ~ 125.00%内，表明餐后口服受试制剂和参比制剂具有生物等效性（
| Pharmacokinetic parameter | Geometric mean and proportion | 90% CI of T/R (%) | Power (1-β, %) | Variability within individuals (CV, %) | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| T | R | T/R | ||||
| AUC0-t/(h·mg/L) | 7.15 | 6.74 | 106.02 | 100.08-112.32 | 99.9 | 13.42 |
| AUC0-∞/(h·mg/L) | 7.21 | 6.79 | 106.09 | 100.24-112.28 | 99.9 | 13.19 |
| cmax/(mg/L) | 0.67 | 0.64 | 105.22 | 101.45-109.14 | 100.0 | 8.48 |
服用受试制剂期间，有1例受试者发生1例次不良事件（3.13%，1/32）退出试验，其余31例受试者完成了整个试验过程。共有7例（21.88%，7/32）受试者发生9例次不良事件，其中6例（18.75%，6/32）受试者发生8例次不良反应。服用参比制剂期间，13例（41.94%，13/31）受试者发生18例次不良事件，其中13例（41.94%，13/31）受试者发生17例次不良反应。受试制剂和参比制剂不良反应都以实验室检查异常为主（55.56% vs 72.22%），两组间差异无统计学意义（Fisher检验，P = 0.42），试验期间未发生严重不良事件。本试验中所有与研究药物相关的不良事件都未予以治疗，具有自限性，所有不良事件均观察至恢复。
本项试验在国家相关规定条件
本课题组前期曾报道同种盐酸二甲双胍缓释片受试制剂和参比制剂在空腹条件下的生物等效性研究结
由于本项试验样本量小，没有显示药物的所有不良事件，本研究观察到的不良事件与本课题组前期总结的同剂型盐酸二甲双胍缓释片的不良事
References
International Diabetes Federation. IDF Diabetes Atlas 2021［EB/OL］.［2022-03-07］. https：//diabetesatlas.org/atlas/tenth-edition/. [百度学术]
Chinese Elderly Type 2 Diabetes Prevention and Treatment of Clinical Guidelines Writing Group，Geriatric Endocrinology and Metabolism Branch of Chinese Geriatric Society，Geriatric Endocrinology and Metabolism Branch of Chinese Geriatric Health Care Society，et al. Clinical guidelines for prevention and treatment of type 2 diabetes mellitus in the elderly in China （2022 edition）［J］. Chin J Intern Med（中华内科杂志），2022，61（1）：12-50. [百度学术]
Chinese Diabetes Society. Guideline for the prevention and treatment of type 2 diabetes mellitus in China （2020 edition）［J］. Chin J Diabetes （中华糖尿病杂志），2021，13（4）：315-409. [百度学术]
American Diabetes Association Professional Practice Committee. 2. classification and diagnosis of diabetes：standards of medical care in diabetes-2022［J］. Diabetes Care，2022，45（Suppl 1）：S17-S38. [百度学术]
Wang LM，Peng W，Zhao ZP，et al. Prevalence and treatment of diabetes in China，2013-2018［J］. JAMA，2021，326（24）：2498-2506. [百度学术]
Jiang AF，Ma LP，Wang YX，et al. Efficacy and safety of metformin hydrochloride sustained release tablets and common metformin hydrochloride tablets in treatment of type 2 diabetes mellitus［J］. China Med（中国医药），2018，13（1）：66-69. [百度学术]
National Medical Products Administration （NMPA）. Opinions of the general office of the state council on the consistency evaluation of the quality and efficacy of generic drugs（国务院办公厅关于开展仿制药质量和疗效一致性评价的意见）［EB/OL］. （2016-03-05）［2022-09-11］. https：//www.nmpa.gov.cn/zhuanti/ypqxgg/ggzhcfg/20160305170501942.htmL. [百度学术]
Sun ML，Qi L，Luo XD，et al. Pharmacokinetic bioequivalence and safety assessment of two metformin hydrochloride tablet formulations using a phase I，randomized，open，two-period，two cross-over，single-dose，fed study in healthy Chinese adult subjects［J］. Int J Clin Pharmacol Ther，2021，59（9）：630-638. [百度学术]
Sun ML，Liu HJ，Luo XD，et al. Bioequivalence and safety assessment of two formulations of metformin hydrochloride sustained-release tablets （Yuantan
Sun ML，Qi L，Luo XD，et al. Bioequivalence of metformin hydrochloride tablets under fasting and single-dose conditions in adult healthy volunteers［J］. Chin J Clin Pharmacol（中国临床药理学杂志），2021，37（11）：1307-1310. [百度学术]
Sun ML，Qi L，Luo XD，et al. Bioequivalence and safety of metformin hydrochloride sustainedrelease tablets with single-dose oral administration under fasting conditions in Chinese healthy volunteers［J］. Chin J Pharmacol Toxicol（中国药理学与毒理学杂志），2021，35（11）：830-836. [百度学术]
Zhou ZY，Wang CX，Li M，et al. In vitro dissolution and in vivo bioequivalence evaluation of two metformin extended-release tablets［J］. Clin Pharmacol Drug Dev，2021，10（4）：414-419. [百度学术]
Sun ML，Liu C，Bai HH，et al. Bioequivalence and safety evaluation of two preparations of metformin hydrochloride sustained-release tablets （Bok
Sun ML，Wang J，Song XX，et al. The safety of immediate release and sustained release formulations of metformin hydrochloride in Chinese healthy subjects［J］. Chin J New Drugs（中国新药杂志），2020，29（4）：399-407. [百度学术]