摘要
研制他唑巴坦杂质A国家标准物质，为提高国内他唑巴坦的质量控制标准提供依据。对他唑巴坦杂质A进行合成，利用红外、质谱、核磁共振波谱技术进行结构确认，并对杂质A进行含量均匀性检查和短期稳定性考察，再测定其水分和炽灼残渣含量，并以10 mmol/L醋酸铵溶液-乙腈（98∶2）为流动相的高相液相色谱法测定杂质A的纯度，应用质量平衡法确定首批他唑巴坦杂质A国家标准物质的含量，同时采用核磁共振波谱定量法测定其含量，与质量平衡法结果相互验证。结果发现，本研究所研制的他唑巴坦杂质A标准物质与《中华人民共和国药典：二部》（2015年版）他唑巴坦系统适用性溶液中最大降解杂质和USP41中收载的他唑巴坦有关物质A标准物质结构一致；在95%置信范围内，分装后杂质A的瓶间和瓶内方差之比为0.61（小于F0.05（11，12）），均匀性良好；杂质A中有机杂质含量为0.90%，水分含量为1.24%，无机杂质含量为0.25%，以质量平衡法确定杂质A含量为97.6%，与核磁共振波谱定量法结果97.1%基本一致；在25 ℃条件下，杂质A面积归一化纯度在0、3、5和10 d的均值均为99.1%，证明样品在室温下10 d内稳定。本研究首次制备了他唑巴坦杂质A国家标准物质。
国家药品标准物质系指供国家法定药品标准中药品的物理、化学及生物学等测试用，具有确定的特性或量值，用于校准设备、评价测量方法、给供试药品赋值或鉴别用的物质，应具备稳定性、均匀性和准确
目前在各国药典中，仍有很多采用原位降解技
他唑巴坦（tazobactam）是从舒巴坦的衍生物中筛选出来的一种β-内酰胺酶抑制剂。它可以与数种β-内酰胺类抗生素产生协同作用，增加了β-内酰胺类抗生素的抗菌活性并扩大了其抗菌
他唑巴坦杂质A原料（100 g，色谱纯度98%，河北桑迪亚医药技术有限责任公司）；他唑巴坦对照品（99.5%，批号130511-201904，中国食品药品检定研究院）；他唑巴坦杂质A对照品（定性使用，R089H0，美国药典委员会）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），其他试剂均为市售分析纯，水为超纯水。
根据中国药典（2015年版）二部中他唑巴坦原料药有关物质检查方法所描述的原位降解方法制备系统适用性溶液：取他唑巴坦对照品约25 mg至25 mL量瓶中，加0.01 mol/L氢氧化钠溶液10 mL，30 ℃放置30 min，用0.01 mol/L盐酸溶液中和后，加流动相稀释至刻度，摇匀，用磷酸调节pH至4.0，按照含量测定色谱条件要求［色谱柱：Dikma，Inertsil ODS-2（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；C/N 5020-01128；S/N 8AS11013；流动相：乙腈-0.03 mol/L磷酸二氢钾溶液-10%四丁基氢氧化铵溶液（190∶795∶15）（用磷酸调节pH至4.0）；流速：1.0 mL/min；检测波长：230 nm，进样20 μL，进行HPLC色谱分析，观察产生的主要杂质。
根据产生的主要杂质，采用液相质谱联用技术测定杂质的相对分子质量，推测其可能的结构。25 mL量瓶内他唑巴坦的碱降解溶液用盐酸溶液中和后，用乙腈-水（1∶5）的溶液稀释至刻度。设计的色谱条件如下。色谱柱：Capcell PAK C18 TYPE MGⅡ（4.6 mm×150 mm，5 µm）；检测波长：230 nm；流动相A相：0.1%甲酸水溶液，B相：乙腈；流速：0.5 mL/min；梯度洗脱：0～0.01 min（95∶5）；0.01～5.00 min（95∶5）；5.00～17.00 min（38∶62）；17.00～17.10 min（95∶5）；17.10～22.00 min（95∶5）。
质谱仪型号为6500QTrap；工作站为Analys
取他唑巴坦杂质A原料适量，以乙腈-水（1∶5）为溶剂溶解并稀释成约0.5 mg/mL的溶液，用于质谱分析。质谱仪型号为6500QTrap；工作站为Analys
从制备的2 900瓶样品中随机抽取12瓶样品，每瓶称取2份，每份质量约为10 mg，采用纯度分析的液相色谱条件，以峰面积与对应称样量之比为评价指标，通过瓶间方差和瓶内方差的比较以判断样品的均匀性。如果两者之比小于95%置信水平对应F检验的临界值，则认为样品是均匀的。
考察样品在实验色谱条件下溶液的稳定性，为确定样品的具体实验方案提供依据。目前标准物质原料短期稳定性考察主要是为样品选择合适的运输条件提供依据，为节约运输成本，首先考察了样品在常温（25 ℃）条件下0、 3、 5和10 d的稳定性，每个实验条件考察3支独立样品。
目前美国药典（USP41-NF36）、中国药典二部（2015年版）和日本药典（JP17）均收载了他唑巴坦原料的质量标准，USP与JP色谱条件基本一致。实验中发现他唑巴坦杂质A在酸性溶液中不稳定，容易降解，而中国药典和美国药典他唑巴坦有关物质检查方法中流动相和样品溶剂均偏酸性，因此在其纯度分析时未采用上述药典方法，而是参考文献［
按照中国药典二部中他唑巴坦原料药有关物质检查方法规定的原位降解要求，制备系统适用性试验溶液，其色谱图如
Figure 1 Chromatogram of the system applicability solution under the inspection item of tazobactam API related substances in Part 2 of Chinese Pharmacopoeia 2015
1:Tazobactam; 2: Maximum impurity produced by degradation
Figure 2 Structure of tazobactam impurity A
根据文献［
Scheme 1 Synthetic route of tazobactam impurity A
分别采用红外、质谱和核磁共振波谱对合成的他唑巴坦杂质A的结构进行了确证。
红外光谱（
Figure 3 Infrared absorption spectrum of tazobactam impurity A and tazobactam related compound A contained in USP
1：Tazobactam impurity A；2：Tazobactam related compound A
通过核磁共振波谱进一步确证合成的他唑巴坦杂质A原料的结构。他唑巴坦杂质A原料的氢谱
对均匀性评价指标——24份峰面积与对应称样量之比做F检验，在95%置信范围内，瓶间和瓶内F为0.61，小于F0.05（11，12）（2.79），证明瓶间与瓶内不存在显著性差异，该原料的均匀性良好。
实验中发现，采用中国药典二部（2015年版）他唑巴坦原料有关物质检查的色谱条件，平行实验5份样品，他唑巴坦杂质A面积归一化纯度均值仅为88.1%（RSD=1.96%），与合成公司交付色谱纯度（> 98%）存在较大差异，怀疑样品发生降解。于是结合文献［
本研究对中国药典（2015年版）他唑巴坦质量标准中含量和有关物质检查项使用的原位降解方法得到的系统适用性溶液进行成分分析，确定了其中主要杂质的结构，并根据结构合成制备了该杂质标准物质，若使用该标准物质与他唑巴坦直接配置系统适用性溶液将使得标准操作更加简便易行，同时文献也检索到该杂质为他唑巴坦的降解产物，实验证明其在酸性环境下不稳定，则该标准物质的研制也为下一步提高他唑巴坦质量标准奠定了基础。
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