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热敏型可修复分子印迹固相微萃取纤维的制备及其应用

  • 郭跃龙 1
  • 吴丹 2
  • 郑枫 2
  • 纪顺利 2
1. 江苏省省级机关医院药剂科,南京 210024; 2. 中国药科大学药物分析教研室,南京 210009

中图分类号: R917O658

最近更新:2020-12-25

DOI:10.11665/j.issn.1000-5048.20200609

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摘要

以螺旋霉素为模板分子,甲基丙烯酸和N-异丙基丙烯酰胺为功能单体,乙二醇甲基丙烯酸酯为交联剂,硅烷化的石英毛细管为载体合成了具有热敏型、可修复的分子印迹固相微萃取纤维。通过扫描电镜和氮气吸附/脱附对制备的分子印迹固相微萃取纤维进行表征,并对影响萃取效果的参数进行了优化。分子印迹固相微萃取纤维对大环内酯类抗生素具有高选择性和灵敏性,与高效液相色谱联用可对食品基质中的螺旋霉素、替米考星、泰乐菌素、交沙霉素4种大环内酯类抗生素进行定量分析,在0.5~50 μg/mL范围内,色谱峰面积与浓度呈良好的线性关系,样品在3种不同添加水平下的加标回收率在81.8%~119.1%之间,日间精密度均小于13.8%(n=6),日内精密度均小于15.5%(n=3)。

大环内酯类抗生素(macrolides antibiotics,MACs)是一类分子结构中具有12~16碳内酯环的药物总称,主要用于治疗需氧革兰阳性球菌和革兰阴性球菌感染所引发的疾

1,不良反应包括消化道症状、肝毒性、心脏毒性等。日常生产生活中,抗生素常被添加到饲料中促进动物生长,部分没有代谢的抗生素最终在人体内蓄积,进而影响人体健康。许多国家的监管机构都制定了食品基质中MACs的最大残留限定(MRLs),因此,开发快速有效的食品基质中MACs的定量检测技术非常必要。

MACs结构中缺乏发色团,紫外响应弱,不能使用紫外检测器对含量低的样品直接定量检

2;此外,食品基质复杂,可能会干扰目标物的检测。为富集目标物以及屏蔽基质干扰,需要开发合适的样品前处理方法。常用的样品前处理方法有固相萃3-4、基质分散固相萃5、QuEChERS6和固相微萃取(SPME)等。其中,SPME是一种集采样、萃取和浓缩于一体的方法,适用于痕量化合物的提取和净化。SPME的核心在于萃取头,传统萃取头以非特异性吸附为主,选择性、热稳定性和化学稳定性差,因此制备可重复利用、具有良好选择性和稳定性的新型涂层材料是非常值得关注的。

分子印迹聚合物(molecular imprinting polymer,MIPs)是一种稳定性高、具有特异识别功能的新材料,可通过模板分子和功能单体与交联剂聚合而获得。聚合后移除模板分子,会留下特定的空穴,可以根据大小、形状和功能基团选择性地“锁定”并富集目标化合物,适用于各种复杂样品的前处理。近年来,报道了多种分子印迹材料对食品样品中的红霉素或替米考星进行选择性富集的材料,诸如磁性分子印迹聚合

5、固相萃7和固相微萃取(SPME8等。但目前尚无有关热敏型、可修复的分子印迹固相微萃取纤维(MIP- fibers)制备方法的报道。本研究以螺旋霉素为模板分子,N-异丙基丙烯酰胺和甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇甲基丙烯酸酯为交联剂,硅烷化的石英毛细管为载体合成了具有热敏型、可修复的、能够特异性识别MACs的MIP-fibers,并用其同时检测食品基质中多种MACs。

1 材 料

1.1 试 剂

替米考星(TILM)、螺旋霉素(SPI)、交沙霉素(JOS)、泰乐菌素(TYL)(德国Dr.Ehrenstorfer公司);阿奇霉素(AZI)、克拉霉素(CLA)、罗红霉素(ROX)(中国食品药品检定研究院);磺胺嘧啶(美国Alfa Aesar公司);盐酸土霉素、恩诺沙星、偶氮二异丁腈(美国Sigma-Aldrich公司);3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(美国Acros公司);N-异丙基丙烯酰胺(上海麦克林生化科技有限公司);甲基丙烯酸(MAA)、4-乙烯基吡啶、丙烯酰胺、乙二醇甲基丙烯酸酯(中国上海阿拉丁试剂有限公司);甲醇、乙腈均为色谱纯;其余试剂均为分析纯。实验用水由Milli-R04净化系统(美国Millipore公司)制得。

1.2 仪 器

Alliance 2695高效液相色谱仪(美国Waters公司);FESEM NOVA NanoSEM450扫描电子显微镜(美国FEI公司);TriStarII 3020TM 比表面积和孔体积分析仪(美国Micromeritic公司)。

2 方 法

2.1 溶液配制

准确称取适量7种MACs标准品,用甲醇-水(20∶80)溶解并定容,配制成1 mg/mL的标准储备液,于4 ℃冰箱中保存,在使用前用20 mmol/L K2HPO4溶液(pH 7.4)稀释定容制成混合标准工作液。恩诺沙星、磺胺嘧啶和盐酸土霉素除用甲醇溶解外,其余处理方法均与MACs相同。

2.2 MIP-fibers的制备

截取长约4 cm的石英毛细管(50 μm × 365 μm),火烧去除一半长度的外壁保护层。将毛细管依次浸泡在1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液中、去离子水洗至中性后氮气吹干。毛细管硅烷化过程参照文献[

9]中方法:将上述毛细管浸泡在3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷-丙酮(1∶9)溶液中2 h后,100 ℃下干燥2 h。

热敏型MIP-fiber参照文献[

10]中的最佳实验条件制得:称取SPI 0.1 mmol、甲基丙烯酸0.42 mmol、N-异丙基丙烯酰胺0.4 mmol溶于二甲基亚砜-氯仿(1∶2)溶液3 mL中,混合均匀后加入乙二醇甲基丙烯酸酯2 mmol和偶氮二异丁腈10 mg,即得预聚合物溶液。将毛细管硅烷化的一端插入 2 cm长的玻璃管(0.9~1.1 mm)后,放进4 mL的离心管中,加入制备好的预聚合物溶液,60 ℃水浴条件下反应24 h。待反应结束后,将毛细管从玻璃管中推出,即得MIP-fiber。将MIP-fiber浸入乙酸-甲醇(1∶4)中,涡旋5 min后去除模板分子后保存在甲醇中,待后续实验使用。

非印迹固相微萃取纤维(NIP-fibers)的制备过程中不加入SPI,其余合成步骤与MIP-fibers相同。

2.3 色谱条件

MACs是一种碱性抗生素,用普通的C18色谱柱通常会出现拖尾现象,因此选用表面带正电荷的Acchrom XCharger-C18型反相色谱柱(150 mm × 4.6 mm,5 μm)来解决该问题。流动相:乙腈(A),0.02%磷酸水溶液(B);梯度洗脱程序:0~9 min,A相从5%到44%;柱温:30 ℃;流速:1 mL/min;进样体积:10 μL;检测波长:通道1(283 nm),通道2(232 nm),如图1

Figure 1 Separation of 4 macrolides antibiotics (MACs)

注:

A:Spiramycin (SPI);B:Josamycin (JOS);C:Tilmicosin (TILM);D:Tylosin(TYL)

2.4 样品预处理

用4种不同来源的蜂蜜样品来评价MIP-fiber的富集效果,选择洋槐花蜂蜜作为空白样品(经检测该蜂蜜不含目标抗生素)。样品预处理方法如下:称取空白样品2 g(精确至0.01 g),置于10 mL离心管中,加入20 mmol/L K2HPO4(pH 7.4)缓冲溶液5 mL,充分涡旋混合30 s后,以4 500 r/min离心10 min,收集上清液,作为SPME上样液。

2.5 净 化

净化流程如图2所示:将制备好的萃取纤维(MIP-fiber或NIP-fiber)浸没在样品溶液中,500 r/min下搅拌60 min。然后将纤维取出,用乙腈-水 (1∶4)1.5 mL淋洗,最后采用涡旋法45 ℃条件下洗脱2 min,洗脱液为乙酸-乙腈(1∶4)1.5 mL。洗脱液氮气吹干后,用甲醇-水(1∶4)200 μL复溶,进行紫外检测。

Figure 2 Purification process of sample

3 结果与讨论

3.1 去除模板分子

去除模板分子是制备分子印迹材料中最关键的一步,但是通常存在耗时较长和难去除彻底的问题,为此,以甲醇-乙酸(8∶1)作为洗脱液,测试了两种不同的去模板方法。(1)振荡法:将3~5根MIP-fiber放进加有洗脱液的离心管中,以200 r/min的条件振荡24 h,每8 h更换一次洗脱液。该方法可有效去除SPI,但所需时间长,在振荡过程中纤维之间的摩擦容易造成MIP材料的损失。(2)涡旋法:采用相同的洗脱液涡旋洗脱5 min,重复该洗脱过程直至无模板被检出。采用该方法使得萃取纤维在洗脱液中高速旋转,可快速去除模板分子且不会损失涂层材料,所以选择涡旋法去除模板分子。

3.2 MIP-fibers制备条件的优化

分别以MAA、丙烯酰胺(AM)、4-乙烯基吡啶(4-VP)为功能单体,改变模板与功能单体之间的物质的量比制备5种MIP-fibers,将制得的MIP-fibers分别放入20 μg/mL SPI溶液5.0 mL中,45 ℃水浴条件下萃取120 min后使用高效液相色谱法测定溶液中SPI的浓度,结果如表1所示,可以看出MAA作为单体时的吸附能力最强;模板分子与MAA的物质的量比为1∶4.2时达到最大吸附量82.5%。

Table 1 Optimization of functional monomer

Functional

monomer

n(template)∶n(functional monomer)

Adsorption

capacity/%

AM 1∶4.2 5.7
4-VP 1∶4.2 5.1
MAA 1∶1.2 42.6
MAA 1∶2.4 58.1
MAA 1∶4.2 82.5
注:

AM:Acrylamide;4-VP:-Vinylpyridine;MAA:Methacrylic acid

3.3 表 征

图3-A为MIP反应前后毛细管的对比照片,经MIP反应后,毛细管外可见均匀的印迹聚合物涂层。MIP-fiber和NIP-fiber的扫描电子显微镜照片(SEM)如图3所示,相较于NIP(图3-C),MIP(图3-B)具有更多的孔隙结构和更高的交联度,因此具有更大的表面积,从而有较高的吸附容量。MIP-fiber干燥状态下的SEM如图3-D所示,可以观察到许多断层,说明聚合物材料在干燥环境和溶液中的柔韧性不同,这与实际应用过程中发现的现象是一致的。有趣的是将干燥后断裂的MIP-fibers浸泡在甲醇溶液中一段时间后,纤维上的断层消失,恢复到刚制备出来的形态。因此,判断MIP-fibers有自修复功能。

Figure 3 Photographs and SEM images of molecular imprinting polymer(MIP)-fiber and non-imprinting polymers (NIP)-fiber

注:

A:Fibers after molecular imprinting (1) and before molecular imprinting (2);B:Morphology of MIP-fiber;C:Morphology of NIP-fiber;D:SEM image of MIP-fiber in dry condition

采用氮气吸附孔隙度测定法测定MIP/NIP材料的比表面积和孔容,MIP、NIP的比表面积分别为130.928、1.761 m2/g,孔容分别为0.294、0.017 cm3/g。与SEM检测所得到的结果相同,MIP材料的比表面积远远大于MIP材料,这充分说明所制备的MIP-fiber非常适合于样品前处理。

3.4 静态吸附和吸附动力学实验

吸附容量和速率是影响固相微萃取吸附剂性能的重要因素。

3.4.1 静态吸附实验

分别将一根MIP-fiber/NIP-fiber放入装有30~900 μg/mL SPI溶液5 mL的离心管中,密封后45 ℃水浴条件下搅拌24 h。HPLC-UV测定溶液中SPI的残留量,并根据公式(1)计算MIP-fiber/NIP-fiber吸附容量。

Q=(c-ct)Vm (1)

其中:c(mg/mL)、ct(mg/mL)分别代表SPI初始、结束时的质量浓度;V(mL)代表样品体积; m(g)代表涂层质量。

得到结果如图4-A所示,在SPI浓度较低时二者差异很小,随着初始溶液中SPI浓度的增加,二者的吸附量都有所提高,但是MIP-fiber比NIP-fiber提高得更明显,表明MIP-fiber的吸附性能优于NIP-fiber。

Figure 4 Adsorption isotherms (A) and adsorption kinetic (B) curves of SPI on MIP-fibers and NIP-fibers (n=3)

3.4.2 吸附动力学实验

将一根MIP-fiber/NIP-fiber放入100 μg/mL SPI溶液25.0 mL中,密封后45 ℃水浴条件下搅拌240 min,分别在1、5、10、15、20、25、60、90和240 min时进行取样,检测SPI的浓度。得到结果如图4-B所示,MIP-fiber在60 min内达到吸附平衡,NIP-fiber在240 min后仍未达到吸附平衡,表明MIP-fiber具有更稳定的吸附性能。

3.5 萃取条件的考察

固相萃取通常包括萃取、淋洗和洗脱3步,为了得到最佳富集效果,本研究对几个可能影响萃取效率的参数进行了优化。除特殊说明外,其他样品处理及固相微萃取条件均采用“2.4”和“2.5”项中方法,并重复操作3次。

3.5.1 温度的影响

由于N-异丙基丙烯酰胺和MAA的加入,使得MIP-fiber同时具有pH和温度响应的立体选择性。其根本原因为温度会改变MIP聚合物内部孔道的大小,使得MIP-fiber在较低温度下膨胀,在较高温度下收缩,从而与目标化合物的匹配程度不同。为此研究了MIP-fiber在不同温度下对4种MACs的吸附情况,结果如图5-A所示,验证了以上结论,同时在45 ℃时MIP-fiber与模板分子SPI的匹配程度最高,因此在后续试验中采取45 ℃作为萃取温度。

Figure 5 Effect of temperature (A), pH(B), eluent (C) and percentage of acetic acid (D) on solid-phase microextraction (SPME) efficiency (n=3)

3.5.2 pH的影响

蜂蜜溶液的pH在3附近,因此本实验选择pH为3~10的K2HPO4缓冲盐溶液(20 mmol/L)对蜂蜜进行稀释后进行萃取,结果如图5-B所示。萃取体系pH逐渐升高,4种MACs的萃取效率均呈现“先升后降”趋势,并在pH 7.4时达到最高,因此,后续实验中,使用pH为7.4的K2HPO4溶作为蜂蜜的稀释溶液。

3.5.3 淋洗条件

良好的淋洗溶液可以在不影响目标物回收率的前提下洗去非特异性保留的物质,从而达到屏蔽基质及其他杂质干扰的目的。本研究使用4种不同的淋洗溶液,结果如图5-C所示,4种淋洗溶液均会对目标物造成一定的损失,但去离子水和乙腈淋洗后损失较少,分别损失0.15%和4.46%。因此进一步研究了乙腈与水不同比例时对MACs回收率的影响,发现乙腈-水(1∶4)溶液能有效消除基质干扰,且无MACs的损失。最终选择乙腈-水(1∶4)作为后续实验的淋洗溶剂。

3.5.4 洗脱条件 为了尽量将目标物完全洗脱,从而得到满意的回收率,对洗脱溶液的种类及比例进行了考察。选取甲醇、丙酮、乙醇和乙腈4种洗脱溶液,结果发现使用乙腈溶液进行洗脱效果最好;进一步考察了乙腈中乙酸比例的影响,洗脱液中待测物峰面积如图5-D所示,乙酸含量在 0%~20%之间时,增加乙酸用量可提高洗脱效果,并在20%时达到最大值,因此选择乙酸-乙腈(1∶4)作为后续实验的洗脱溶液。

3.6 富集倍数测定

固相微萃取的富集原理是目标物在样品基质和吸附层之间达到分配平衡,因此溶液中目标物的质量浓度会影响萃取效率。本研究控制SPI总量为10 μg,配制体积分别为5、20、200 mL 3种不同质量浓度的溶液,探究在不同质量浓度下MIP-fiber/NIP-fiber对目标物的富集效果,目标分子的富集因子EF通过公式(2)计算得到:

EF=A1×c0A0×c1 (2)

其中:c0c1分别为标准溶液直接进样的质量浓度及富集前样品溶液的质量浓度;A0A1分别为直接进样得到的峰面积及富集后的峰面积大小。

结果见图6,可以看出MIP-fiber对MACs具有较好的富集浓缩能力,尤其是在低浓度条件下,MIP-fiber的富集效果明显优于NIP-fiber。

Figure 6 Effects of loading volume on the extraction efficiency

注:

Inset:Chromatogram of (A) injection after SPME treatment (5 mL of 2 μg/mL spiramycin standard solution with 2 g honey sample),(B) 10 µg/mL spiramycin standard solution,and (C) direct injection without SPME treatment (5 mL of 2 μg/mL spiramycin standard solution with 2 g honey sample)

3.7 选择性实验

为了验证MIP-fiber可以对MACs进行特异性选择,选取SPI和蜂蜜中常被检测到的3类非大环内酯类抗生素(磺胺嘧啶、恩诺沙星、盐酸土霉素)添加到基质中进行测试。3类非大环内酯类抗生素的浓度均为5 mg/kg,SPI的浓度为0.5 mg/kg。实验结果如图7所示,使用MIP-fiber富集后,3种非大环内酯类抗生素峰响应不升反降,说明MIP-fiber对以上干扰物几乎无富集作用,但对SPI的富集效果非常好。在某种程度上确认了MIP-fiber上存在特异性识别位点,可以选择性富集目标物、降低杂质效应、排除基质干扰。

Figure 7 Selectivity of MIP-fibers to non-macrolide antibiotics and macrolide antibiotic

注:

A:Enrofloxacin;B:Oxytetracycline hydrochloride;C:Sulfadiazine;D:Spiramycin (a is direct injection and b is the eluted fraction after SPME treatment)

3.8 线性范围与检出限

为了验证MIP-HPLC-UV检测方法的可行性,在蜂蜜样品中制备一系列含不同浓度的SPI、JOS、TYL和TILM的基质匹配混合标准溶液。如表2所示,在0.5~50 μg/mL的线性范围内,该方法对4种MACs均表现出良好的线性,相关系数r2高于0.99。在抗生素残留分析中,方法的灵敏度通常表示为检测限(LOD)和定量限(LOQ)。在这项研究中,以特征色谱峰的信噪比S/N ≥ 3和S/N ≥ 10分别为方法的LOD和LOQ,4种MACs的LOD范围为23.8~85.4 μg/kg,而LOQ范围为79.2~284.5 μg/kg。

Table 2 Linear range,LODs and LOQs of MACs by HPLC-UV (n=3)
CompoundLinear equations

Linear range/

(μg/mL)

r2

LOQ/

(µg/kg)

LOD/

(µg/kg)

SPI y = 42 472x + 183 484 0.5‒50 0.990 7 79.2 23.8
TILM y = 48 583x + 121 621 0.5‒50 0.992 7 109.2 32.8
JOS y = 62 830x + 133 823 0.5‒50 0.992 2 130.7 39.2
TYL y = 17 493x + 35 809 0.5‒50 0.993 2 284.5 85.4
注:

SPI:Spiramycin;TILM:Tilmicosin;JOS:Josamycin;TYL:Tylosin

3.9 方法应用

采用MIP-HPLC-UV法对当地购买的蜂蜜样品进行检测,4种蜂蜜中均未检测到MACs。为了验证检测方法的正确性,本研究在蜂蜜样品中进行1.25、12.5和125 mg/kg 3个浓度的加标试验,结果如表3所示,目标化合物的回收率(81.8%~119.1%)较好,日间精密度小于13.8%(n=6),日内精密度小于15.5%(n=3),回收率高、重复性好,可用于蜂蜜样品中MACs的测定。

Table 3 Precision and reproducibility of MACs
Compound

Spiked level/

(mg/kg)

Inter-day (n=3)Intra-day (n=6)
Recovery/%RSDRecovery/%RSD
SPI 1.25 87.4 11.9 99.5 10.0
12.5 111.8 9.5 119.1 9.2
125 94.5 10.0 100.8 6.2
TILM 1.25 81.8 9.8 86.0 6.9
12.5 101.7 10.5 107.7 12.3
125 102.0 10.4 111.9 10.2
JOS 1.25 95.2 9.0 104.3 7.6
12.5 101.4 7.7 106.7 7.8
125 101.4 7.9 105.4 5.7
TYL 1.25 99.3 15.5 108.8 13.8
12.5 100.2 15.4 115.5 13.8
125 97.2 12.0 106.6 9.9

3.10 液质联用方法验证

上述结果已经证明了MIP-HPLC-UV可以用于检测蜂蜜中MACs的含量以及MACs是否存在超标问题。由于大多数MACs紫外响应非常弱,上述方法无法实现多种痕量MACs的同时定量检测。因此本研究进一步发展了基于MIP-fiber的7种MACs的液质联用(HPLC-MS/MS)定量方法,线性范围和检测限如表4所示,更低的检测限和线性范围填补了HPLC-UV的空白,使用者可以根据自身条件、目的及要求对仪器进行选择。

Table 4 Calibration curves,LODs and LOQs of macrolide antibiotics by HPLC-MS/MS (n=3)
CompoundLinear equations

Linear range/

(µg/kg)

r2

LOQ/

(µg/kg)

LOD/

(µg/kg)

AZI y = 1 121.8x - 2 647.5 0.4‒40 0.999 2 0.044 0.013
SPI y = 976.5x + 9 403.5 0.4‒40 0.999 0 0.029 0.009
TILM y = 127.57x - 2 313.1 0.4‒40 0.998 8 0.197 0.059
CLA y = 2 192.9x + 6 714.1 0.4‒40 0.999 8 0.031 0.009
JOS y = 890.4x - 2 518.8 0.4‒40 0.999 5 0.067 0.020
ROX y = 311.1x - 649.8 0.4‒40 0.999 9 0.079 0.024
TYL y = 206.6x - 1 532.9 0.4‒40 0.993 9 0.110 0.034
注:

AZI:Zithromycin; CLA:Clarithromycinrox; ROX:Roxithromycincla

采用所开发的MIP-HPLC-MS/MS法对上述 4种蜂蜜样品的检测结果如表5所示,仅样品4(洋槐花蜂蜜)中未检测到MACs,其他3种蜂蜜中均含有不同浓度的MACs,但均未超过国家限定标准。

Table 5 Result of the proposed method for honey samples
Actual samples

AZI/

(μg/kg)

SPI/

(μg/kg)

TILM/

(μg/kg)

CLA/

(μg/kg)

JOS/

(μg/kg)

ROX/

(μg/kg)

TYL/

(μg/kg)

Sample 1 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. 1.9
Sample 2 n.d. n.d. 3.2 n.d. n.d. 0.56 n.d.
Sample 3 n.d. 1.09 n.d. n.d. 2.6 n.d. 1.7
Sample 4 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.
注:

n.d.:Not detected

4 结 论

本研究合成了一种具有pH和温度响应的MIP-fibers,建立了一种快速、高效测定蜂蜜样品中MACs的方法。该纤维具有一定的自修复功能,对MACs具有良好的吸附性和选择性,可采用涡旋法快速去除模板和洗脱目标物。样品预处理简单、经济、节省溶剂、节约时间,为分析蜂蜜样品中痕量MACs的残留提供了一种有效的方法。同时该MIP-fibers对MACs具有较好的富集浓缩能力,适用于大体积样品的现场采样及富集浓缩,将其与液相色谱串联质谱联用可实现痕量MACs的高灵敏检测,后续实验中也将进一步拓展该材料的应用。

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