摘要
确定2,6-二甲基苯胺为盐酸利多卡因注射液中遗传毒性杂质,N-氯乙酰-2,6-二甲基苯胺为潜在遗传毒性杂质,建立LC-MS/MS方法,用色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm 250 mm,5 μm)对原料、自制制剂及原研制剂进行遗传毒性杂质研究。研究结果表明自制制剂中杂质2,6-二甲基苯胺与N-氯乙酰-2,6-二甲基苯胺除由原料引入外,可能分别由氧化条件或碱性条件下降解引入,为盐酸利多卡因注射液的遗传毒性风险评估和工艺优化提供参考与指导。
盐酸利多卡因(lidocaine hydrochloride)为临床上常制成盐酸利多卡因注射剂应用于局部麻醉
在小分子化学药物一致性评价中,遗传毒性杂质因其毒性危害大,在极微量水平即能与体内DNA分子反应诱发DNA突变或致癌,是药物安全性评价的重要内容。遗传毒性杂质在药物制剂中主要来源于原料工艺及原辅料降解,本文根据盐酸利多卡因的结构及合成工艺,结合相关文献及研究资料确定了2,6-二甲基苯胺为遗传毒性杂质,N-氯乙酰-2,6-二甲基苯胺为潜在遗传毒性杂质。已有测定盐酸利多卡因中杂质2,6-二甲基苯胺的文献报
EX125DZH电子天平(美国奥豪斯公司);Agilent 1100高效液相色谱仪配紫外检测器、柱温箱及自动进样器(美国安捷伦公司);AB API3000单四极杆质谱检测器,配有电喷雾电离源(美国应用生物系统公司);MILLIPAK Millipore超纯水仪(德国默克公司)。
甲醇(色谱纯,德国默克公司);水(超纯水,德国默克超纯水仪自制)。盐酸利多卡因原料药(山西新宝源制药有限公司,批号:201811009、201811012、201811016);盐酸利多卡因注射液自制制剂(实验室自制,批号:190502、190503,规格:100 mg:5 mL,原料批号201811009);盐酸利多卡因注射液参比制剂(德国费森尤斯集团,批号:6120311,规格:100 mg:5 mL)。N-氯乙酰-2,6-二甲基苯胺(欧洲药典,批号:1366080,纯度99%);2,6-二甲基苯胺(英国政府化学家实验室,批号:108951,纯度99.8%)、2,6-二甲基苯基乙酰胺(批号:154427,纯度99.98%)、N-2,6-二甲基苯基-2-乙基氨基乙酰胺(批号:142855,纯度99.5%)、杂质2-二乙基叠氮酰基-N-2,6-二甲基苯基乙酰胺(批号:833116,纯度98.4%)(英国政府化学家实验室)。
色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm 250 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(80∶20)等度洗脱,流速0.3 mL/min,柱温30 ℃,进样体积20 μL。
正离子模式;采集模式:MRM;雾化器指数:8;气帘:8;碰撞气:4;离子源压力:5 000 psi;离子源温度:400 ℃。质谱参数见
取盐酸利多卡因原料药各约50 mg,置于10 mL量瓶中,分别加入1 mol/L HCl溶液2 mL、1 mol/L NaOH溶液2 mL、1%双氧水2 mL,于常温避光环境下各放置24 h进行酸、碱、氧化强制降解,另取各约10 mg,置于10 mL量瓶中,加入超纯水2 mL振摇使溶解,于60 ℃烘箱、5 000 Lx的光照试验箱下放置24 h进行高温与光照强制降解。上述强制降解溶液破坏结束后加流动相A-流动相B(70∶30)的混合溶液定容并摇匀即得。另取盐酸利多卡因原料药约50 mg,置于10 mL量瓶中,加入超纯水2 mL振摇使溶解,于常温避光环境下放置24 h后加流动相A-流动相B (70∶30)的混合溶液定容并摇匀,得未破坏供试品溶液,精密量取上述溶液适量,加流动相A-流动相B(70∶30)的混合溶液定量稀释,配制0.1%的自身对照溶液。
据文献[

Figure 1 Synthesis route of lidocaine

Figure 2 Structures of possible degradation products in lidocaine hydrochloride
A: 2,6-Dimethylbenzenamine; B: 2-Chloro-N-(2,6-dimethylphenyl)acetamide; C: N-(2,6-dimethylphenyl)acetamide; D: 2-(Diethylazinoyl)-N-(2,6-dimethylphenyl)acetamide; E: N-(2,6-dimethylphenyl)-2-(ethylamino)acetamide
针对以上文献信息,本研究从5个降解杂质中筛选出一个遗传毒性杂质与一个潜在遗传毒性杂质,详细说明如下。
杂质A为合成盐酸利多卡因的关键起始物料,其主要致突变/致癌基团为芳香胺,芳香胺易形成亲电氮离子与DNA反应产生基因突变和/或致癌。Kobets
杂质B结构中含脂肪族氯代基团,电负性的氯使其邻位的α-C易失电子形成亲电基团,该亲电基团易与DNA等亲核物质发生反应,产生基因突
本研究暂未查到杂质C相关毒性资料,根据ICH的指导原则,在缺乏安全性数据的支持下,可采用“警示结构
杂质D为盐酸利多卡因叔胺上N原子的氧化产物,目前暂未查到文献报道有关该杂质的遗传毒性数据,在ICH M7指导原则参考的警示结构列表中,无烷基叔胺氮氧化物结构,即表明在大量毒性试验中暂无证明此基团存在潜在遗传毒性的数据。综上所述,因杂质D不含警示结构,按遗传毒性分类原则将其分为5类杂质,不将其按照潜在遗传毒性杂质进行研究。
现行各国药典规定的盐酸利多卡因原料及注射液中2,6-二甲基苯胺检查法所采用的流动相中均含磷酸

Figure 3 Chromatograms of potential genotoxic impurities tests
1:Test solution (Lot:201811012); 2:Reference solution; 3:Blank solvent. A:Peak of impurity A; B:Peak of impurity B; Ⅰ:Chromatogram of total ion current; Ⅱ:Chromatogram of impurity A; Ⅲ:Chromatogram of impurity B
取各杂质对照品及盐酸利多卡因原料药、自制制剂、原研制剂照“2.1”项下方法配制混合对照品溶液与供试品溶液,按照遗传毒性杂质检测方法进样,以外标法计算各杂质含量,测定结果见
*ND:Not detected
表中结果显示,批号201811009的原料药和由该批次制成的自制制剂及批号201811012的原料药中杂质A与杂质B均有检出,批号201811016原料药仅检出杂质B。与原料及自制制剂相比,原研制剂仅检出少量的杂质A。比对各组数据,两个杂质检出量均呈现自制制剂>原料药>原研制剂的趋势。对原料药与原研制剂杂质检出量进行比对分析可知,杂质可能来源于原料生产过程中的工艺杂质,也可能来源于原料储运过程中产生的降解。而由自制制剂与原料药杂质检出量的差异判断,从原料储存―制剂制备―制剂储存的途径中,盐酸利多卡因均存在降解产生杂质A与杂质B的趋势。综合以上分析,原料生产工艺与杂质的降解均可能是导致自制制剂与原研制剂遗传毒性杂质检出情况不一致的原因。本研究主要从杂质的降解方面入手,设计原料药的强制降解试验,进一步探究上述杂质的主要降解途径和降解程度,为注射液的制备工艺和储存条件提供参考。
照上述“2.2.4”项下配制方法进行酸、碱、氧化、高温及光照强制降解试验,取各溶液于“2.1.3”条件下进样,计算强制降解供试品溶液各杂质含量与未破坏供试品溶液各杂质含量的绝对偏差,为更全面分析盐酸利多卡因降解途径,本研究将“3.1”项下涉及的5个降解杂质均进行了降解含量分析,结果如见
*ND:Not detected or changes of ontent ≤0.000%
结果显示,碱降解及氧化降解为盐酸利多卡因的主要降解途径,在较极端的酸、高温及光照条件下盐酸利多卡因较稳定。在氧化破坏条件下,主要降解产物为杂质D,其次为杂质E与杂质A,据之前分析,杂质D与杂质E无潜在遗传毒性,对盐酸利多卡因遗传毒性风险影响较低。观察盐酸利多卡因化学结构,其中含有关键基团酰胺键,试验前期笔者初步预测盐酸利多卡因易发生酰胺键的水解反应降解形成杂质A而使原料药和制剂的遗传毒性风险大大增加,但根据试验结果可以看出,在各条件下杂质A均没出现较大的降解趋势,该现象的出现可能由于苯环上邻位的两个甲基形成的空间位阻对酰胺键起了一定的保护作
综合强制降解试验结果可知,盐酸利多卡因主要在碱性条件和氧化条件下产生降解,形成杂质A和杂质B,遗传毒性风险增加。针对以上结果,可在本品制备和储存过程中针对含氧量与酸碱度进行条件优化,以减少盐酸利多卡因的降解。本研究对盐酸利多卡因自制制剂储存过程中的氧气接触时间进行了优化,在安瓿瓶熔封前向瓶内灌入高纯氮气,将瓶内注射液与空气隔绝,再进行熔封,制成批号为190503的小试批自制制剂。照“3.2”项下步骤测定两个待测杂质的含量,杂质A与杂质B检出量分别为5%与1.6%。与批号为190502的杂质含量检测结果进行比对分析,经过充氮保护后,盐酸利多卡因降解出杂质A的趋势有所下降,说明充氮保护对形成杂质A的降解途径有一定的抑制作用。而杂质B的检出量未降低,说明充氮保护不能抑制杂质B的降解。
除充氮保护外,有文献报道曾采用在制剂中添加如盐酸赖氨
本研究确定了盐酸利多卡因中遗传毒性杂质与潜在遗传毒性杂质,经检测原料药、自制制剂及原研制剂中遗传毒性杂质检出情况存在一定的差异,根据强制降解试验结果进一步确定该差异主要来源于原料生产工艺与原料药在氧化及碱性条件下的降解,通过充氮保护可一定程度减少杂质2,6-二甲基苯胺的降解,本研究对盐酸利多卡因注射液的遗传毒性风险评估和处方工艺优化提供了理论参考。
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