摘要
为了研究NDUFS7基因突变对神经元的影响,通过构建pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突变质粒,并将其转入分化后SH-SY5Y细胞。采用MTT法检测转染突变质粒对多巴胺能神经细胞活力的影响;Annexin Ⅴ-FITC/PI双染结合流式细胞术检测转染突变质粒对细胞凋亡情况的影响;Western blot法检测转染突变质粒后细胞内凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达水平的变化;采用JC-1探针检测转染突变质粒对分化后SH-SY5Y细胞内线粒体膜电位的影响及抗氧化剂Trolox的干预作用;最后PI/Hoechst双染检测Trolox对转染突变质粒的分化后SH-SY5Y细胞凋亡情况的干预作用。结果显示,多巴胺能神经细胞内线粒体复合体Ⅰ亚基突变能够导致神经细胞活力下降,凋亡增多,而抗氧化剂能够缓解转染突变质粒导致的线粒体膜电位异常和细胞凋亡,提示转染NDUFS7基因突变质粒能通过引起多巴胺能神经细胞内线粒体功能异常从而导致细胞凋亡。
线粒体是细胞内有氧呼吸的主要场所,参与了细胞代谢、信号传导、氧化应激等多种重要胞内活
NDUFS7(NADH dehydrogenase(ubiquinone)Fe-S protein 7)是由细胞核内基因编码,人类NDUFS7基因定位于19号染色体,编码的蛋白质参与构成线粒体呼吸链复合体Ⅰ,相对分子质量约为20 kD,是复合体Ⅰ疏水亚基的重要组成部
本研究通过构建pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突变质粒,转染分化后SH-SY5Y细胞,考察转染NDUFS7基因突变质粒对多巴胺能神经细胞活力、凋亡情况以及细胞内Bax、Bcl-2蛋白表达量的影响,同时采用抗氧化剂进行干预,明确转染NDUFS7基因突变质粒后可能通过影响线粒体正常功能导致多巴胺能神经细胞凋亡。
DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Gibco公司);DNA Marker(日本TaKaRa公司);Lipofectamine 3000转染试剂、蛋白预染Marker、蛋白酶和磷酸酶抑制剂(美国Thermo公司);Bax、Bcl-2抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG(美国Cell Signaling Technology公司);β-actin抗体(中国Abclonal公司);胰蛋白酶(美国Sigma公司);MTT、氨苄青霉素、链霉素、牛血清白蛋白(中国Biosharp公司);PVDF膜、ECL试剂盒(美国Millipore公司);BCA蛋白浓度检测试剂盒、RIPA细胞裂解液、一抗稀释液、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、Hoechst 33342、碘化丙啶(propidium iodide,PI)(中国碧云天生物技术研究所);其他试剂均为市售分析纯。
高速冷冻离心机、全波长酶标仪、NanoDrop 2000C超微量分光光度计(美国Thermo公司);倒置相差显微镜、倒置荧光显微镜(日本Olympus公司);TDZ5-WS台式离心机(湘仪离心机仪器有限公司);电泳仪、转膜仪(美国Bio-Rad公司);化学发光成像系统(上海天能科技有限公司);流式细胞仪(美国Becton-Dickinson公司)。
SH-SY5Y细胞于含10%胎牛血清,1×1
将人源NDUFS7基因208位谷氨酰胺密码子突变为终止密码子,与pcDNA3.1(+)质粒连接构建pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突变质粒,转化至TOP10菌株中,使用LB培养基对含有突变基因质粒的TOP10菌株进行扩增,接种于含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板上,37 ℃培养过夜,挑取阳性单克隆,于LB液体培养基中扩增并制成甘油菌保存。
将含有pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP质粒的TOP10菌株接种于LB液体培养基中,37 ℃培养至A为2.0~3.0,使用无内毒素质粒小提中量试剂盒提取质粒。使用EcoRⅠ、Xba Ⅰ对质粒进行双酶切后制样,取样品溶液10 μL于1.0%琼脂糖凝胶中上样,90 V,30 min电泳,凝胶成像仪成像并拍照。
实验分为空白对照组、pcDNA3.1(+)对照组、pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突变质粒转染组。收集生长状态良好的分化后SH-SY5Y细胞,以每毫升5×1
实验分组同“2.4”项。收集生长状态良好的分化后SH-SY5Y细胞,以每毫升5×1
实验分组同“2.4”项。按照“2.5”项中的实验方法进行分化后SH-SY5Y细胞铺板和pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突变质粒的转染。培养48 h后,提取细胞内总蛋白,Western blot检测各实验组中Bax、Bcl-2蛋白水平变化。具体步骤为:PBS洗涤细胞3次后置于冰上,每孔中加入RIPA细胞裂解液(按1∶100加入蛋白酶、磷酸酶抑制剂混合液) 100 μL;使用细胞刮刀将细胞刮下并转移至EP管中,置于冰上保存;使用涡旋仪充分振荡裂解,每3 min 1次,共30 min;置于高速冷冻离心机中,4 ℃、12 000 r/min离心10 min收集上清液即为细胞内蛋白溶液。制样后进行SDS-PAGE电泳,使用半干法将蛋白转印至PVDF膜上,3%脱脂奶粉封闭1 h,TBST洗涤3次,每次10 min;一抗4 ℃孵育过夜,TBST洗涤5次,每次5 min;二抗室温孵育2 h,TBST洗涤5次,每次5 min,ECL显色成像并拍照。
实验分为空白对照组、pcDNA3.1(+)对照组、pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突变质粒转染组、pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP+Trolox转染后给药干预组。按照“2.5”项下方法进行细胞铺板和突变质粒转染并在换液时使用终浓度为 10 μmol/L的抗氧化剂Trolox进行给药干预。细胞培养48 h后,JC-1探针检测各实验组中细胞内线粒体膜电位水平变化情况。具体步骤为:取适量JC-1(200×)探针,按每50 µL 探针加入超纯水8 mL的比例进行稀释,剧烈涡旋使之混匀,再加入JC-1染色缓冲液(5×) 2 mL充分混匀;吸去细胞培养液,使用PBS洗涤1次,每孔加入细胞培养基1 mL,再加入JC-1染色工作液1 mL,充分混匀,于37 ℃细胞培养箱中孵育20 min;吸去JC-1染色工作液,使用JC-1染色缓冲液(1×)洗涤2次,每孔加入无血清培养基2 mL,使用倒置荧光显微镜进行观察拍照。
实验分组同“2.7”项。按照“2.5”项下方法进行细胞铺板和突变质粒转染并在换液时使用终浓度为10 μmol/L抗氧化剂Trolox进行给药干预。细胞培养48 h后,PI/Hoechst双染进一步检测各实验组中细胞凋亡情况。具体步骤为:弃去6孔板中培养基,使用PBS洗涤细胞2次,每孔加入含有终浓度为7 mmol/L Hoechst 33342的DMEM高糖培养基1 000 μL于37 ℃培养箱中孵育25 min;PBS洗涤细胞2次,每孔加入含有终浓度为2 mmol/L PI的DMEM高糖培养基1 000 μL,室温下避光孵育 15 min;染色完成后,PBS洗涤3次,荧光显微镜观察并拍照。
构建pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突变质粒,采用EcoRⅠ、Xba Ⅰ双酶切,琼脂糖凝胶电泳验证质粒正确性。结果如

Figure 1 Plasmid profile(A) and the agarose gel electrophoresis of enzyme digested plasmids(B)
Line M:Marker;Line 1:pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP;Line 2:pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP digested by EcoR I and Xba I
转染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突变质粒48 h后,MTT法检测各实验组神经细胞活力。结果如

Figure 2 Cell viability after transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid in differentiated SH-SY5Y cells was analyzed by the MTT assay ()
###P<0.001 vs control group
转染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突变质粒48 h后,采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染结合流式细胞术检测各实验组细胞凋亡水平的变化。结果如

Figure 3 The cell apoptosis level after transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid in differentiated SH-SY5Y cells for 48 h ()
A:Analysis of the proportion of apoptotic cells in differentiated SH-SY5Y cells by flow cytometry;B:Quantification of apoptotic cell proportio
转染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突变质粒48 h后,采用Western blot检测各实验组细胞内Bax、Bcl-2表达量的变化。结果如

Figure 4 Effects of transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid on the levels of Bax and Bcl-2 in differentiated SH-SY5Y cells ()
A:Detection of Bax and Bcl-2 by Western blot;B:Quantitative analysis of Bax/Bcl-2
转染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突变质粒并在换液时使用终浓度为10 μmol/L的Trolox进行给药干预,孵育48 h后,采用JC-1探针检测分化后SH-SY5Y细胞内线粒体膜电位水平。结果如

Figure 5 Effects of Trolox and transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid on the mitochondrial membrane potential in differentiated SH-SY5Y cells
Scar bar:50 µm
转染pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突变质粒并在换液时使用Trolox进行给药干预,孵育48 h后,采用PI/Hoechst双染法检测各组细胞凋亡情况并使用荧光显微镜观察进行拍照。结果如

Figure 6 Effects of Trolox and transfection with pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP mutant plasmid on apoptosis in differentiated SH-SY5Y cells
Scar bar:200 µm
多巴胺能神经元是以多巴胺作为神经递质的神经元,人类大脑中约有40万个多巴胺能神经元。多巴胺能神经元参与调节机体对环境的反应,对机体运动能力、认知能力都发挥着重要作
本研究设计并构建pcDNA3.1(+)-NDUFS7 Q208STOP突变质粒,转染分化后SH-SY5Y细胞,进而影响线粒体复合体Ⅰ的正常功能,证明了哺乳动物多巴胺能神经细胞内转染NDUFS7基因突变质粒后能够导致细胞凋亡。同时,本研究揭示了抗氧化剂给药干预后能够改善转染突变质粒导致的神经细胞线粒体膜电位异常,从而降低细胞凋亡水平。以上实验结果说明转染NDUFS7基因突变质粒后,通过引起细胞内线粒体功能异常导致多巴胺能神经元凋亡,证明了突变型NDUFS7质粒导致多巴胺能神经元凋亡的作用及机制,为与多巴胺能神经元退化凋亡相关的疾病和药物研究提供新的思路和理论依据。

参 考 文 献
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