摘要
为探究绞股蓝总皂苷(GP)对高胆固醇血症的治疗作用及其初步机制,以及对高脂饮食及高剂量辛伐他汀所致肝脏损伤的保护作用,采用高胆固醇饮食喂养金黄仓鼠诱导高胆固醇血症模型对GP进行研究。实验动物金黄仓鼠分为空白组、高胆固醇饮食组、绞股蓝总皂苷低高剂量组(60 mg/kg、120 mg/kg)、辛伐他汀组(10 mg/kg)组,绞股蓝总皂苷与辛伐他汀联用组(120 mg/kg + 10 mg/kg)。通过动态监测药物治疗14 d和23 d的血胆固醇、肝功能等相关指标考察其药效,检测血清中前蛋白转化酶枯草溶菌素/Kexin9型(PCSK9)的分泌量并初步探究作用机制。结果显示,GP能显著降低血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)水平和丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的含量,提高血清高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度,并显著降低PCSK9的分泌量。结果表明,GP对饮食诱导的高胆固醇血症具有较好的调节作用,可能与抑制PCSK9的分泌有关。此外,GP能够有效改善高脂饮食和高剂量辛伐他汀造成的肝脏损伤,为GP与他汀类药物联用起到减毒增效的作用提供了科学依据。
高胆固醇血症是以血清中高水平的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)为特征的常染色体显性遗传性疾病。循环中高水平的LDL-C被认为是动脉粥样硬化性心血管疾病最重要的独立危险因
目前临床上首选他汀类药物治疗高胆固醇血症。但对于家族性高胆固醇血症和心血管疾病风险较高的患者,即便应用双倍剂量的他汀类药物,也仅能使患者血清LDL-C水平进一步降低6%,心血管风险得不到有效控制。高剂量的他汀类药物还可能引起血清转氨酶升高和肝细胞损坏,造成他汀类药物诱导的肝损伤(SILI
已有研究证实,他汀类药物是通过上调胆固醇调节元件结合蛋白-2(SREBP-2)转录激活肝低密度脂蛋白受体(LDLR)的表达,促进血清LDL-C的清除,但同时也激活了前蛋白转化酶枯草溶菌素/Kexin9型(PCSK9)的表达,这可能是限制他汀类药物降LDL-C效果的原
绞股蓝[Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino]是葫芦科绞股蓝属的草本植
因此,本研究采用高胆固醇饮食诱导的金黄仓鼠模型,探究绞股蓝总皂苷对高胆固醇血症的治疗效果,以及对高剂量辛伐他汀所致肝脏损伤的保护作用,并考察其对血清PCSK9水平的影响,以期为绞股蓝总皂苷与他汀类药物联用改善高剂量辛伐他汀使用限制和减轻他汀类药物的肝脏不良反应提供科学依据。
绞股蓝总皂苷(湖南华宝通制药有限公司,批号T20170203,生药出膏率2.4%);辛伐他汀片(美国默沙东医药公司);金黄仓鼠PCSK9蛋白ELISA试剂盒(江苏酶标生物有限公司);三酰甘油(TG)试剂盒、总胆固醇(TC)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒、丙氨酸转氨酶(ALT)试剂盒、天冬氨酸转氨酶(AST)试剂盒、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(南京建成生物工程研究所);肝素钠(北京索莱宝科技有限公司);羧甲基纤维素钠(上海阿拉丁生化科技有限公司)。
多功能微孔板检测仪H1MF(美国BioTek公司);超速控温离心机(美国Beckman Coulter公司);恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司);精密天平(美国Mettler Tolerdo公司);荧光倒置显微镜(德国Carl Zeiss公司);超纯水系统(美国Millipore公司)。
实验开始前动物先适应性饲养1周,然后按体重随机分为7组,每组10只。空白组给予对照饲料,高胆固醇模型组和治疗组均给予高胆固醇饲料。造模17 d后,眼眶取血,测定血清LDL-C、TC、TG、HDL-C以及血清ALT、AST、ALP水平,判断金黄仓鼠高胆固醇血症模型是否成功以及肝功能是否发生损伤。从第18天起,连续给药23 d。空白组(NC)和高胆固醇饮食组(HCD)给予等体积0.3% CMC-Na;绞股蓝总皂苷低、高剂量组(GPL, GPH)给药剂量分别为60、120 mg/(kg·d);阳性药组(SIM)给予辛伐他汀10 mg/(kg·d);GP与SIM联用组(GP+SIM)给药剂量为120 mg/(kg·d)和10 mg/(kg·d)。实验期间,各组金黄仓鼠饲料不变。
试验期间,每周称量并记录体重,观察动物的日常活动、毛发的颜色和顺滑程度及精神状态等。实验最后一周,记录仓鼠摄食量,首先给予预先称好的定量足量的饲料,次日将剩余饲料称重,两次饲料量之差即为每日每只仓鼠的摄食量。
实验第17、31及40天后,禁食12 h后眼眶取血,3 000 r/min离心10 min获取血清样本, 保存于-80 ℃待测。最后一次取血后,用10%水合氯醛麻醉,立刻取出肝脏,称重并拍照。取部分肝脏样本用福尔马林固定,做组织切片,HE染色后观察。剩余样本于-80 ℃留存。
如

Figure 1 Effects of high cholesterol-diet on hypercholesterolemia model of golden hamster ()
A: Level of serum high density lipoprotein cholesterol (HDL-C); B: Level of serum low density lipoprotein cholesterol (LDL-C); C: Level of serum total cholesterol (TC); D: Level of serum triglyceride(TG).NC: Normal control; HCD: High cholesterol diet; GPL: Gypenosides low dose [(60 mg/(kg·d)); GPH: Gypenosides high dose [120 mg/(kg·d)]; SIM: Simvastatins [10 mg/(kg·d)]; GP+SIM: Gypenosides [120 mg/(kg·d)] + simvastatins[10 mg/(kg·d)]
临床上常用血清ALT、AST、ALP作为反映肝功能受损的诊断指标,其中ALT具有较高灵敏度,被一致认为是实验室数据中鉴别肝细胞损伤的金标

Figure 2 Effects of high cholesterol diet on liver function in golden hamster ()
A: Level of serum alanine aminotransferase (ALT); B: Level of serum aspartate aminotransferase (AST); C: Level of serum alkaline phosphatase (ALP)
实验期间,NC组的金黄仓鼠活泼爱动,反应较为灵敏,毛发光滑柔顺,其他组别金黄仓鼠精神状态相对较差,反应相对迟钝,毛发粗糙暗淡。如

Figure 3 Effects of gypenosides on body weight (A) and food intake (B) in hypercholesterolemia golden hamster ()
为更好地验证GP的降胆固醇药效以及改善脂质代谢紊乱的能力,本研究在模型成功后给药的第14天和第23天两个时间节点动态监测了药物对仓鼠血清脂质的影响。
如

Figure 4 Effects of gypenosides on serum lipid levels in hypercholesterolemia golden hamsters after treatment for 14 days (A-D) or for 23 days (E-H) ()
A, E: Level of serum HDL-C; B, F: Level of serum LDL-C; C, G: Level of serum TC; D, H: Level of serum TG
如
如
##P < 0.01 vs NC group
已有文献报道,绞股蓝总皂苷对HFD饮食诱导的NAFL

Figure 5 Effects of Gypenosides on liver function in hypercholesterolemia golden hamsters after treatment for 14 days (A-C) or for 23 days (D-F) ()
A,D: Level of serum ALP; B,E: Level of serum ALT; C,F: Level of serum AST; G: Liver tissues after H&E staining(400X); H: Images of liver organ
各组动物在处死后立即剥离肝脏拍照如
PCSK9分泌入血后对胆固醇的清除起着重要的作

Figure 6 Effects of Gypenosides on PCSK9 protein expression in serum of hypercholesterolemia golden hamsters ()
#P < 0.05 vs NC group
本研究选用人体所用最大限度的SIM剂量折算,模拟高剂量的SIM对肝脏造成的损伤。结果显示,高剂量的SIM显著升高血清ALT、AST、ALP,而GP可显著改善肝功能。
本研究观察到SIM可有效降低仓鼠血清TG含量,但SIM组血清LDL-C、TC水平反升,结合文献报道分析了其中可能的原因:(1)他汀类药物降LDL-C的作用具有很大的物种差
在本研究中,与SIM组相比,GP与SIM联用可明显降低血清LDL-C、TC水平,原因可能是GP能降低血清PCSK9水平并SIM修复诱导的肝损伤。研究结果证实了GP在单独使用和与SIM联用时均能降低血脂,改善肝损伤,为绞股蓝与SIM临床上的联合应用提供了参考和理论基础。
本实验还存在一些不足之处:(1)应将正常剂量与高剂量SIM的作用进行对比从而展开更全面的考察;(2)绞股蓝富含皂苷类成分,其中哪种类型具有较好的抑制PCSK9的活性及调节LDL-C代谢的作用,构效关系如何,仍有待进一步探究。
References
Wong B, Kruse G, Kutikova L, et al. Cardiovascular disease risk associated with familial hypercholesterolemia: a systematic review of the literature[J]. Clin Ther, 2016, 38(7): 1696-1709. [百度学术]
Björnsson E, Jacobsen EI, Kalaitzakis E. Hepatotoxicity associated with statins: reports of idiosyncratic liver injury post-marketing[J]. J Hepatol, 2012, 56(2): 374-380. [百度学术]
Hazen SL. New lipid and lipoprotein targets for the treatment of cardiometabolic diseases[J]. J Lipid Res, 2012, 53(9): 1719-1721. [百度学术]
Chen SK. A classificatory system and geographical distribution of the genus Gynostemma BL[J]. Acta Phytotaxon Sin(植物分类学报), 1995,33(4): 403-410. [百度学术]
Jeenduang N, Sangkaew B, Chantaracha P, et al. APOE and CETP TaqIB polymorphisms influence metabolic responses to Hibiscus sabdariffa L. and Gynostemma pentaphyllum Makino tea consumption in hypercholesterolemic subjects[J]. Asia Pac J Clin Nutr, 2017, 26(2): 368-378. [百度学术]
Zhang YD, Jiang XY, Cao LJ, et al. Gypenoside granules improved lipid metabolism in C57BL/6J mice with hyperlipidemia[J]. J China Pharm Univ(中国药科大学学报), 2019, 50(6): 713-720. [百度学术]
Wu LS, Qian MZ. Effects of gypenosides on PCSK9 gene expression and blood lipids lowered by simvastatin[J]. Chin J Pathol(中华病理学杂志), 2017, 33(1): 79-85. [百度学术]
Shen TT, Hua EB, Ma N, et al. Effects of phlorizin on hepatic cholesterol metabolism genes expression in hamsters fed high fat and cholesterol diet[J]. Acta Nutr Sin(营养学报), 2014, 36(2): 159-163. [百度学术]
Dong B, Wu MH, Li H, et al. Strong induction of PCSK9 gene expression through HNF1α and SREBP2: mechanism for the resistance to LDL-cholesterol lowering effect of statins in dyslipidemic hamsters[J]. J Lipid Res, 2010, 51(6): 1486-1495. [百度学术]
Li HS, Ying H, Hu AR, et al. Therapeutic effect of gypenosides on nonalcoholic steatohepatitis via regulating hepatic lipogenesis and fatty acid oxidation[J]. Biol Pharm Bull, 2017, 40(5): 650-657. [百度学术]
Chen JX. Study on liver-protective effect of total saponins of Gynostemma pentaphyllum[J]. China Pharm(中国药业), 2007, 16(13): 7-8. [百度学术]
Armitage J, Bowman L, Collins R, et al. Effects of simvastatin 40 mg daily on muscle and liver adverse effects in a 5-year randomized placebo-controlled trial in 20, 536 high-risk people[J]. BMC Clin Pharmacol, 2009, 31(9): 6. [百度学术]
Kanasaki A, Jiang Z, Mizokami T, et al. Dietary D-allulose alters cholesterol metabolism in Golden Syrian hamsters partly by reducing serum PCSK9 levels[J]. J Funct Foods, 2019, 60: 103429-103429. [百度学术]
Kang ZY, Chu XX, Yang RM, et al. Study on the biomarkers of cholesterol metabolic disorder in hyperlipemia model of golden hamster[J]. Chin Pharmacol Bull(药学通报), 2014, 30(6): 880-883. [百度学术]
Madsen CS, Janovitz E, Zhang R, et al. The guinea pig as a preclinical model for demonstrating the efficacy and safety of statins[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2008, 324(2): 576-586. [百度学术]
Ito BR, Zhang BH, Cable EE, et al. Thyroid hormone beta receptor activation has additive cholesterol lowering activity in combination with atorvastatin in rabbits, dogs and monkeys[J]. Br J Pharmacol, 2009, 156(3): 454-465. [百度学术]
Pel P, Chae HS, Nhoek P, et al. Chemical constituents with proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 mRNA expression inhibitory activity from dried immature Morus alba fruits[J]. J Agric Food Chem, 2017, 65(26): 5316-5321. [百度学术]