摘要
目前，以核酸酶为主要成分的基因编辑工具已经成功实现可编程地对哺乳动物基因组进行靶向突变或插入删除，从锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活子样效应子核酸酶（TALENs）、CRISPR/Cas系统发展到更安全更精准的Cas9融合蛋白基因编辑工具和其他核酸酶基因编辑工具，本文系统阐述了基因编辑的发展演进历程、介绍了新一代基因编辑工具的开发与优化，针对基因编辑工具的临床应用与面临的挑战进行了展望。
基因编辑（gene editing）是指在活体基因组中，通过基因编辑工具（一般是核酸酶），进行特定地基因序列的剪切删除、插入或者单个碱基的突变等。人类基因组由两组31.6亿个碱基的DNA组成，从胚胎开始，就有很多无法预知的基因组DNA突变发生，这常常会导致各种基因疾病的产生，例如镰刀型红血球疾病、杜氏肌营养不良、早衰症
传统的基因编辑技术可以简单总结为3个步骤：①基因编辑工具的定位，②通过核酸酶介导的DNA损伤（一般会产生DNA双链断裂DSB），③通过细胞内DNA损伤修复机制（同源定向修复HDR、非同源末端连接NHEJ等）介导的DNA修复，达到基因组删除、插入、基因点突变的目
传统的基因编辑工具，一般是指以产生DNA双链断裂（DSB）为基础的基因编辑工具，通常指：第一代锌指核酸酶（ZFNs）基因编辑系统、第二代转录激活子样效应子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）基因编辑系统和第三代CRISPR/Cas9基因编辑系统。
ZFNs是由核酸结合蛋白Cys2-His2锌指蛋白（ZFP）和核酸内切酶Fok Ⅰ建立的融合蛋白，通过锌指DNA结合域的定位和Fok Ⅰ核酸内切酶结构域的二聚形成靶向DNA双链断裂。ZFNs的工作原理见
图1 锌指核酸酶（ZFNs）工作原
TALENs技术的核心是TALE蛋白。TALE蛋白可以识别特定核苷酸序列。与ZFNs结构类似，TALENs也是通过TALE蛋白的DNA结合域与Fok Ⅰ核酸内切酶结构域的二聚形成靶向DNA双链断裂。TALENs的工作原理见
图2 转录激活子样效应子核酸酶（TALENs）工作原
TALENs于2009年由Becker
2012年，一种来源于细菌和古细菌免疫系统的规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR/Cas）系统被用于基因编辑工作，其工作原理见
图3 CRISPR编辑系统工作原理[Cas9靶向切割与sgRNA互补结合的目标DNA，形成随机的插入或缺失（indels），通过同源定向修复或非同源末端连接等整合供体DNA，完成基因编辑]
2013年初，Cong
然而，CRISPR/Cas9系统已被许多研究者报道存在严重的脱靶效应，更严重的是，以上3类基因编辑工具都基于DSB，DSB造成的隐患也在被编辑的生物体内不断被发现，DNA双链断裂的速度超过细胞自身修复损伤的速度就会导致细胞死亡。有多项研究指出CRISPR系统能激活p53而引发DNA损伤，最终干扰其基因编辑效
基于DSB带来不可逆的损伤和细胞死亡，研究人员开始着手于开发新一代不形成DSB的基因编辑工具。
在CRISPR编辑系统中，DSB由Cas9的双链切割活性导致。为了不产生DSB达到更精准的基因编辑，2016年Komor
嘧啶之间的突变实现后，开始着手解决导致更多单基因遗传病的G to A点突变。然而，自然界中并没有作用于DNA的腺嘌呤脱氨酶，Gaudelli
图4 单碱基编辑系统工作原理[由dCas9（A840H）融合脱氨酶，切割非编辑链，在编辑链上进行脱氨，完成4种碱基的颠换]
BE的应用成果也令人欣喜，2021年初，基因编辑公司BEAM宣布了首个进入临床的单碱基编辑器体内基因编辑项目VERVE-101，该项目选择关闭治疗杂合子家族性高胆固醇血症的靶点PCSK9。临床试验结果显示，经过BE编辑的受试者血液中PCSK9下降了89%，更重要的是并未观察到脱靶现象。其他难以攻克的隐性遗传病（例如先天性耳聋）的治疗，也得益于单碱基编辑器的出现，在耳聋小鼠中得到成功应
但是，据统计单基因遗传病只占全部遗传病中的三分之二，单碱基编辑器只能实现其中两种碱基颠换。并且，单碱基编辑器会将编辑窗中的C或者A都进行突变，胞嘧啶碱基编辑器中的胞嘧啶脱氨酶也被报道是导致严重脱靶效应［随机的插入与缺失（indels）］的因素之一。
2019年，又一突破性的基因编辑工具出现。Anzalone
图5 先导编辑系统工作原理[由nCas9（H840A）融合逆转录酶，切割非互补链，暴露3′flap，逆转录酶沿着pegRNA上的逆转录模板延伸出新的DNA，达到精准的替换、插入、删除与整合]
与上文介绍的BE不同，PE中的Cas9切割的是需要被编辑的那条链。当PE融合蛋白结合到DNA双链上时，编辑链会暴露并被切割形成一个3′flap，沿着pegRNA上的模板序列合成新的DNA链。同时，5′flap处的旧DNA链会激活细胞的3′flap-5′flap equilibration机制裂解5′flap。最后，编辑链和非编辑链通过错配修复（mismatch repair，MMR）机制完成整个修复过程。
研究人员进一步对几个组分都进行优化，从PE1.0开发到PE5.0。优化过程可以概括为：改造pegRNA为epegRNA保护其不会在细胞中被裂解；突变逆转录酶，增加逆转录活性，间接提高编辑效率；抑制DNA错配修复（MMR）通路，防止修复后编辑链被裂解，降低MMR相关基因的表达或在编辑链修复后再在非编辑链上引入切口等。
通过一系列的改进与优化，目前PE5.0可以在细胞中达到30%～60%的编辑效率，实现所有12种单碱基的自由转换，小片段的插入与删除。据报道，PE有望治疗89%的遗传疾病，并陆续在动植物体推进应用。2021年，拉瓦尔大学的Tremblay
然而，基于CRISPR系统的基因编辑工具应用还存在许多限制。首先，这些基于CRISPR系统的基因编辑工具要实现DNA定位，主要依赖于前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motifs，PAM），人类基因组中只有9.9%的基因存在可以被识别的PAM基
针对PE需要被解决的问题，科学家们又开发了一系列新型基因编辑工具。
以BE为基础，有3种双碱基编辑工具同时发表，对胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶进行整合优化，开发了两种A&C-BEmax和SPACE双碱基编辑
以PE为基础，为解决原始PE对大片段基因编辑效率低下的问题，科学家们先后开发了几种双PE基因编辑工具。
以双pegRNA为基础构建的大片段基因编辑工具PEDAR（PE-Cas9-based deletion and repair
长片段基因组的重新编程使同时修正多个致病位点成为可能，并且，长片段序列的替换与纠正为罕见基因疾病的基因治疗增加了通用性与便捷性。但是，显而易见，多类型基因编辑工具的开发思路都是通过增加一个编辑器或增加向导RNA的方法，过大过复杂的基因编辑工具更是难以被递送进入人体。
总而言之，通过以上工作，基因编辑工具可以实现的基因编辑类型已经涵盖了所有单碱基的自由转化、突变，DNA片段的插入、删除、替换等，基本满足了基因治疗的应用需求。但是，基因编辑工具还有两个限制并未解决，PAM的限制使其不能靶向全部人类基因组，基因编辑工具大小的限制也是临床应用的一大瓶颈。
除了开发不产生DSB的新型基因编辑工具，科学家们还在对传统基因编辑工具的序列限制和体型限制进行改进优化。
为了打破PAM序列的限制，研究者们开展了很多工作。Christie
但是SpRY变体对嘧啶类位点的亲和力还有待提高，并且从Cas9延伸的变体都存在体积太大难以递送的问题。Huang
除了对野生型Cas9进行蛋白改造，科学家们也在寻找其他的基因编辑酶。
武汉大学Shi
南京大学Xu
图6 HpSGN编辑系统工作原理（hpDNA通过发夹结构与向导DNA组成，靶向编辑链，FEN1会特异性识别hpDNA与编辑链形成的三碱基重叠结构，进行切割，完成基因编辑）
如何实现精准有效的递送是基因编辑工具应用在人体的最后一公里。为了早日实现临床应用与提高递送效率，科学家们也在递送方面做出了很多努力。前文说到，CRISPR相关融合蛋白构建的基因编辑系统很难被递送，所以开发更小型易于递送的工具是很必要的。目前的研究主要从缩小Cas蛋白和拆分融合蛋白两个方向推进。
从构建更小的基因编辑蛋白方向，除了上文提过的Huang
上海科技大学Wu
清华大学Tsuchida
康奈尔大学的Schuler
从拆分融合蛋白的方向，也有几个重要的发现。中山大学Zhi
除了拆分PE融合蛋白，拆分过长的pegRNA也是优化思路。目前已经报道了将pegRNA拆分后环化和增加MS2适体，增加suntag等策
西北大学的Huang
这些小型基因编辑工具的优化都是为了满足在人体内的应用，使其能够被腺病毒相关病毒所递送。但是，无论是缩小蛋白还是拆分基因编辑工具，都不可避免地牺牲基因编辑效率与可编辑类型。所以，构建出一个突破各方面限制的基因编辑工具，走好基因治疗应用的最后一公里，在递送方面还需不断优化和改进。
尽管基因编辑技术被誉为21世纪生命科学领域的突破性革命，但是其安全性和伦理问题仍备受争议。
基因编辑技术的开发致力于从人体胚胎进行应用，一次性解决致病基因。然而，目前并未开发出完全无脱靶风险的编辑工具。多篇文章报道对CRISPR/Cas9相关编辑系统进行全基因组脱靶分析，被编辑的动物体内许多原癌基因、抑癌基因出现有害突变。
不仅是体内基因编辑难以应用，即使目前FDA已经批准了一系列体外基因编辑项目的临床应用，但是体外基因编辑后的CAR-T细胞也被多个研究报道了会对人体造成基因毒性。2021年，由于在输注了CAR-T细胞的病人体内发现了由基因编辑导致的染色体易位，FDA紧急叫停了临床研究。
2022年7月，首个获批临床试验的基因编辑药物VERVE-101在新西兰完成了首例患者给药，利用碱基编辑器沉默PCSK9致病基因，这也是第1个直接在体内进行基因编辑的临床项目。但是FDA在2022年11月突然暂停临床实验，且双方都没有公布具体原因。后续FDA要求公司提供更多数据，主要是包括编辑风险，脱靶分析和是否会遗传给后代的证明。并且一位接受CRISPR基因编辑疗法的DMD患者也不幸死亡，具体原因也并不清晰。
随着基因编辑药物相关脱靶致癌风险的不断发现以及临床试验的屡次叫停，基因编辑技术的开发与应用蒙上了阴影，但是这也为基因编辑领域的空白地带研究给出了新的方向与动力。即使基因编辑工具的风险因素不断被提出，但是针对检测与表征基因编辑工具的脱靶程序也相继在研发，不断有更安全更精准可控的基因编辑工具被提出，科学家们也在着手建立更全面的基因治疗安全标准，打破基因编辑工具在体内的应用壁垒，推动基因治疗能够早日安全应用。
基因编辑的伦理问题伴随着基因编辑技术的提出就一直备受争议，毫无疑问这是一把双刃剑。
从适用范围来说，伦理委员会与研究人员达成的共识是，基因编辑技术可以应用的是已经有证明是明确单独决定因素的致病位点，这种疾病已经带来了极大痛苦。但是，目前基因编辑的相关研究成果都证明了在一些相关基因编辑后的良好治疗结果（例如HIV），这就引发了伦理与科学的思考。
从自然进化来说，对于胚胎的基因编辑，宣称从根本上治疗遗传疾病，但是这无疑是违背自然规律的，打破了人与自然的平衡。并且，基因编辑工具的风险还并未研究透彻，无法预期的脱靶也会随着胚胎基因编辑整合到后代中，无论任何后果都难以想象。
因此，如何利用好这把双刃剑去攻克基因疾病，正是一代又一代基因编辑工具开发的初衷。掌握好这项技术也许能够给无数罕见病患者家庭带来生的希望，但是真正应用于临床依旧任重道远。
基于不同原理的基因编辑工具比较见
| 分 类 | 原 理 | 特 点 | 应 用 |
|---|---|---|---|
| 传统基因编辑工具（产生DSB） | 锌指核酸酶（ZFNs） | 非特异性脱靶切割，剪切效率低 |
体外基因治疗 治疗AIDS； 编辑T细胞，抗肿瘤 |
| 转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs） | 时间成本更低，操作简便，识别位点多，剪切效率高 | ||
| CRISPR/Cas9技术 | 设计简单，提高效率，导致p53激活致癌 | ||
| 新一代基因编辑工具（不产生DSB） | 单碱基编辑（BE） | 精准的单碱基突变，编辑类型少 |
体外基因治疗 血红蛋白病：编辑BCL11A基因增强胎儿血红蛋白； β-地中海贫血：红细胞中引入功能性球蛋白基因； 调节T细胞：敲除编码内源性T细胞受体（TCR）的两个基因和编码PD1基因，增强CAR-T疗法 |
| 先导编辑（PE） | 各种编辑类型，小片段插入删除 | ||
| 结构酶FEN1引导的基因编辑工具 | 无PAM限制，体积小易于递送 |
体内基因治疗 先天性黑蒙症10型（LCA10）失明：剪切突变CEP290基因； AIDS：敲除患者基因组中整合的HIV DNA； 转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR）：敲除TTR基因，降低TTR的表达 | |
| 其他基因编辑工具 |
整合酶重组酶编辑工具； RNA编辑器ADAR；提高脱靶检测敏感性GOTI技术 |
新一代基因编辑工具，即可以实现全部基因组编辑、实现任意类型插入删除突变的易于应用以及能够减少毒性的基因编辑工具。新工具的不断开发，可以看到正在向这个理想的方向接近。同时，构建能够高通量检测基因编辑工具脱靶水平和编辑效率的平台也在进一步研究中，有望对基因编辑毒性的空白领域进行探索。
积极研发能够安全递送的基因编辑工具与递送系统，完成基因治疗的最后一公里。完善相关伦理与法律监管问题，攻克罕见病，是未来科学家们共同努力的方向。
References
Nurk S，Koren S，Rhie A，et al. The complete sequence of a human genome［J］. Science，2022，376（6588）：44-53. [百度学术]
Arnold C. 11 clinical trials that will shape medicine in 2022［J］. Nat Med，2021，27（12）：2062-2064. [百度学术]
Anzalone AV，Koblan LW，Liu DR. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases，base editors，transposases and prime editors［J］. Nat Biotechnol，2020，38（7）：824-844. [百度学术]
Geurts AM，Moreno C. Zinc-finger nucleases： new strategies to target the rat genome［J］. Clin Sci，2010，119（8）：303-311. [百度学术]
Joung JK，Sander JD. TALENs：a widely applicable technology for targeted genome editing［J］. Nat Rev Mol Cell Biol，2013，14（1）：49-55. [百度学术]
Pickar-Oliver A，Gersbach CA. The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications［J］. Nat Rev Mol Cell Biol，2019，20（8）：490-507. [百度学术]
Kim YG，Cha J，Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes： zinc finger fusions to Fok I cleavage domain［J］. Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93（3）：1156-1160. [百度学术]
Li H，Yang Y，Hong W，et al. Applications of genome editing technology in the targeted therapy of human diseases： mechanisms，advances and prospects［J］. Signal Transduct Target Ther，2020，5（1）：1-23. [百度学术]
Becker S，Boch J. TALE and TALEN genome editing technologies［J］. Gene Genome Ed，2021，2：100007. [百度学术]
D'Souza SS，Kumar A，Weinfurter J，et al. Generation of SIV-resistant T cells and macrophages from nonhuman primate induced pluripotent stem cells with edited CCR5 locus［J］. Stem Cell Reports，2022，17（4）：953-963. [百度学术]
Knott GJ，Doudna JA. CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering［J］. Science，2018，361（6405）：866-869. [百度学术]
Cong L，Ran FA，Cox D，et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems［J］. Science，2013，339（6121）：819-823. [百度学术]
Geurts MH，de Poel E，Pleguezuelos-Manzano C，et al. Evaluating CRISPR-based prime editing for cancer modeling and CFTR repair in organoids［J］. Life Sci Alliance，2021，4（10）：.1-12. [百度学术]
Enache OM，Rendo V，Abdusamad M，et al. Cas9 activates the p53 pathway and selects for p53-inactivating mutations［J］. Nat Genet，2020，52（7）：662-668. [百度学术]
Leibowitz ML，Papathanasiou S，Doerfler PA，et al. Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing［J］. Nat Genet，2021，53（6）：895-905. [百度学术]
Xu S，Kim J，Tang Q，et al. CAS9 is a genome mutator by directly disrupting DNA-PK dependent DNA repair pathway［J］. Protein Cell，2020，11（5）：352-365. [百度学术]
Komor AC，Kim YB，Packer MS，et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage［J］. Nature，2016，533（7603）：420-424. [百度学术]
Gaudelli NM，Komor AC，Rees HA，et al.Publisher Correction：Programmable base editing of A•T to G•C in genomic DNA without DNA cleavage［J］. Nature，2016，533（7603）：420-424. [百度学术]
Yeh WH，Shubina-Oleinik O，Levy JM，et al. In vivo base editing restores sensory transduction and transiently improves auditory function in a mouse model of recessive deafness［J］. Sci Transl Med，2020，12（546）：eaay9101. [百度学术]
Anzalone AV，Randolph PB，Davis JR，et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA［J］. Nature，2019，576（7785）：149-157. [百度学术]
Tremblay G，Rousseau J，Mbakam CH，Tremblay JP. Insertion of the icelandic mutation （A673T） by prime editing： a potential preventive treatment for familial and sporadic Alzheimer's disease［J］. CRISPR J，2022，5（1）：109-122. [百度学术]
Collias D，Beisel CL. CRISPR technologies and the search for the PAM-free nuclease［J］. Nat Commun，2021，12（1）：555. [百度学术]
Zhang X，Zhu B，Chen L，et al. Dual base editor catalyzes both cytosine and adenine base conversions in human cells［J］. Nat Biotechnol，2020，38（7）：856-860. [百度学术]
Grünewald J，Zhou R，Lareau CA，et al. A dual-deaminase CRISPR base editor enables concurrent adenine and cytosine editing［J］. Nat Biotechnol，2020，38（7）：861-864. [百度学术]
Liang Y，Xie J，Zhang Q，et al. AGBE： a dual deaminase-mediated base editor by fusing CGBE with ABE for creating a saturated mutant population with multiple editing patterns［J］. Nucleic Acids Res，2022，50（9）：5384-5399. [百度学术]
Jiang T，Zhang XO，Weng Z，et al. Deletion and replacement of long genomic sequences using prime editing［J］. Nat Biotechnol，2022，40（2）：227-234. [百度学术]
Choi J，Chen W，Suiter CC，et al. Precise genomic deletions using paired prime editing［J］. Nat Biotechnol，2022，40（2）：218-226. [百度学术]
Anzalone AV，Gao XD，Podracky CJ，et al. Programmable deletion，replacement，integration and inversion of large DNA sequences with twin prime editing［J］. Nat Biotechnol，2022，40（5）：731-740. [百度学术]
Zhuang Y，Liu J，Wu H，et al. Increasing the efficiency and precision of prime editing with guide RNA pairs［J］. Nat Chem Biol，2022，18（1）：29-37. [百度学术]
Wang J，He Z，Wang G，et al. Efficient targeted insertion of large DNA fragments without DNA donors［J］. Nat Methods，2022（1）：19331-19340. [百度学术]
Christie KA，Guo JA，Silverstein RA，et al. Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests［J］. Nat Biotechnol，2022：1-8.doi：10.1038/s41587-022-01492-y. [百度学术]
Huang TP，Heins ZJ，Miller SM，et al. High-throughput continuous evolution of compact Cas9 variants targeting single-nucleotide-pyrimidine PAMs［J］. Nat Biotechnol，2022：1-12.doi：10.1038/s41587-022-01410-2. [百度学术]
Shi YJ，Duan M，Ding JM，et al. DNA topology regulates PAM-Cas9 interaction and DNA unwinding to enable near-PAMless cleavage by thermophilic Cas9［J］. Mol Cell，2022，82（21）：4160-4175.e6. [百度学术]
Xu S，Cao S，Zou B，et al. An alternative novel tool for DNA editing without target sequence limitation： the structure-guided nuclease［J］.Genome Biol，2016，17（1）：186. [百度学术]
Tian K，Guo Y，Zou B，et al. DNA and RNA editing without sequence limitation using the flap endonuclease 1 guided by hairpin DNA probes［J］.Nucleic Acids Res，2020，48（20）：e117. [百度学术]
Wu Z，Zhang Y，Yu H，et al. Programmed genome editing by a miniature CRISPR-Cas12f nuclease［J］.Nat Chem Biol，2021，17（11）：1132-1138. [百度学术]
Kim DY，Lee JM，Moon SB，et al. Efficient CRISPR editing with a hypercompact Cas12f1 and engineered guide RNAs delivered by adeno-associated virus［J］.Nat Biotechnol，2022，40（1）：94-102. [百度学术]
Tsuchida CA，Zhang S，Doost MS，et al. Chimeric CRISPR-CasX enzymes and guide RNAs for improved genome editing activity［J］.Mol Cell，2022，82（6）：1199-1209.e6. [百度学术]
Schuler G，Hu C，Ke A. Structural basis for RNA-guided DNA cleavage by IscB-ωRNA and mechanistic comparison with Cas9［J］.Science，2022，376（6600）：1476-1481. [百度学术]
Zhi S，Chen Y，Wu G，et al. Dual-AAV delivering split prime editor system for in vivo genome editing［J］. Mol Ther，2022，30（1）：283-294. [百度学术]
Grünewald J，Miller BR，Szalay RN，et al. Engineered CRISPR prime editors with compact，untethered reverse transcriptases［J］.Nat Biotechnol，2022：1-7.doi：10.1038/s41587-022-01473-1. [百度学术]
Liu B，Dong X，Cheng H，et al. A split prime editor with untethered reverse transcriptase and circular RNA template［J］.Nat Biotechnol，2022，40（9）：1388-1393. [百度学术]
Huang C，Han Z，Evangelopoulos M，et al. CRISPR spherical nucleic acids［J］. J Am Chem Soc，2022，144（41）：18756-18760. [百度学术]