摘要
以螺旋霉素为模板分子,甲基丙烯酸和N-异丙基丙烯酰胺为功能单体,乙二醇甲基丙烯酸酯为交联剂,硅烷化的石英毛细管为载体合成了具有热敏型、可修复的分子印迹固相微萃取纤维。通过扫描电镜和氮气吸附/脱附对制备的分子印迹固相微萃取纤维进行表征,并对影响萃取效果的参数进行了优化。分子印迹固相微萃取纤维对大环内酯类抗生素具有高选择性和灵敏性,与高效液相色谱联用可对食品基质中的螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素4种大环内酯类抗生素进行定量分析,在0.5~50 μg/mL范围内,色谱峰面积与浓度呈良好的线性关系,样品在3种不同添加水平下的加标回收率在81.8%~119.1%之间,日间精密度均小于13.8%(n=6),日内精密度均小于15.5%(n=3)。
大环内酯类抗生素(macrolides antibiotics,MACs)是一类分子结构中具有12~16碳内酯环的药物总称,主要用于治疗需氧革兰阳性球菌和革兰阴性球菌感染所引发的疾
MACs结构中缺乏发色团,紫外响应弱,不能使用紫外检测器对含量低的样品直接定量检
分子印迹聚合物(molecular imprinting polymer,MIPs)是一种稳定性高、具有特异识别功能的新材料,可通过模板分子和功能单体与交联剂聚合而获得。聚合后移除模板分子,会留下特定的空穴,可以根据大小、形状和功能基团选择性地“锁定”并富集目标化合物,适用于各种复杂样品的前处理。近年来,报道了多种分子印迹材料对食品样品中的红霉素或替米考星进行选择性富集的材料,诸如磁性分子印迹聚合
替米考星(TILM)、螺旋霉素(SPI)、交沙霉素(JOS)、泰乐菌素(TYL)(德国Dr.Ehrenstorfer公司);阿奇霉素(AZI)、克拉霉素(CLA)、罗红霉素(ROX)(中国食品药品检定研究院);磺胺嘧啶(美国Alfa Aesar公司);盐酸土霉素、恩诺沙星、偶氮二异丁腈(美国Sigma-Aldrich公司);3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(美国Acros公司);N-异丙基丙烯酰胺(上海麦克林生化科技有限公司);甲基丙烯酸(MAA)、4-乙烯基吡啶、丙烯酰胺、乙二醇甲基丙烯酸酯(中国上海阿拉丁试剂有限公司);甲醇、乙腈均为色谱纯;其余试剂均为分析纯。实验用水由Milli-R04净化系统(美国Millipore公司)制得。
准确称取适量7种MACs标准品,用甲醇-水(20∶80)溶解并定容,配制成1 mg/mL的标准储备液,于4 ℃冰箱中保存,在使用前用20 mmol/L K2HPO4溶液(pH 7.4)稀释定容制成混合标准工作液。恩诺沙星、磺胺嘧啶和盐酸土霉素除用甲醇溶解外,其余处理方法均与MACs相同。
截取长约4 cm的石英毛细管(50 μm × 365 μm),火烧去除一半长度的外壁保护层。将毛细管依次浸泡在1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液中、去离子水洗至中性后氮气吹干。毛细管硅烷化过程参照文献[
热敏型MIP-fiber参照文献[
非印迹固相微萃取纤维(NIP-fibers)的制备过程中不加入SPI,其余合成步骤与MIP-fibers相同。
MACs是一种碱性抗生素,用普通的C18色谱柱通常会出现拖尾现象,因此选用表面带正电荷的Acchrom XCharger-C18型反相色谱柱(150 mm × 4.6 mm,5 μm)来解决该问题。流动相:乙腈(A),0.02%磷酸水溶液(B);梯度洗脱程序:0~9 min,A相从5%到44%;柱温:30 ℃;流速:1 mL/min;进样体积:10 μL;检测波长:通道1(283 nm),通道2(232 nm),如

Figure 1 Separation of 4 macrolides antibiotics (MACs)
A:Spiramycin (SPI);B:Josamycin (JOS);C:Tilmicosin (TILM);D:Tylosin(TYL)
用4种不同来源的蜂蜜样品来评价MIP-fiber的富集效果,选择洋槐花蜂蜜作为空白样品(经检测该蜂蜜不含目标抗生素)。样品预处理方法如下:称取空白样品2 g(精确至0.01 g),置于10 mL离心管中,加入20 mmol/L K2HPO4(pH 7.4)缓冲溶液5 mL,充分涡旋混合30 s后,以4 500 r/min离心10 min,收集上清液,作为SPME上样液。
净化流程如

Figure 2 Purification process of sample
去除模板分子是制备分子印迹材料中最关键的一步,但是通常存在耗时较长和难去除彻底的问题,为此,以甲醇-乙酸(8∶1)作为洗脱液,测试了两种不同的去模板方法。(1)振荡法:将3~5根MIP-fiber放进加有洗脱液的离心管中,以200 r/min的条件振荡24 h,每8 h更换一次洗脱液。该方法可有效去除SPI,但所需时间长,在振荡过程中纤维之间的摩擦容易造成MIP材料的损失。(2)涡旋法:采用相同的洗脱液涡旋洗脱5 min,重复该洗脱过程直至无模板被检出。采用该方法使得萃取纤维在洗脱液中高速旋转,可快速去除模板分子且不会损失涂层材料,所以选择涡旋法去除模板分子。
分别以MAA、丙烯酰胺(AM)、4-乙烯基吡啶(4-VP)为功能单体,改变模板与功能单体之间的物质的量比制备5种MIP-fibers,将制得的MIP-fibers分别放入20 μg/mL SPI溶液5.0 mL中,45 ℃水浴条件下萃取120 min后使用高效液相色谱法测定溶液中SPI的浓度,结果如
AM:Acrylamide;4-VP:-Vinylpyridine;MAA:Methacrylic acid

Figure 3 Photographs and SEM images of molecular imprinting polymer(MIP)-fiber and non-imprinting polymers (NIP)-fiber
A:Fibers after molecular imprinting (1) and before molecular imprinting (2);B:Morphology of MIP-fiber;C:Morphology of NIP-fiber;D:SEM image of MIP-fiber in dry condition
采用氮气吸附孔隙度测定法测定MIP/NIP材料的比表面积和孔容,MIP、NIP的比表面积分别为130.928、1.761
吸附容量和速率是影响固相微萃取吸附剂性能的重要因素。
分别将一根MIP-fiber/NIP-fiber放入装有30~900 μg/mL SPI溶液5 mL的离心管中,密封后45 ℃水浴条件下搅拌24 h。HPLC-UV测定溶液中SPI的残留量,并根据
(1) |
其中:c(mg/mL)、ct(mg/mL)分别代表SPI初始、结束时的质量浓度;V(mL)代表样品体积; m(g)代表涂层质量。
得到结果如

Figure 4 Adsorption isotherms (A) and adsorption kinetic (B) curves of SPI on MIP-fibers and NIP-fibers (n=3)
将一根MIP-fiber/NIP-fiber放入100 μg/mL SPI溶液25.0 mL中,密封后45 ℃水浴条件下搅拌240 min,分别在1、5、10、15、20、25、60、90和240 min时进行取样,检测SPI的浓度。得到结果如
固相萃取通常包括萃取、淋洗和洗脱3步,为了得到最佳富集效果,本研究对几个可能影响萃取效率的参数进行了优化。除特殊说明外,其他样品处理及固相微萃取条件均采用“2.4”和“2.5”项中方法,并重复操作3次。
由于N-异丙基丙烯酰胺和MAA的加入,使得MIP-fiber同时具有pH和温度响应的立体选择性。其根本原因为温度会改变MIP聚合物内部孔道的大小,使得MIP-fiber在较低温度下膨胀,在较高温度下收缩,从而与目标化合物的匹配程度不同。为此研究了MIP-fiber在不同温度下对4种MACs的吸附情况,结果如

Figure 5 Effect of temperature (A), pH(B), eluent (C) and percentage of acetic acid (D) on solid-phase microextraction (SPME) efficiency (n=3)
蜂蜜溶液的pH在3附近,因此本实验选择pH为3~10的K2HPO4缓冲盐溶液(20 mmol/L)对蜂蜜进行稀释后进行萃取,结果如
良好的淋洗溶液可以在不影响目标物回收率的前提下洗去非特异性保留的物质,从而达到屏蔽基质及其他杂质干扰的目的。本研究使用4种不同的淋洗溶液,结果如
3.5.4 洗脱条件 为了尽量将目标物完全洗脱,从而得到满意的回收率,对洗脱溶液的种类及比例进行了考察。选取甲醇、丙酮、乙醇和乙腈4种洗脱溶液,结果发现使用乙腈溶液进行洗脱效果最好;进一步考察了乙腈中乙酸比例的影响,洗脱液中待测物峰面积如
固相微萃取的富集原理是目标物在样品基质和吸附层之间达到分配平衡,因此溶液中目标物的质量浓度会影响萃取效率。本研究控制SPI总量为10 μg,配制体积分别为5、20、200 mL 3种不同质量浓度的溶液,探究在不同质量浓度下MIP-fiber/NIP-fiber对目标物的富集效果,目标分子的富集因子EF通过
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其中:c0和c1分别为标准溶液直接进样的质量浓度及富集前样品溶液的质量浓度;A0和A1分别为直接进样得到的峰面积及富集后的峰面积大小。
结果见

Figure 6 Effects of loading volume on the extraction efficiency
Inset:Chromatogram of (A) injection after SPME treatment (5 mL of 2 μg/mL spiramycin standard solution with 2 g honey sample),(B) 10 µg/mL spiramycin standard solution,and (C) direct injection without SPME treatment (5 mL of 2 μg/mL spiramycin standard solution with 2 g honey sample)
为了验证MIP-fiber可以对MACs进行特异性选择,选取SPI和蜂蜜中常被检测到的3类非大环内酯类抗生素(磺胺嘧啶、恩诺沙星、盐酸土霉素)添加到基质中进行测试。3类非大环内酯类抗生素的浓度均为5 mg/kg,SPI的浓度为0.5 mg/kg。实验结果如

Figure 7 Selectivity of MIP-fibers to non-macrolide antibiotics and macrolide antibiotic
A:Enrofloxacin;B:Oxytetracycline hydrochloride;C:Sulfadiazine;D:Spiramycin (a is direct injection and b is the eluted fraction after SPME treatment)
为了验证MIP-HPLC-UV检测方法的可行性,在蜂蜜样品中制备一系列含不同浓度的SPI、JOS、TYL和TILM的基质匹配混合标准溶液。如
SPI:Spiramycin;TILM:Tilmicosin;JOS:Josamycin;TYL:Tylosin
采用MIP-HPLC-UV法对当地购买的蜂蜜样品进行检测,4种蜂蜜中均未检测到MACs。为了验证检测方法的正确性,本研究在蜂蜜样品中进行1.25、12.5和125 mg/kg 3个浓度的加标试验,结果如
上述结果已经证明了MIP-HPLC-UV可以用于检测蜂蜜中MACs的含量以及MACs是否存在超标问题。由于大多数MACs紫外响应非常弱,上述方法无法实现多种痕量MACs的同时定量检测。因此本研究进一步发展了基于MIP-fiber的7种MACs的液质联用(HPLC-MS/MS)定量方法,线性范围和检测限如
AZI:Zithromycin; CLA:Clarithromycinrox; ROX:Roxithromycincla
采用所开发的MIP-HPLC-MS/MS法对上述 4种蜂蜜样品的检测结果如
n.d.:Not detected
本研究合成了一种具有pH和温度响应的MIP-fibers,建立了一种快速、高效测定蜂蜜样品中MACs的方法。该纤维具有一定的自修复功能,对MACs具有良好的吸附性和选择性,可采用涡旋法快速去除模板和洗脱目标物。样品预处理简单、经济、节省溶剂、节约时间,为分析蜂蜜样品中痕量MACs的残留提供了一种有效的方法。同时该MIP-fibers对MACs具有较好的富集浓缩能力,适用于大体积样品的现场采样及富集浓缩,将其与液相色谱串联质谱联用可实现痕量MACs的高灵敏检测,后续实验中也将进一步拓展该材料的应用。
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