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非酒精性脂肪性肝病细胞模型中胆固醇代谢紊乱机制

  • 章玉婷 1
  • 王安慧 1
  • 杨晋妮 1
  • 林佳纯 1
  • 田媛 1
  • 董海娟 2
  • 张尊建 1
  • 宋瑞 1 ✉
1. 中国药科大学药物质量与安全预警教育部重点实验室，南京 210009； 2. 中国药科大学公共实验室平台，南京 210009

中图分类号： R965

最近更新：2023-09-11

DOI：10.11665/j.issn.1000-5048.2023032401

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EN 引
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摘要

肝脏胆固醇代谢紊乱在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发生发展中具有重要作用。为揭示饱和脂肪酸诱导肝细胞胆固醇稳态失衡的分子机制，采用棕榈酸诱导HepG2细胞，通过油红O染色、试剂盒测定细胞内甘油三酯（TG）和胆固醇（TC）含量评估脂质累积；采用RT-qPCR和Western blot检测与胆固醇稳态相关基因和蛋白表达水平；LC-MS/MS检测细胞胆汁酸和线粒体氧甾醇水平。结果发现，棕榈酸处理后，细胞内脂滴明显累积且TG与TC含量显著升高（P < 0.000 1）；胆固醇合成和摄取相关基因表达无明显变化，但ABCG5和LXRα蛋白表达显著下调，表明胆固醇外排减少；负责胆汁酸替代合成的限速酶STARD1和CYP7B1基因表达显著增强，线粒体中胆固醇、27-羟基胆固醇（27-OHC）以及细胞中鹅去氧胆酸（CDCA）水平明显升高。本研究结果表明，棕榈酸刺激后可能通过抑制胆固醇外排和促进胆汁酸合成扰乱胆固醇稳态。

非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）是一种与2型糖尿病、肥胖和心血管疾病密切相关的代谢综合征。它包含一系列肝脏病理特征，从以肝脏总胆固醇和甘油三酯水平升高为主要特征的单纯脂肪变性，到更为严重的伴随继发性炎症和线粒体功能障碍的非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），最后发展为不可逆转的肝硬化甚至肝细胞癌[

1-4]。近年来，受高脂高糖饮食和久坐不动等不良生活方式的影响，NAFLD患病率已高达25%且仍呈现逐年升高趋势[5]。然而，目前还没有获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物用于临床[6]。因此，亟须深入了解疾病发病机制并寻找有效的治疗靶点。

肝脏是胆固醇生物合成的主要部位，胆固醇可转化为胆汁酸（bile acids, BAs）、维生素和类固醇，也可酯化生成胆固醇酯后以脂滴的形式储存，以维持细胞内的胆固醇稳态[

7-8]。一项横断面研究发现，NAFLD患者血清和肝脏中甘油三酯（triglyceride,TG）和总胆固醇（total cholesterol,TC）水平显著升高[9]，此外，肝活检组织的脂质组学分析结果表明，单纯脂肪变性和NASH患者肝脏中游离胆固醇累积[10]。动物实验研究表明，高脂高胆固醇饮食喂养foz/foz小鼠可诱导其肝脏胆固醇积聚，导致脂肪性肝炎和肝纤维化的产生，而降低肝脏胆固醇水平可改善肝脏疾病的严重程度[11]。另外，胆固醇累积还会影响线粒体和内质网（endoplasmic reticulum，ER）的功能，诱导肝细胞凋亡和坏死，最终导致肝脏损伤加剧[12-13]。这些研究表明，肝脏胆固醇代谢失调与NAFLD/NASH疾病的发生发展密切相关[14]。

有文献报道棕榈酸（palmitic acid，PA）诱导的L02脂肪变性细胞模型中胆固醇水平升高，并发现胆固醇生物合成相关的基因表达显著增加[

15]。但影响细胞内胆固醇稳态的其他因素，如胆固醇摄取、转化和储存的相关基因和蛋白表达情况是否发生变化还尚未见相关研究报道。因此，本研究基于PA构建的HepG2脂肪变性细胞模型，从基因、蛋白和代谢物水平系统研究NAFLD状态下细胞内胆固醇稳态的变化，为基于胆固醇稳态调控治疗NAFLD提供有益参考。

1 材 料

1.1　试 剂

棕榈酸钠、二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma-Aldrich公司）；CCK-8（上海百赛生物技术有限公司）；DMEM高糖培养基、胰蛋白酶和PBS（美国Gibco公司）；胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries公司）；牛血清白蛋白（free-fatty acid，BSA，索莱宝生物科技有限公司）；甘油三酯和总胆固醇测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Trizol、HiScrip Ⅲ qRTSuperMix和AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（南京诺唯赞医疗科技有限公司）；RIPA裂解液、PMSF、Triton X-100、油红O染色试剂盒、增强型BCA蛋白检测试剂盒、SDS-PAGE制备试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；CHOP和GRP78一抗（美国Affinity公司）；STARD1、LXRα、ABCG5和β-actin一抗（武汉爱博泰克公司）；丁基羟基甲苯（BHT，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；（2, 2, 4, 4-d4）-胆酸（CA-d4）（美国Cambridge Isotope Laboratories公司）；（2, 2, 4, 4-d4）-石胆酸（LCA，美国Glpbio公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2　仪 器

Infinite 200Pro多功能酶标仪（瑞士Tecan有限公司）；Light Cycler96实时荧光定量PCR仪（美国罗氏公司）；化学发光成像系统（上海Tanon公司）；JY92-IIN超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技公司）；UPLC-MS/MS 8040液质联用色谱仪（日本Shimadzu公司），包含LC-30AD泵、SIL-30AD自动进样器、CTO-20A柱温箱、DGU-20A5R脱气机、CMB-20A系统控制器、MS-8040三重四极杆质谱检测器；FinniganTM TSQ Quantum Discovery MAX液相三重四极杆质谱联用系统（赛默飞世尔科技有限公司），包括Surveyor液相色谱仪，Surveyor自动进样器， TSQ Quantum三重四极杆质谱仪。

1.3　细胞株

人肝癌细胞系HepG2细胞购自科佰生物科技有限公司。

2 方 法

2.1　PA-BSA溶液制备

称取一定量的棕榈酸钠，加入适量纯水，于70 ℃下加热至完全溶解，配制成100 mmol/L棕榈酸溶液。然后用含2% BSA的DMEM（含1% FBS）溶液稀释，配成浓度为1.5 mmol/L的PA-BSA储备液[

16]，0.22 μm滤膜过滤除菌后待用。使用前用培养基稀释至所需浓度。

2.2　细胞培养

HepG2细胞用含10% FBS的高糖DMEM完全培养基，于5% CO2、37℃培养箱中培养，显微镜下观察细胞状态及密度，融合至80% ~ 90%时，采用胰蛋白酶消化，按1∶2/1∶3进行传代。

2.3　细胞活力检测

选择处于对数生长期的HepG2细胞，以每孔8 × 103个细胞的密度接种至96孔板中，培养12 h使细胞贴壁，然后更换成含1% FBS的DMEM培养基饥饿12 h，随后用不同浓度的PA（0.075, 0.15, 0.3 mmol/L）分别处理细胞24、48和72 h，每个浓度组均分别设置对照组（含细胞）和空白组（不含细胞），加入对应体积的2% BSA处理相同时长，每组设6个复孔，平行实验3次。处理结束后，每孔加入CCK-8试剂10 μL，于37 ℃避光孵育3 h，在450 nm处测定吸收度并计算细胞存活率。

2.4　油红O染色

取生长状态良好的HepG2细胞接种于6孔培养板中，完全培养基培养12 h后，饥饿12 h，弃去培养基，用0.3 mmol/L PA处理72 h，对照组加入相同体积的2% BSA。处理结束后，按照改良油红O染色试剂盒说明书操作，并在倒置显微镜下观察细胞内脂质累积情况。

2.5　细胞内TC、TG含量测定

将HepG2细胞接种于6孔板中，同方法“2.4”项下分组且对应处理72 h，每组设置6个复孔。处理结束后，收集细胞，加入适量1% Triton X-100于冰上裂解40 min，按照试剂盒说明书操作测定细胞内TC和TG含量，测定结束后，于4 ℃，14 000 r/min，离心20 min，用BCA法测定上清液中的蛋白质含量（mg/mL），以对数据进行归一化处理。

2.6　实时荧光聚合酶链式反应（RT-qPCR）

采用Trizol试剂提取培养细胞的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书操作去除基因组DNA，并在37 ℃，15 min、85 ℃，5 s的条件下合成cDNA。由SYBR Green master mix 5 μL、引物（0.5 mmol/L）1 μL、cDNA 2.5 μL和ddH2O 1.5 μL组成10 μL体系进行PCR反应。以GAPDH为内参对照，用2-ΔΔCt法计算基因表达倍数变化。实验中所使用的引物如表1所示。

Table 1  Primer sequences used for real-time polymerase chain reaction
GeneForward primerReverse primer
hCYP7A1 GAGAAGGCAAACGGGTGAAC GGATTGGCACCAAATTGCAGA
hCYP8B1 GAAGCGCATGAGGACCAAG TTGCATATTGCCCAAAGTCTAGT
hCYP27A1 CGGCAACGGAGCTTAGAGG GGCATAGCCTTGAACGAACAG
hCYP7B1 AAAGGTTGGCTTCCTTATCTTGG GCAACTGACTGATGCTAAATGCT
hSTARD1 GGGAGTGGAACCCCAATGTC CCAGCTCGTGAGTAATGAATGT
hABCG5 TGGACCAGGCAGATCCTCAAA CCGTTCACATACACCTCCCC
hABCG8 AGCCTCCTTGCTAGATGTGAT GTCTCTCGCACAGTCAAGTTG
hABCA1 ACCCACCCTATGAACAACATGA GAGTCGGGTAACGGAAACAGG
hSREBF-2 CTGCAACAACAGACGGTAATGA CCATTGGCCGTTTGTGTCAG
hHMGCR TGATTGACCTTTCCAGAGCAAG CTAAAATTGCCATTCCACGAGC
hNPC1L1 CTTCTACCAGCATAGCTTTGCC AGAGCCATACACGCCACAC
hLXRα CCTTCAGAACCCACAGAGATCC ACGCTGCATAGCTCGTTCC
hGAPDH GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG

2.7　蛋白质免疫印迹（Western blot）

根据各孔细胞密度加入适量RIPA（含PMSF）裂解液，4 ℃裂解20 min，细胞刮收集细胞，4 ℃，14 000 r/min，离心20 min，采用BCA法测定上清液中蛋白浓度，按每孔20 μg折算上样量。上样并进行SDS-PAGE电泳（电泳时间：80 V、30 min；110 V、60 min），随后将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶阻断非特异性结合，并在4 ℃与STARD1、ABCG5、LXRα一抗（1∶1 000）孵育过夜。TBST清洗膜3次后，与二抗（1∶8 000）在室温下孵育1 h，TBST清洗膜3次后，通过ECL化学发光法显色。以β-actin为内参对照，用ImageJ软件分析各蛋白相对表达量。

2.8　LC-MS/MS测定胆汁酸和氧甾醇含量

2.8.1　细胞及培养液上清液中胆汁酸含量测定

选取状态较好的HepG2细胞接种于100 mm培养皿中，同 “2.4”项下分组且对应处理72 h，每组设置7个重复，同时设置一皿无细胞但含相同培养液，以扣除外源干扰。精密吸取培养液上清液200 μL，加入甲醇（含胆汁酸内标CA-d4 0.1μg/mL和LCA-d4 0.05 μg/mL）1.2 mL，涡旋5 min以沉淀蛋白，4 ℃，14 000 r/min，离心10 min。取上清液1.2 mL，氮吹干燥后待用。用冰冷的PBS洗涤细胞3次，加入80%甲醇（含胆汁酸内标CA-d4 0.1 μg/mL和LCA-d4 0.05 μg/mL）3 mL，在-80℃冰箱中淬灭20 min（淬灭的目的是使细胞中的酶失活，终止细胞代谢），细胞刮收集细胞，冰浴超声破碎，4 ℃，14 000 r/min，离心20 min。将上清液转移并氮气干燥。干燥后的样本均用甲醇80 μL复溶，供LC-MS/MS分析。每组各随机选取一皿用BCA法测定其蛋白质含量（mg/mL），用于胆汁酸含量归一化[

17-18]。

分析条件：Zorbax Bonus-RP色谱柱（2.1 mm × 150 mm，3.5 μm）；流动相：含0.01%甲酸和5 mmol/L醋酸铵的水溶液（A相）和甲醇溶液（B相）；梯度洗脱程序设置如下：0 ~ 10 min，55% B ~ 60% B； 10 ~ 60 min，60% B；60 ~ 65 min，60% B ~ 80% B； 65 ~ 75 min，80% B；75 ~ 85 min，80% B ~ 90% B；85.01 ~ 88 min，100% B；88.01 ~ 93 min，55% B；柱温：42 ℃，进样量：5 μL，流速为0.3 mL/min。各胆汁酸对照品及其对应内标的离子对与碰撞能等详细信息见表2。

Table 2  Multiple reaction monitoring (MRM) parameters (Q1/Q3 transition pair; collision energy (CE)) of 25 bile acids and 3 deuterium-labeled internal standards used in the analysis
No.CompoundAbbreviationMRM transitionsCE/eV
1 Cholic acid CA 407.1→407.1 -20
2 α-Muricholic acid α-MCA 407.1→407.1 -20
3 β-Muricholic acid β-MCA 407.1→407.1 -20
4 Ursodeoxycholic acid UDCA 391.1→391.1 -20
5 Chenodeoxycholic acid CDCA 391.1→391.1 -20
6 Hyodeoxycholic acid HDCA 391.1→391.1 -20
7 Lithocholic acid LCA 375.1→375.1 -20
8 Dehydrocholic acid DHCA 401.1→401.1 -20
9 Tauro-cholic acid TCA 514.1→79.8 -70
10 Tauro-α-muricholic acid T-MCA 514.1→79.8 -70
11 Tauro-ursodeoxycholic acid TUDCA 498.1→79.8 -70
12 Tauro-chenodeoxycholic acid TCDCA 498.1→79.8 -70
13 Tauro-dehydrocholic acid TDCA 498.1→79.8 -70
14 Tauro-hyodeoxycholic acid THDCA 498.1→79.8 -70
15 Tauro-lithocholic acid TLCA 482.1→79.8 -70
16 Tauro-dehydrocholic acid TDHCA 508.1→79.8 -70
17 Glyco-cholic acid GCA 464.1→73.9 -70
18 Glyco-ursodeoxycholic acid GUDCA 448.1→73.9 -40
19 Glyco-chenodeoxycholic acid GCDCA 448.1→73.9 -40
20 Glyco-deoxycholic acid GDCA 448.1→73.9 -40
21 Glyco-hyodeoxycholic acid GHDCA 448.1→73.9 -40
22 Glyco-lithocholic acid GLCA 432.1→73.9 -40
23 Glyco-dehydrocholic acid GDHCA 458.1→73.9 -40
24 7α-Hydroxy-4-cholesterene-3-one C4 401.4→177.2 -40
25 (IS) (2, 2, 4, 4-d4)- Cholic acid CA-d4 411.1→411.1 -20
26 (IS) (2, 2, 4, 4-d4)- Lithocholic acid LCA-d4 379.1→379.1 -20

2.8.2　线粒体分离

将HepG2细胞以每皿1 × 107个细胞的密度接种于150 mm细胞培养皿中，同“2.4”项下分组且对应处理72 h，每组设置3个重复。PA处理结束后，用冰冷的PBS清洗细胞3次，细胞刮收集细胞至离心管中，根据Minowa等[

19]报道的方法进行线粒体分离，将细胞重新悬浮在含有0.5% BSA的Hypo缓冲液中（0.5 mol/L NaCl，0.5 mol/L MgCl2，1 mol/L Tris-HCl），冰上静置10 min后转移至2 mL玻璃匀浆器匀浆，随后加入适量的线粒体分离液（525 mmol/L甘露醇，175 mmol/L蔗糖，2.5 mmol/L EDTA，12.5 mmol/L Tris-HCl）充分混合，4 ℃，2 254 r/min，5 min，沉淀为完整的细胞、细胞碎片和细胞核。取上清液，4 ℃，2 667 r/min，10 min，除去残留细胞核。取上清液于4 ℃，9 017 r/min，10 min，得线粒体粗组分。氧甾醇含量以对应蛋白质含量（mg/mL）归一化。

2.8.3　线粒体氧甾醇含量分析

根据已有报道［

20］进行线粒体脂质提取，甲醇40 μL复溶后，经LC-MS/MS 8040进样分析。分析条件如下：Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）；流动相A为70% 甲醇、30% 水、0.1% 甲酸，流动相B为70% 乙腈、30% 甲醇、0.1% 甲酸；梯度洗脱程序设置如下：0 ~ 3 min，8% B；3 ~ 14 min，8% B ~ 20% B；14 ~ 31 min，20% B ~ 35% B； 31 ~ 32 min，35% B ~ 70% B；32 ~ 49 min，70% B； 51 ~ 54 min，100% B；56 ~ 59 min，8% B；柱温：40 ℃，进样量：5 μL。各氧甾醇对照品及内标的离子对与碰撞能等信息见表3。

Table 3  MRM parameters (Q1/Q3 transition pair; CE) of 15 oxysterols and 2 deuterium-labeled internal standards used in the analysis
No.CompoundAbbreviationsMRM transitionsCE/eV
1 7α, 25-Dihydroxycholesterol 7α, 25-diOHC 383.30→365.15 -11
2 7β, 25-Dihydroxycholesterol 7β, 25-diOHC 383.30→365.25 -13
3 7α, 27-Dihydroxycholesterol 7α, 27-diOHC 401.30→383.10 -15
4 7β, 27-Dihydroxycholesterol 7β, 27-diOHC 383.30→81.20 -38
5 5α, 6α-Epoxycholestanol 5α, 6α-Epox 385.30→367.35 -16
6 5β, 6β-Epoxycholestanol 5β, 6β-Epox 385.20→367.20 -15
7 7-Ketocholesterol 7-KC 401.30→95.05 -40
8 Cholestane-3β, 5α, 6β-triol Triol 385.30→367.35 -15
9 4β-Hydroxycholesterol 4β-OHC 385.30→367.50 -14
10 7-Hydroxycholesterol 7-OHC 385.20→367.20 -14
11 20α-Hydroxycholesterol 20α-OHC 385.20→367.25 -10
12 22(R)-Hydroxycholesterol 22(R)-OHC 385.20→367.20 -12
13 25-Hydroxycholesterol 25-OHC 385.20→367.20 -13
14 27-Hydroxycholesterol 27-OHC 385.30→161.10 -18
15 Cholesterol Chol 369.20→147.0 -27
16 (IS) d7-5α, 6α-Epoxycholestanol d7-5α, 6α-Epox 392.30→374.30 -15
17 (IS) d6-27-Hydroxycholesterol d6-27-OHC 391.20→149.20 -21

2.9　统计分析

实验所有数据均以平均值±标准差（x¯±s）表示。利用Graphpad Prism 8.0软件应用非配对t检验、单因素方差分析或两因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，以P < 0.05认为具有统计学意义。

3 结 果

3.1　PA对细胞活力的影响

通过CCK-8实验评估不同浓度PA处理不同时长对HepG2细胞的毒性。结果如图1所示，3种不同浓度的PA处理1 ~ 3 d对HepG2细胞具有明显的毒性作用，且呈时间和剂量依赖性。

  

Figure 1  Effects of palmitic acid (PA) induced cytotoxicity in HepG2 cells. HepG2 cells were exposed to various concentrations of PA (0, 0.075, 0.15, 0.3 mmol/L) for 24, 48, and 72 h, and cell viability was subsequently determined by CCK-8 assay (x¯±s, n=6)

**P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group

3.2　PA促进细胞脂质堆积

TG与TC含量测定结果如图2-A所示，与对照组相比，0.3 mmol/L PA处理72 h后，细胞内TG与TC含量显著增加（P < 0.000 1）。油红O染色结果显示，对照组肝细胞形态正常，胞质内几乎无明显脂滴；而模型组中细胞形态不规则，细胞内可见大量橙红色脂滴（图2-B）。

  

Figure 2  Induction of lipid accumulation by PA in HepG2 cellsA: HepG2 cells were treated with 0.3 mmol/L PA for 72 h, and then intracellular TG and TC levels were analyzed by enzymatic assay (****P < 0.000 1 vs control group (x¯±s, n=6); B: Cells were stained with ORO, and lipid accumulation was visualized under a microscope at 400 × magnification after 72 h treatment

3.3　PA对细胞胆固醇稳态相关基因与蛋白表达的影响

如图3所示，与对照组相比，胆固醇合成相关基因SREBF-2和HMGCR mRNA表达以及负责胆固醇摄取的NPC1L1 mRNA的表达均未发生显著变化。而胆汁酸替代合成途径限速酶STARD1 mRNA的表达水平呈时间和浓度依赖性显著升高；与此同时，STARD1蛋白表达也升高约2倍（图4）。另外，随着PA浓度增加和处理时间延长，胆汁酸合成限速酶CYP7B1和关键酶CYP8B1的基因表达均上调。然而，胆固醇外流相关基因表达没有发生显著变化（P > 0.05），但ABCG5蛋白及其上游转录调控因子LXRα表达水平均显著下降（P < 0.05）。

  

Figure 3  HepG2 cells were exposed to various concentrations of PA (0, 0.075, 0.15, 0.3 mmol/L) for 24, 48 and 72 h. The mRNA levels of cholesterol synthesis, including SREBF-2 and HMGCR (A-B), and NPC1L1, forcholesterol uptake (C), and the key genes of bile acids synthesis, including STARD1, CYP27A1, CYP7B1, CYP7A1 and CYP8B1 (D-H), and cholesterol efflux, including LXRα, ABCG5, ABCG8 and ABCA1 (I-L).The relative mRNA expression levels were determined by normalizing to GAPDH (x¯±s, n=3)

*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group

  

Figure 4  Effects of PA on the bile acids alternative synthesis pathway and cholesterol efflux, measured by blot.Time- (A) and dose-dependent (B) effect of PA on STARD1, LXRα, ABCG5 protein content; (C, D) Protein expression levels are normalized with β-actin (x¯±s, n=3)

*P < 0.05, **P < 0.01 vs control group

3.4　PA增加细胞及培养液中BAs水平

为了进一步观察生物大分子功能改变是否会体现在代谢物水平上，本研究利用LC-MS/MS检测细胞及培养液中BAs水平。C4是胆汁酸合成过程中产生的一种稳定的中间体，可用于表征胆汁酸的合成速率[

21]。结果如图5所示，在细胞及培养液中均只检测到CA、CDCA及C4 3个物质。与对照组相比，PA处理后细胞内CA、CDCA与C4水平均有不同程度的增加，培养液中CA与CDCA水平显著升高，而C4含量较低，但总BAs水平增加约1.5倍（P < 0.05, P < 0.01），这与STARD1和CYP7B1 mRNA表达增加一致。

  

Figure 5  Effects of PA treatment on endogenous bile acids (BAs) content. Total BAs are measured in the media and cells from cultures treated with 0.3 mmol/L PA for 72 h and in corresponding untreated control using LC-MS/MS. Data are normalized relative to the amount of proteins in each condition

(A) Extracted ion chromatograms of m/z 407→m/z 407, m/z 391→m/z 391 and m/z 401→m/z 177 in (a) Blank solvent (MeOH); (b) CA, CDCA and C4 standard; Cells samples of control group (c) and model group (d); Culture media samples of control group (e) and model group (f).Determination of BAs content in HepG2 cells (B) and culture media (C) and total BAs content (media + cells) (D) ( x¯±s, n=6)*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 vs control group

3.5　PA诱导细胞线粒体中27-OHC水平升高

为了更好地了解饱和脂肪酸对肝细胞亚细胞器的脂毒性机制，本实验采用差速离心法分离肝细胞线粒体，并利用LC-MS/MS测定线粒体中氧甾醇水平。结果如图6所示，胆固醇和替代合成途径的中间产物27-OHC水平显著增加，而经典胆汁酸合成途径的中间产物7-OHC含量无明显变化。另外，PA对非酶途径产生的7-KC、5α，6α-Epox、5β，6β-Epox和Triol等氧甾醇含量也无显著影响。

  

Figure 6  LC-MS/MS analysis of oxysterols levels in mitochondria. Cells were treated with 0.3 mmol/L PA for 72 h. Mitochondria were separated by differential centrifugation after PA treatment. Lipids were extracted with chloroform/methanol (2∶1) mixture. Data are normalized relative to the amount of mitochondria proteins in each condition. Total ion chromatograms (TIC) of oxysterol mixture standards (A) and samples (B); (C) Determination of oxysterols content in mitochondria (x¯±s, n=3)

*P < 0.05, ***P < 0.001 vs control group

4 讨 论

NAFLD通常分为非酒精性脂肪肝（NAFL）和NASH，NASH是NAFL的一种进行性形式，涉及炎症和肝细胞损伤[

22]。肝脏胆固醇稳态失调在NAFLD/NASH的发生发展中具有重要作用，细胞内胆固醇蓄积不仅是肝脏损伤的调节因素，也是改善代谢性疾病的治疗靶点[14]。因此，深入了解疾病状态下胆固醇代谢过程对预防和治疗NAFLD具有重要意义。

一项病例对照研究结果表明，PA和油酸（oleic acid，OA）是NAFLD患者血清中含量最丰富的FFA[

23]，大多数研究使用PA或OA或FFA混合物建立体外肝脏脂肪变性模型，以模拟人体疾病状态[24-25]。在评估与病理生理状态相关的脂毒性机制的实验中，由于FFA溶解度的限制，FFA与BSA的物质的量之比不宜超过5[16]。故本研究采用PA与BSA物质的量之比为5构建HepG2细胞脂肪变性模型，探讨胆固醇代谢相关基因和蛋白表达变化，并基于细胞和亚细胞器水平观察疾病状态下胆固醇代谢过程，结果发现饱和脂肪酸诱导的细胞毒性可能与胆固醇代谢紊乱密切相关，该结果对了解NAFLD中胆固醇代谢变化具有一定的意义。

本研究首先评估了PA对HepG2细胞活力的影响，随着PA浓度与处理时间增加，对细胞毒性也明显增强。采用0.3 mmol/L PA处理72 h后，可见细胞脂滴明显累积，TG和TC含量也显著升高，这与文献[

26]的结果一致，表明肝细胞脂肪变性模型建立成功。此外，PA刺激HepG2细胞后，与胆固醇合成、摄取和外排相关mRNA表达水平未发生显著变化。而NAFLD细胞模型中胆固醇合成与之前的研究结果[15]不一致，这可能是由于胆固醇对肝脏HMG-CoA还原酶和SREBF-2的代偿性抑制，以反馈细胞内胆固醇水平的升高[27]。另外，LXRα和ABCG5 mRNA和蛋白表达水平不一致，可能是由于其转录后翻译水平发生变化（如蛋白质合成速率低或降解速率较快）而导致的[28-29]。已有研究表明NASH患者和高脂饮食诱导的大鼠肝脏胆汁酸合成相关基因，如CYP7A1，CYP8B1和CYP27A1表达水平显著增加[30]。此外，STARD1作为胆汁酸替代合成途径的限速酶，其生物学功能是将胞质中的胆固醇运输至线粒体内膜进行代谢，其可通过调控BAs的组成和水平在NASH驱动的肝癌模型中发挥重要作用[31]。本研究发现胆汁酸合成途径相关基因和蛋白表达均显著增加。这些结果表明，PA刺激HepG2细胞后胆固醇稳态失调主要表现为胆固醇外流减少和胆固醇向代谢产物BAs的转化速率增加。

为了进一步探讨细胞BAs水平是否发生了与基因和蛋白相应的变化，本研究采用LC-MS/MS测定了细胞内BAs的含量，结果发现细胞和培养液中CA、CDCA和C4含量均显著增加。与该结果一致的是Jiao等[

30]发现NAFLD患者血清CA、CDCA、DCA和UDCA水平显著升高，同时依据粪便总胆汁酸、初级胆汁酸和血清胆汁酸合成标志物C4水平升高等结果说明NAFLD患者肝脏胆汁酸合成速率增加[32]。然而，外源性CDCA可以激活Kupffer细胞释放促炎细胞因子（如TNFα和IL-1β），诱发炎症反应[33]。因此，细胞内初级胆汁酸水平升高在一定程度上会破坏细胞生长的微环境，导致肝细胞损伤，从而恶化NAFLD进程。

胆固醇在线粒体膜结构中起主要作用，可以调节线粒体膜的流动性[

34]。然而，线粒体游离胆固醇蓄积会破坏线粒体膜的完整性，导致线粒体功能障碍，从而诱导细胞凋亡[14]。此外，一些研究表明，NAFLD患者血清中由胆固醇合成胆汁酸的中间产物4β-OHC、7-OHC、24S-OHC、25-OHC和27-OHC等均具有很强的生物活性。27-OHC是由胆汁酸替代合成途径中的关键酶CYP27A1合成的一种胆固醇衍生物，可以调节巨噬细胞中SREBF-2的基因转录，进而影响胆固醇代谢[35]。27-OHC还可以作为激活LXR的生理性配体发挥一定的生物学效应。为了进一步了解氧甾醇在脂肪变性细胞模型中的变化及饱和脂肪酸对细胞的脂毒性机制，本研究采用LC-MS/MS测定线粒体氧甾醇含量，结果发现线粒体胆固醇和27-OHC水平显著增加，而其余氧甾醇均无明显改变，这可能是由于其相应的代谢酶定位在ER或其他亚细胞器中，因而在线粒体中没有观察到差异。另外，本研究结果中CYP27A1表达水平未发生显著变化，而线粒体中27-OHC含量显著升高，这可能与CYP27A1催化底物增加或胞质中介导27-OHC经硫酸化修饰进行代谢的酶表达降低有关[36]。此外，27-OHC水平升高，而LXRα蛋白表达却表现出相反趋势，这可能是因为27-OHC的激动作用仅限于Kupffer细胞，并在很大程度上依赖于LXRβ，而27-OHC在全肝中主要作为LXRα的拮抗配体，说明27-OHC对LXR的兴奋和拮抗作用是细胞特异性的[37]。这些研究结果表明，PA刺激后，线粒体胆固醇含量增加，且胆汁酸酸性合成中间体27-OHC水平同步升高，这可能通过破坏线粒体膜的完整性加重肝细胞损伤。

综上所述，本研究详细描述了胆固醇代谢相关基因和蛋白质表达情况，并系统观察了细胞胆汁酸和线粒体氧甾醇水平变化。这些发现为NAFLD疾病中肝脏胆固醇代谢变化提供了更清晰的认识。更重要的是，在该研究中发现STARD1基因和蛋白表达均显著升高，这表明胆汁酸替代合成途径在NAFLD的发展中具有重要作用。另外，目前这些发现局限于外源诱导的细胞模型，而STARD1对NAFLD发展过程中胆汁酸替代合成途径的调节作用还须通过敲除或过表达等实验来进一步验证，从而部分支持STARD1作为NAFLD治疗靶点的潜力。

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